CN114480180B - 一种用于秸秆降解的地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一种用于秸秆降解的地衣芽孢杆菌及其应用。所述地衣芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2019438，能高效降解秸秆纤维，广泛应用于秸秆还田和有机物料的堆肥，显著提高堆肥的腐熟度和肥效。此外，该菌株还能有效促进秸秆的软化，广泛应用于造纸领域。

Description

一种用于秸秆降解的地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株新型地衣芽孢杆菌及其在秸秆有机肥堆肥生产、秸秆软化、秸秆还田中的应用。
背景技术
秸秆是指成熟农作物茎叶的总称，在我国一般指玉米，水稻，高粱，甘蔗等禾本科和豆科植物在收获籽实后的剩余部分。农作物秸秆具有丰富的氮、磷、钾及有机质养分，是中国传统的有机肥料源，但需微生物发酵腐熟后才适合大田使用。农作物秸秆腐熟过程是微生物在好氧或厌氧条件下将秸秆中的有机物分解成为CO2、H2O、NH3以及腐殖质的过程。由于秸秆的组成复杂，秸秆直接还田的方式对于秸秆降解效果并不明显，未腐熟的秸秆还会滋生致病微生物严重影响农作物的生长，降低农作物的出产率。参与发酵腐熟农作物秸秆的微生物种类繁多，包括细菌和多种真核微生物，这些微生物在秸秆的发酵过程中进行着迅速的群落演替，完成秸秆的腐熟过程。利用微生物降解秸秆具有无污染、成本低廉、无需过多专业设备、发酵条件易控制等特点，近年来重新进入人们的视野。
木质纤维素是秸秆的主要成分，是自然界中最丰富的天然有机质来源，是由纤维素、半纤维素、木质素等多糖构成的复杂有机物，它们能够被水解为葡萄糖，木糖等小分子物质，这类物质再通过发酵可用于工业生产。当前，能够产生纤维素酶降解纤维素的菌株主要从自然界中筛选分离获得。真菌，细菌，放线菌都可以产生纤维素酶，不同的菌株所产生的纤维素酶种类不同，目前对于降解秸秆微生物的研究表明，真菌对于秸秆的降解效果更佳。
和真菌所产生的纤维素酶性质不同，细菌所产生的纤维素酶大多是碱性以及中性纤维素酶，细菌产纤维素酶具有比真菌高的耐热性以及耐碱性，这在秸秆高温堆肥中具有重要意义。当下对于产纤维素酶真菌的研究以木霉，曲霉等菌株所产生的酸性纤维素酶为主。蒋琼凤等从腐殖土中筛选得到了产纤维素酶活力高且稳定的真菌。而酸性纤维素酶在碱性条件下酶活性十分低下，稳定性较差，pH适应范围窄，这极大的限制了纤维素酶在工业上的应用。刘森林等从造纸厂碱性淤泥中分离获得产碱性纤维素酶的革兰氏阴性菌LZ-5，经鉴定为弧菌属（Vibriosp.）。
常见的产纤维素酶菌株在常温下酶活性较高，但是在发酵工业中，对温度的要求较高，因此能生产耐热纤维素酶的菌株就有了较高的应用前景。颜霞，柳晓东等从堆腐过程中的双孢菇培养基质中分离出3株产纤维素酶的耐高温放线菌株。传统的产纤维素酶菌株在北方冬季寒冷的气温下酶活性十分低下，这就极大的限制了秸秆降解的效率，而低温纤维素酶较常温纤维素酶作用温度低20-30℃，并且能够降低分解纤维素所需要的能量，这在我国寒冷期较长的北方具有着重大的优势。穆春雷等采用CMC-Na刚果红染色法初筛纤维素降解菌，并且采用低温条件诱导方法，筛选得到了耐低温且产纤维素酶能力较强的菌株。
秸秆作为一种优良的生物质能源，具有极大的应用前景，然而受秸秆自身组成成分的影响，秸秆的利用率并不高，甚至造成巨大的环境污染问题。利用微生物对秸秆降解具有成本低、无污染等优点而受到人们的广泛关注，筛选出更高效降解秸秆的菌株具有重要的现实意义。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种用于秸秆降解的地衣芽孢杆菌及其应用。所述地衣芽孢杆菌能高效降解秸秆纤维，广泛应用于秸秆还田和有机物料的堆肥，显著提高堆肥的腐熟度和肥效。此外，该菌株还能有效促进秸秆的软化，广泛应用于造纸领域。
本发明一方面提供了一种地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌VB376（Bacillus licheniformis VB376），已于2019年6月6日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2019438。
本发明一方面提供了所述地衣芽孢杆菌在秸秆降解中的应用。
本发明一方面提供了所述地衣芽孢杆菌在有机物料堆肥中的应用。
所述的有机物料为作物秸秆或工业副产物。
所述工业副产物为米糠渣、木薯渣、木糖醇渣、糠醛渣、中药渣、芝麻渣中的任意一种。
本发明还提供了所述地衣芽孢杆菌在草浆生产中的应用。
本发明还提供了一种复合微生物制剂，包含上述地衣芽孢杆菌VB376。
所述复合微生物制剂还包含芽孢杆菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌中的任意一种或两种或多种的组合。
