CN111518731B - 一株具有拮抗作用低温降解纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有拮抗作用低温降解纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有拮抗作用低温降解纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用，属于生物技术领域。该枯草芽孢杆菌具有多种抑菌活性，尤其针对油菜菌核病菌和马铃薯疮痂病菌，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年01月09日，保藏编号为CGMCC No.19320，该枯草芽孢杆菌GN19的16S rDNA序列长度为1482bp，其序列如SEQ ID NO.1所示。

Description

一株具有拮抗作用低温降解纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株具有拮抗作用低温降解纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术
我国是一个农业生产大国，随着粮食产量的大幅提高，也伴随产生了大量的农业固体废弃物，其中产量最大的农业固体废弃物就是秸秆。虽然有多重秸秆资源化利用的方式，但是大部分地区对秸秆的利用率仍然很低。因此大量秸秆的随意丢弃在一定程度上已经造成了较为严重的资源浪费及经济损失。同时，秸秆在燃烧时，会产生大量的污染气体，一旦进入大气，就会造成严重的大气污染，这一污染现阶段也是我国农业面源污染的重要来源。合理地利用秸秆内大量可利用的资源(纤维素、蛋白质、矿物质钙、磷等)成为了秸秆资源化利用的主要方向。秸秆还田是秸秆肥料化利用的主要方式，但在自然条件下堆肥，存在秸秆腐解速度慢等问题，尤其在东北地区低温时，腐解效果更差。
秸秆有着很特殊及复杂的结构，秸秆内纤维素及半纤维素反复缠绕，所以一般的物理、化学方法很难将其降解。生物法可以较高效的利用秸秆资源，生物法是利用微生物产生的纤维素酶有针对性的降解秸秆内的木质纤维素，它相较于物理法有较高的效率，相较于化学法可避免化学试剂使用造成的环境污染，是一种相对高效环保的方法，但运用生物法的关键是要获取有效的微生物。
微生物制成的秸秆腐熟剂的主要作用是进一步加快秸秆等废弃物腐熟程度，使得秸秆中各类有机质能进行有效转换，转为P、K等植物生长过程中所必须的营养物质，还能产生较多微生物，对土壤基本土质进行改善，抵抗病原微生物，全面提升植物原有的抗逆性，能对农作物生长品质进行改善，推动现代化农业长远发展。
目前枯草芽孢杆菌的筛选及酶活测定多为常温菌株，低温时具有纤维素酶活性的枯草芽孢杆菌较少。枯草芽孢杆菌多被发现可以拮抗病原菌，但拮抗广谱性及拮抗能力不同。
秸秆腐熟剂种类较多，各类秸秆腐熟剂所选取的菌株类别有所不同。有部分研究秸秆腐熟剂中添加了枯草芽孢杆菌，并且枯草芽孢杆菌所占的比例不同。枯草芽孢杆菌的纤维素酶等酶活性有所不同，降解纤维素能力不同。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一株具有拮抗作用低温降解纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株为低温菌株，低温时具有纤维素酶活性，同时可以对多种致病菌都具有拮抗能力。
本发明中具有多种抑菌活性的枯草芽孢杆菌GN19为革兰氏阳性菌，棒状，细胞大小为长2.0-3.0μm，有鞭毛，有菌膜，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上培养，菌落呈圆形，颜色为乳白色。
本发明中的枯草芽孢杆菌为兼性厌氧菌，淀粉水解试验呈阳性，明胶液化试验呈阳性，吲哚试验呈阳性，V-P试验呈阳性，葡萄糖产酸试验呈阳性。
本发明中的枯草芽孢杆菌GN19通过16S rDNA序列比对分析，其与Bacillussp.KBS0812菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似度为100％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定枯草芽孢杆菌GN19属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
本发明中的枯草芽孢杆菌GN19可在牛肉膏蛋白胨培养基上生长，枯草芽孢杆菌GN19的最适生长温度为35℃，最适合生长环境的pH值为6.8-7.6，最适盐浓度为2％。该枯草芽孢杆菌GN19对多种致病菌都具有拮抗作用。
枯草芽孢杆菌GN19的16Sr DNA序列长度为1482bp，其序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GN19属于芽孢杆菌属(Bacillus)，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年01月09日，保藏编号为CGMCC No.19320，分类学命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
附图说明
图1为实施例1中刚果红染色结果。
图2为实施例1中滤纸条降解结果。
图3为本发明枯草芽孢杆菌GN19和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树。
具体实施方式
实施例1
本发明中涉及的枯草芽孢杆菌的筛选及鉴定过程如下：
1.菌株的筛选
在堆放的秸秆堆中取秸秆，用无菌水冲洗表面，将冲洗后的液体涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，于15℃进行培养。
2.纤维素降解菌株的初筛
(1)刚果红染色：采用点接种法分别将牛肉膏蛋白胨培养基上的菌株接种至羧甲基纤维素钠平板上，每个平板接3个点，15℃培养3d后，用1mg/mL的刚果红染液染色30min，弃去染液，加入1mol/L的NaCl溶液脱色20min。观察菌株菌落附近有无水解圈，若有则表示该菌株具有降解纤维素的能力，并记录水解圈和菌落的大小，结果如图1所示，挑选透明圈直径较大且生长迅速的菌株进行下一步试验。
(2)滤纸条降解：用无菌水将所获得的具有高纤维素酶活性的菌株斜面培养物分别制成菌悬液，分别接种3mL于装有100mL滤纸条崩解培养基的250mL三角瓶中，接入无菌水的三角瓶作为对照，15℃，130r/min摇床培养，定期观察滤纸条崩解情况。(+)滤纸边缘膨胀；(++)滤纸整齐膨胀并下弯；(+++)滤纸不定形，断裂；(++++)全成糊状。
通过上述初筛，筛选出一株滤纸溃烂显著的菌株，并命名为GN19，其滤纸条降解结果如图2所示。
3.菌株鉴定
(1)挑去芽孢杆菌单个菌落接种于LB液体培养基中，于恒温37℃振荡培养过夜，取2ml菌液5000r/min离心5min，收集菌体，利用细菌基因组试剂盒提取基因组后，利用细菌16S rDNA的通用引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒纯化PCR产物，之后进行克隆、转化，筛选阳性克隆的菌落，经扩大培养后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
枯草芽孢杆菌GN19的16S rDNA序列长度为1482bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，将测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件构建系统发育树(如图3所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与Bacillus sp.KBS0812菌株的16S rDNA序列的同源性最高，相似度为100％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定枯草芽孢杆菌GN19属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
(2)菌株GN19生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》对筛选出的菌株GN19进行生理生化鉴定，结果如表1所示。
表1菌株GN19生理生化特征鉴定结果
Figure BDA0002491885490000031
Figure BDA0002491885490000041
由上表可知，菌株GN19生理生化特征符合枯草芽孢杆菌的生理生化特性。
实施例2
本实施例对GN19进行纤维素