所述复合微生物制剂中地衣芽孢杆菌VB376的活菌量至少为108CFU/g。
本发明还提供了上述复合微生物制剂在秸秆还田中的应用。
本发明还提供了上述复合微生物制剂在有机物料堆肥中的应用。
本发明筛选获得的地衣芽孢杆菌VB376菌株对低温条件的耐受性强，在10℃可以正常生长繁殖；能高产内切葡聚糖酶，其发酵上清液中内切葡聚糖酶的酶活高达2.8 U/ml。
所述地衣芽孢杆菌VB376对秸秆具有很强的降解能力，能明显提高秸秆还田的效率，提高秸秆的腐熟度，改善土壤结构，提高土壤肥力。15天模拟还田后，接种地衣芽孢杆菌VB376的处理组玉米秸秆的降解率和腐熟度分别高达53.94%和89.37%，比空白对照组提高了114%和72.7%，同时也极显著高于对照地衣芽孢杆菌处理组。
所述地衣芽孢杆菌VB376能显著促进秸秆软化，达到草浆造纸的软化要求，产生废水少且可直排，可广泛应用于造纸领域。与化学软化剂NaOH对照组相比，添加地衣芽孢杆菌VB376菌粉的处理组小麦秸秆软化后的打浆度提高了26.7%，湿重基本相当，软化效果明显优于化学软化剂，取得了意料不到的技术效果。
所述地衣芽孢杆菌VB376可广泛应用于米糠粉、醋渣、花生壳粉、芝麻渣等有机物料的堆肥，能迅速升高堆肥温度，加快腐熟进程，大大提高堆肥的腐熟度和肥效。与对照组相比，添加地衣芽孢杆菌VB376菌粉的处理组堆肥的最高温度普遍提高了4℃-8℃，最高达76℃，腐熟度普遍提高了23.4%-57.0%，最高达109.40%，堆肥的总养分含量也得到了显著提高，取得了意料不到的技术效果。
本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376可单独，也可与芽孢杆菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌中的任意一种或两种或多种的组合或腐熟接种剂进行复配，广泛应用于秸秆还田，以及小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等种植副产物和木薯渣、木糖醇渣、糠醛渣、中药渣等工业副产物的堆肥，显著提高堆肥的腐熟度和肥效。此外，该菌株还能有效促进秸秆的软化，广泛应用于造纸领域，有助于节能减排，减少环境污染，应用前景广阔。
附图说明
图1为VB376菌株的菌落形态图；
图2为VB376菌株的显微镜观察图；
图3为VB376菌株的MALDI-TOF MS质谱图。
具体实施方式
本发明实施例中选用的设备和试剂可以选自市售任意一种。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。
实施例中使用的培养基配方如下：
富集培养基：蛋白胨10g、酵母粉10g、羧甲基纤维素钠10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、蒸馏水1000mL，115℃灭菌30min；
分离培养基：上述富集培养基中加入15~20g 琼脂粉；
无机盐培养基：硫酸铵1.0g、磷酸氢二钾0.5g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、去离子水1000ml，121℃灭菌15min。
下面结合具体实施方式，对本发明作进一步阐述。
实施例1 菌株筛选
1.1 样品：
采集自烟台蓬莱肉鸡养殖废弃物。
1.2 纤维素降解菌株的初筛：
取1g鸡粪加入到含有99 mL无菌水的培养瓶中，并加入几粒玻璃珠，制成混悬液；取1 mL混悬液接入含有50mL富集培养基的培养瓶中，封口，置于30℃生化培养箱中静置培养3-7d。将富集培养物涂布于分离培养基，30℃培养2d，挑出单菌落进行纯化，然后在分离培养基上继续纯化2～3次。
最终，申请人利用以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源的富集培养基和分离培养基成功分离出三株具有纤维素降解能力的菌株，分别命名为VB372、VB375、VB376。
1.3 秸秆降解菌株的复筛
挑取活化后的菌株VB372、VB375、VB376分别接种于LB液体培养基中，37℃，220r/min培养14h，获得活菌量为108-109CFU/ml的菌液，利用灭菌LB培养基调整到108CFU/ml。
1、初筛菌株对液体环境中秸秆的降解能力评价
将玉米秸秆粉碎成5～10mm小段，80℃烘干至恒重；取10g粉碎烘干后的玉米秸秆置于500ml锥形瓶中，加入100ml无机盐培养基溶液，配制成秸秆—无机盐筛选培养基。
分别将VB372、VB375、VB376菌液按5%的质量比接种至秸秆—无机盐筛选培养基中，以接种等量无菌水为空白对照，在30℃、80rpm 条件下发酵7d；发酵结束后，5000 rpm离心10min，弃上清；将得到的玉米秸秆降解剩余物用无菌蒸馏水反复清洗3次，80℃烘干至恒重，称重m，计算秸秆降解率。具体结果见表1。
降解率（%）=（10-m）/10×100%。
表1 初筛菌株对液体环境中秸秆的降解效果
菌株 CK VB376 VB375 VB372
降解率 5.75% 12.40% 3.77% 6.03%
从表1的结果可以看出，与对照组相比，本发明初筛获得的三株菌中只有VB376菌株能在液体环境中显著促进秸秆的降解，降解率提高了116%。从而说明，VB376菌株能有效突破秸秆原生菌群的生态位屏障，对秸秆的纤维具有很强的降解作用，取得了意料不到的技术效果。
2、初筛菌株对固体环境中秸秆的降解能力评价
将玉米秸秆粉碎成5～20mm小段，80℃烘干至恒重；取20g粉碎烘干后的秸秆置于500ml锥形瓶中，水分调到65%，封口膜封口，备用。
分别将VB372、VB375、VB376菌液按1%的质量比接种到上述秸秆中，以接种等量LB液体培养基为空白对照，在37℃下培养 30d。发酵结束后，将锥形瓶中的玉米秸秆降解剩余物用无菌蒸馏水反复清洗3次，80℃烘干至恒重，称重m，计算降解率。具体结果见表2。
降解率（%）=（20-m）/20×100%。
表2 初筛菌株对固体环境中秸秆的降解效果
菌株 CK VB376 VB375 VB372
降解率 12.43% 25.26% 16.55% 18.64%
从表2的结果可以看出，与对照组相比，本发明初筛获得的三株菌对固体环境中秸秆的降解率均得到显著提高。其中，VB376菌株对秸秆的降解率最高，达25.26%。
综上，本发明筛选获得的VB376菌株对秸秆具有很强的降解能力，效果非常显著。
实施例2 VB376菌株的鉴定
2.1 菌落形态鉴定
VB376菌株的菌落形态如图1所示，菌落呈灰白色，直径3-5mm，菌落边缘粗糙，中间隆起。电镜观察结果如图2所示，VB376菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，孢子囊不膨胀，细胞单生。
2.2 16S rDNA分子鉴定
采用试剂盒提取VB376菌株的基因组。然后以该基因组为模板，利用特异性引物对其16S rDNA进行扩增。将扩增得到的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并送测序公司进行测序。
测序结果显示，PCR扩增产物的序列为SEQ ID NO:1。通过将该序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的相似性最高。因此，初步确定VB376菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。
SEQ ID NO:1如下所示：
caagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgattgaaccgcatggttcaattataaaaggtggcttttagctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccag。
2.3 MALDI-TOF-MS蛋白质谱鉴定
取少量VB376单菌落以薄膜的形式涂布于靶板上；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的裂解液，室温下自然晾干；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干；将样品靶放入质谱仪进行鉴定。鉴定结果显示，VB376菌株为地衣芽孢杆菌，其蛋白质谱峰图如图3所示。
2.4 生理生化特性鉴定
VB376菌株的生理生化特性如表3所示。
表3 VB376菌株的生理生化特性
试剂条对应管/底物 阳性/阴性 试剂条对应管/底物 阳性/阴性
0 对照 - 25 七 叶 灵 +
1 甘油 + 26 柳醇 +
2 赤癣醇 - 27 纤维二糖 +
3 D-阿拉伯糖 - 28 麦芽糖 +
4 L-阿拉伯糖 + 29 乳糖 -
5 核糖 + 30 蜜 二 糖 -
6 D-木糖 + 31 蔗糖 +
7 L-木糖 - 32 海藻糖 +
8 阿东醇 - 33 菊糖 -
9β-甲基-D-木糖甙 - 34 松叁糖 -
10 半乳糖 + 35 棉子糖 -
11 葡萄糖 + 36 淀粉 +
12 果糖 + 37 糖原 +
13 甘露糖 + 38 木糖醇 -
14 山梨糖 - 39 拢牛儿糖 +
15 鼠李糖 + 40 D-松二糖 +
16 卫茅醇 - 41 D-来苏糖 -
17 肌 醇 + 42 D-塔格糖 +
18 甘露醇 + 43 D-岩糖 -
19 山梨醇 + 44 L-岩糖 -
20 α-甲基-D-甘露糖甙 - 45 D-阿拉伯糖醇 -
21 α-甲基-D-葡萄糖甙 + 46 L-阿拉伯糖醇 -
22 N-乙酰-葡糖胺 + 47 葡萄糖酸盐 +
23 苦杏仁甙 + 48 2-酮基-葡萄糖酸盐 -
24 熊 果 甙 + 49 5-酮基-葡萄糖酸盐 -
淀粉酶 W 蛋白酶 +
+：阳性反应； -：阴性反应。
申请人利用16S rDNA测序和MALDI-TOF-MS蛋白质谱鉴定系统两种分子生物学手段对VB376菌株进行鉴定，鉴定结果一致。再结合VB376菌株的菌落形态和生理生化特征，申请人确定该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），命名为地衣芽孢杆菌VB376（Bacillus licheniformis VB376）。
申请人已于2019年6月6日将上述地衣芽孢杆菌VB376（Bacillus licheniformis VB376）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019438。
实施例3 地衣芽孢杆菌VB376产酶能力和耐低温性能评价
1、菌液的制备
将活化后的地衣芽孢杆菌VB376接种到LB液体培养基中，37℃，220rpm培养14h，获得活菌量为108-109CFU/ml的菌液，利用灭菌LB培养基调整到108CFU/ml。
2、产纤维素酶能力评价
将地衣芽孢杆菌VB376菌液点接到分离培养基上，37℃培养48h，可以看到地衣芽孢杆菌VB376周围有透明圈产生，透明圈直径为18 mm。从而说明，地衣芽孢杆菌VB376可以产生一定的纤维素酶。
3、产内切葡聚糖酶的能力评价
将地衣芽孢杆菌VB376菌液在4℃、12000rpm条件下离心10min，检测上清液中内切葡聚糖酶的酶活为2.8 U/ml。
（1）酶活定义
在一定条件下，每分钟水解底物，生成等同于1微摩尔还原糖的酶量，被定义为1个单位。
（2）内切葡聚糖酶酶活测定方法
吸取0.5mL待测酶液于16×120mm的试管中，40℃预热5min；加入一片底物于酶液中，不要震荡，40℃反应10min；加入10mL Trizma Base终止液，涡旋振荡；在室温中放置5min，再次涡旋振荡；用whatman 1号滤纸过滤，直径9cm； 590nm下测比色。
空白：将底物加入0.5mL浸提缓冲液中，其余与样品反应一致，每一批次反应只需要只做1个空白。
（3）酶活计算
标准曲线：
pH5.0：mU/mL= 3.3×Abs.+0.04；
pH6.5：mU/mL= 7×Abs.+0.25；
pH4.5：mU/mL= 4.1×Abs.+0.7。
酶活：U=Y×（1/1000）×2×n。
其中：
Y—酶活mU；
1/1000—mU到U的转换系数；
2—0.5mL到1.0mL的转换系数；
n—稀释倍数。
4、产淀粉酶能力评价
将地衣芽孢杆菌VB376菌液点接到含有淀粉的琼脂培养基上，37℃培养48h，可以看到地衣芽孢杆菌VB376周围有透明圈产生，透明圈直径为16 mm。从而说明，地衣芽孢杆菌VB376可以产生一定的淀粉酶。
5、产蛋白酶能力评价
将地衣芽孢杆菌VB376菌液点接到含有脱脂奶粉的琼脂培养基上，37℃培养48h，可以看到地衣芽孢杆菌VB376周围有透明圈产生，透明圈直径为20 mm。从而说明，地衣芽孢杆菌VB376可以产生一定的蛋白酶。
6、耐低温性能评价
将地衣芽孢杆菌VB376菌液点接到营养琼脂培养基上，10℃条件下培养3d，能观察到有菌落生长。从而说明，地衣芽孢杆菌VB376在10℃可以正常生长繁殖，对低温条件的耐受性强。
实施例4 地衣芽孢杆菌VB376在模拟秸秆还田实验中的降解效果评价
1、秸秆的预处理
将玉米秸秆粉碎成10mm～50mm小段，测定其水分含量为a。取100g粉碎后的玉米秸秆置于网兜中，备用。
2、秸秆还田降解实验
（1）处理组：将地衣芽孢杆菌VB376菌液（108CFU/ml）按照1%的质量比接种到玉米秸秆中，混合均匀；
（2）空白对照组：接种等量的LB液体培养基；
（3）处理对照组：接种等量的地衣芽孢杆菌CGMCC 1.6510（108CFU/ml）、地衣芽孢杆菌CGMCC 1.10314（108CFU/ml）。
每个处理和对照做三个重复。将处理后的玉米秸秆埋于土壤下30cm处，腐熟15天后取出。将各组的玉米秸秆降解剩余物用定量无菌蒸馏水反复清洗3次，80℃烘干至恒重，称重m，计算降解率。
降解率 =[100（1-a）-m]/100(1-a)×100%。
处理组和对照组玉米秸秆的平均降解率见表4。
表4 地衣芽孢杆菌VB376对玉米秸秆的降解效果
菌株 CK 地衣芽孢杆菌VB376 地衣芽孢杆菌CGMCC 1.6510 地衣芽孢杆菌CGMCC 1.10314
降解率 24.95% 53.49% 29.44% 25.94%
从表4的结果可以看出，15天模拟还田后，接种地衣芽孢杆菌VB376的处理组玉米秸秆的降解率高达53.94%，比空白对照组提高了114%，同时也极显著高于对照地衣芽孢杆菌处理组。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376能显著促进玉米秸秆的降解，取得了意料不到的效果。
3、腐熟度检测
腐熟度即为腐熟程度，指堆肥中有机物经矿化、腐殖化过程后达到稳定的程度。
根据有机肥料NY/T525-2021新标准，发芽指数（GI）检测指标用来评价有机肥料的腐熟度，且指数要≥70%。发芽指数越高表示腐熟物料对作物根系的毒力越小，超过100%表示毒素完全降解、表现为促进根系生长。
GI的测定方法如下：
称取上述腐熟15天后的玉米秸秆样品10g，加100mL蒸馏水，200rpm，25℃条件下振荡30min；取滤液5mL，加到铺有滤纸的9cm培养皿内；每皿点播10粒饱满的黄瓜种子，28℃恒温恒湿避光培养72 h，同时以蒸馏水作对照，重复3次。分别统计各组黄瓜种子的发芽率和种子根长，计算腐熟度（发芽指数）。
GI=（试验组的发芽率×种子根长）/（对照组的发芽率×种子根长）×100%。
处理组和对照组玉米秸秆的平均腐熟度见表5。
表5 地衣芽孢杆菌VB376对玉米秸秆腐熟度的影响
菌株 CK 地衣芽孢杆菌VB376 地衣芽孢杆菌CGMCC 1.6510 地衣芽孢杆菌CGMCC 1.10314
腐熟度 51.74% 89.37% 69.18 % 55.07%
从表5的结果可以看出，15天模拟还田后，接种地衣芽孢杆菌VB376的处理组玉米秸秆的腐熟度高达89.37%，远超有机肥料新标准的规定，比空白对照组提高了72.7%，同时也极显著高于对照地衣芽孢杆菌处理组。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376能明显提高还田玉米秸秆的腐熟度，有利于改善土壤结构，增加土壤有机质的含量，还可以提高植物的抗逆性和农产品的品质，取得了意料不到的效果。
实施例5 地衣芽孢杆菌VB376在秸秆还田中的应用
1、 实验地点：山东省寿光市古城街道蔬菜种植大棚。
2、秸秆的预处理
将种植大棚内的番茄秸秆打碎，旋耕进土壤30cm。在每个实验区内采用五点取样法，按照东、西、南、北、中五个方位，各取1kg土壤，分离秸秆，水洗干净，烘干称重m1。
3、秸秆还田实验：
（1）空白对照组：无任何处理；
（2）VB376菌粉处理组：按3kg/亩施用地衣芽孢杆菌VB376菌粉（100亿cfu/g）随大水漫灌。
30天后，在每个实验区采用五点取样法，各取1kg土壤，分离秸秆，水洗干净，烘干称重m2。计算秸秆降解率。具体结果见表6。
秸秆降解率=（m1- m2）/m1×100%。
表6 地衣芽孢杆菌VB376对秸秆的降解效果
菌株 CK 地衣芽孢杆菌VB376
降解率 29.66% 52.27%
从表6的数据可知，还田30天后，施用地衣芽孢杆菌VB376菌粉的处理组番茄秸秆的降解率高达52.27%，较对照组提高了76%，效果非常显著。
秸秆还田后，分别在上述实验区种植了下一茬作物----生菜。结果显示，施用地衣芽孢杆菌VB376菌粉的处理组实验区种植的生菜叶片大，颜色深，层数更丰富，抗逆性更强，产量比对照组提高了12%。
上述结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376能显著促进还田秸秆的降解，有助于增加土壤有机质，改良土壤结构，提升土壤肥力，取得了意料不到的效果。
实施例6 地衣芽孢杆菌VB376对秸秆的软化能力评价
1、秸秆的预处理
将小麦秸秆粉碎成5cm小段，80℃烘干至恒重。取20g粉碎后的小麦秸秆置于500ml锥形瓶中，水分调到65%，封口膜封口，备用。
2、秸秆软化实验
（1）处理组：将地衣芽孢杆菌VB376菌液（108CFU/ml）按照1.5%的质量比接种到小麦秸秆中，混合均匀；
（2）空白对照组：接种等量的LB液体培养基；
（3）处理对照组：接种等量的地衣芽孢杆菌CGMCC 1.6510（108CFU/ml）、地衣芽孢杆菌CGMCC 1.10314（108CFU/ml）。
每个处理和对照做6个重复。将处理后的小麦秸秆在37℃条件下放置7d。结束后，将各组的小麦秸秆降解剩余物用无菌蒸馏水反复清洗3次，80℃烘干至恒重，称重m，计算降解率。
降解率 =(20-m)/20×100%。
将上述各组清洗烘干后的小麦秸秆降解剩余物进行磨浆，利用打浆度仪检测打浆度。
处理组和对照组小麦秸秆的平均降解率和打浆度见表7。
表7 地衣芽孢杆菌VB376对小麦秸秆降解和软化的效果
菌株 CK 地衣芽孢杆菌VB376 地衣芽孢杆菌CGMCC 1.6510 地衣芽孢杆菌CGMCC 1.10314
降解率 32.13% 44.25% 40.50% 38.77%
打浆度 14°SR 34°SR 28°SR 25°SR
从表7的结果可以看出，接种地衣芽孢杆菌VB376的处理组小麦秸秆的降解率高达44.25%，比空白对照组提高了38%，同时也显著高于对照地衣芽孢杆菌处理组；而且处理组小麦秸秆的打浆度比对照地衣芽孢杆菌处理组提高了21%-36%。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376能显著促进小麦秸秆的降解和软化，达到草浆造纸的软化要求，取得了意料不到的技术效果。
实施例7 地衣芽孢杆菌VB376在小麦秸秆软化中的应用
1、秸秆的预处理
将4吨小麦秸秆浸水处理，分成四个堆体，1吨小麦秸秆备用。
2、秸秆软化实验
（1）实验地点：山东省聊城市高唐泉林纸业堆肥车间。
（2）实验设计：
将地衣芽孢杆菌VB376菌粉用麸皮或秸秆粉分别稀释成3亿cfu/g，6亿cfu/g，12亿cfu/g三种剂量；将稀释后的菌粉分别加入到小麦秸秆发酵堆体，每个处理对应一个堆体。
化学软化剂对照组：1吨小麦秸秆浸入质量体积比为40%的NaOH溶液中处理30min，进行打浆，测定湿重和打浆度；
空白对照组：无任何处理；
处理组1：添加3亿cfu/g VB376菌粉 10kg；
处理组2：添加6亿cfu/g VB376菌粉 10kg；
处理组3：添加12亿cfu/g VB376菌粉 10kg。
空白对照组和处理组按常规方法堆置发酵，发酵天数为6天。每个堆体取6个点，每天固定时间各测定一次堆体的温度，然后求平均值，具体结果见表8。
软化结束后，将各组小麦秸秆进行打浆，分别测定湿重和打浆度，具体结果见表8。
表8 地衣芽孢杆菌VB376在小麦秸秆软化中的效果
从表8的数据可以看出，与空白对照组相比，添加地衣芽孢杆菌VB376菌粉的处理组堆体升温较快，在软化第2天温度即超过70℃。整个软化过程中，处理组堆体的最高温度均超过75℃，尤其是处理组3堆体温度最高达到76℃，显著高于对照组（72℃）。而且VB376菌粉处理组堆体70℃以上的高温期持续时间比空白对照组多了1天。
随着地衣芽孢杆菌VB376菌粉添加量的增加，处理组小麦秸秆软化后的打浆度明显提高，湿重明显下降。其中，处理组3的打浆度比化学软化剂NaOH对照组提高了26.7%，湿重基本相当，软化效果明显优于化学软化剂。从而说明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376能显著促进秸秆的降解和软化，产生废水少且可直排，可广泛应用于造纸领域，取得了意料不到的技术效果。
实施例8 地衣芽孢杆菌VB376在米糠粉堆肥中的应用
1、地衣芽孢杆菌VB376菌粉制备
将地衣芽孢杆菌VB376在5吨发酵罐中进行液体发酵，当镜检芽孢率达到90%以上时停止发酵；5000rpm离心10min，去除发酵上清液，将菌泥进行喷雾干燥，制得活菌量为100亿/g的菌粉。
2、堆肥物料搭配
将40吨米糠粉与30吨水充分混合，做成宽2.5米，高1米的梯形发酵堆体四条，备用。
3、堆肥过程
（1）实验地点：山东省临沂市明英工贸发酵车间。
（2）实验设计：
将地衣芽孢杆菌VB376菌粉用麸皮或秸秆粉分别稀释成3亿cfu/g，6亿cfu/g，12亿cfu/g三种剂量；将稀释后的菌粉分别加入到米糠粉发酵堆体，每个处理对应一个堆体。
空白对照组：无任何处理；
处理组1：添加3亿cfu/g VB376菌粉 18kg；
处理组2：添加6亿cfu/g VB376菌粉 18kg；
处理组3：添加12亿cfu/g VB376菌粉 18kg。
按常规方法堆置发酵，发酵过程中每3天翻堆一次，发酵天数为18天。
从堆肥开始，每个堆体取6个点，每三天固定时间各测定一次堆体的温度，然后求平均值，其中测温的深度选择30-40cm。具体结果见表9。
堆肥结束后，按照有机肥料NY/T525-2021的规定对腐熟物料的堆肥指标进行化验，具体结果见表10。
表9 堆肥过程中堆体的温度变化
表10 堆肥指标化验结果
处理 总养分（氮磷钾） 有机质 腐熟度（GI）
CK 2.45% 63% 43.64%
处理组1 2.47% 58% 50.37%
处理组2 2.51% 58% 66.79%
处理组3 2.71% 57% 68.50%
从表9的数据可知，与空白对照组相比，添加地衣芽孢杆菌VB376菌粉的处理组堆体升温较快，在堆肥第3天温度即超过55℃。整个堆肥过程中，处理组堆体的最高温度均超过70℃，尤其是处理组2和3堆体温度最高达到72℃，显著高于对照组（68℃）。而且VB376菌粉处理组堆体的高温期持续时间比空白对照组多了3天。
从表10的数据可以看出，随着地衣芽孢杆菌VB376菌粉添加量的增加，处理组堆肥中总养分含量和腐熟度明显提高，有机质含量明显下降。其中，处理组3堆肥中总养分含量和腐熟度比对照组提高了10.6%和57.0%，有机质含量下降了9.5%，取得了意料不到的技术效果。
上述结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376能够迅速升高堆肥温度，高温期持续时间更长，能快速杀灭堆肥中的病原微生物，加快腐熟进程；同时该菌株能有效减少对氮源的消耗，增加对有机质的利用率，大大提高了堆肥的腐熟度和肥效，效果非常显著。
实施例9 地衣芽孢杆菌VB376与腐熟接种剂搭配在花生壳粉和芝麻渣堆肥中应用
1、 实验地点：山东省烟台莱阳市烟台三和生物发酵车间。
2、堆肥物料搭配：
将400吨花生壳粉与100吨芝麻渣混合均匀，加水调水分至50%，做成宽2.5米，高1米，长60米的梯形发酵堆体四条，备用。
3、堆肥实验：
将地衣芽孢杆菌VB376菌粉用麸皮或秸秆粉分别稀释成3亿cfu/g，6亿cfu/g，12亿cfu/g三种剂量；将稀释后的菌粉分别加入到上述发酵堆体，每个处理对应一个堆体。
（1）对照组：添加腐熟接种剂50kg，不添加VB376菌粉；
（2）处理组1：添加腐熟接种剂50kg，3亿cfu/g VB376菌粉12kg；
（3）处理组2：添加腐熟接种剂50kg，6亿cfu/g VB376菌粉12kg；
（4）处理组3：添加腐熟接种剂50kg，12亿cfu/g VB376菌粉12kg。
按常规方法堆置发酵，发酵过程中每3天翻堆一次，发酵天数为24天。
从堆肥开始，每个堆体取6个点，每4天固定时间各测定一次堆体的温度，然后求平均值，其中测温的深度选择30-40cm。具体结果见表11。
堆肥结束后，按照有机肥料NY/T525-2021的规定对腐熟物料的堆肥指标进行化验，具体结果见表12。
表11 堆肥过程中堆体的温度变化
表12 堆肥指标化验结果
处理 总养分（氮磷钾） 有机质 腐熟度（GI）
CK 8.83% 54% 63.83%
处理组1 9.13% 51% 70.56%
处理组2 9.17% 51% 75.58%
处理组3 9.21% 50% 81.07%
从表11的数据可知，与对照组相比，同时添加腐熟接种剂和地衣芽孢杆菌VB376菌粉的处理组堆体升温较快，在堆肥第4天温度即超过61℃。整个堆肥过程中，处理组堆体的最高温度均超过70℃，尤其是处理组3堆体温度最高达到76℃，显著高于对照组（68℃）。而且VB376菌粉处理组堆体的高温期持续时间比对照组多了4天。
从表12的数据可知，随着地衣芽孢杆菌VB376菌粉添加量的增加，处理组堆肥中总养分含量和腐熟度明显提高，有机质含量明显下降。其中，处理组3堆肥的腐熟度高达81.07%，比对照组提高了27.0%，效果非常显著。
上述结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376与腐熟接种剂配合使用能够迅速升高堆肥温度，高温期持续时间更长，大大提高了堆肥的腐熟度和肥效，腐熟效果明显优于单独使用腐熟接种剂，取得了意料不到的技术效果。
实施例12 地衣芽孢杆菌VB376与腐熟接种剂搭配在醋渣堆肥中应用
1、实验地点：山东省烟台莱阳市烟台三和生物发酵车间。
2、堆肥物料搭配：
纯醋渣10吨，做成宽2.5米，高1米的梯形发酵堆体2条，备用。
3、堆肥实验：
（1）对照组：添加腐熟接种剂1kg，不添加VB376菌粉；
（2）处理组：添加腐熟接种剂1kg，6亿cfu/g VB376菌粉1kg。
每个处理对应一个堆体，按常规方法堆置发酵，发酵过程中每3天翻堆一次，发酵天数为24天。
从堆肥开始，每个堆体取6个点，每4天固定时间各测定一次堆体的温度，然后求平均值，其中测温的深度选择30-40cm。具体结果见表13。
堆肥结束后，按照有机肥料NY/T525-2021的规定对腐熟物料的堆肥指标进行化验，具体结果见表14。
表13 堆肥过程中堆体的温度变化
表14 堆肥指标化验结果
处理 总养分（氮磷钾） 有机质 腐熟度（GI）
CK 2.76% 65% 88.68%
处理组 2.88% 60% 109.40%
从表13的数据可知，与对照组相比，同时添加腐熟接种剂和地衣芽孢杆菌VB376菌粉的处理组堆体升温较快，在堆肥第4天温度即达到65℃。整个堆肥过程中，处理组堆体的最高温度均超过71℃，显著高于对照组（66℃）。
从表14的数据可知，同时添加腐熟接种剂和地衣芽孢杆菌VB376菌粉的处理组堆肥中总养分含量和腐熟度明显提高，有机质含量明显下降。其中，处理组堆肥的腐熟度比对照组提高了23.4%，高达109.40%，说明处理组堆肥中对作物根系有毒害的物质基本降解完全了，表现为促进根系生长，取得了意料不到的效果。
上述结果表明，本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376与腐熟接种剂配合使用能够迅速升高醋渣堆肥温度，提高堆肥的腐熟度和肥效，腐熟效果明显优于单独使用腐熟接种剂，取得了意料不到的技术效果。
综上所述，本发明提供的地衣芽孢杆菌VB376可单独，也可与芽孢杆菌、曲霉菌、酵母菌、乳酸菌中的任意一种或两种或多种的组合或腐熟接种剂进行复配，广泛应用于秸秆还田，以及小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆等种植副产物和木薯渣、木糖醇渣、糠醛渣、中药渣等工业副产物的堆肥，显著提高堆肥的腐熟度和肥效。此外，该菌株还能有效促进秸秆的软化，广泛应用于造纸领域，有助于节能减排，减少环境污染，应用前景广阔。
序列表
<110> 山东蔚蓝生物科技有限公司
山东康地恩生物科技有限公司
<120> 一种用于秸秆降解的地衣芽孢杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1412
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 1
caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60
acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct aataccggat 120
gcttgattga accgcatggt tcaattataa aaggtggctt ttagctacca cttacagatg 180
gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc 240
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 300
gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg 360
atgaaggttt tcggatcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag 420
ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 480
gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt 540
ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga 600
acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag 720
cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa 780
gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagcaaacgc attaagcact ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaac 960
cctagagata gggcttcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080
cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140
gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tgggcagaac 1200
aaagggcagc gaagccgcga ggctaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg 1260
cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320
ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380
ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttggagcc ag 1412

Claims (9)

1.一种地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），其特征在于，所述的地衣芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2019438。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在秸秆降解中的应用。
3.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在草浆生产中的应用。
4.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌在有机物料堆肥中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的有机物料为作物秸秆或工业副产物。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的工业副产物为米糠渣、木薯渣、木糖醇渣、糠醛渣、中药渣、芝麻渣中的任意一种。
7.一种复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂包含权利要求1所述的地衣芽孢杆菌。
8.如权利要求7所述的复合微生物制剂，其特征在于，所述复合微生物制剂中地衣芽孢杆菌的活菌量至少为108CFU/g。
9.权利要求7或8所述的复合微生物制剂在秸秆还田或有机物料堆肥中的应用。
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Purification, characterization and end product analysis of dextran degrading endodextranase from Bacillus licheniformis KIBGE-IB25.《Internationla Journal of Biological Macromolecules》.2015,全文. *

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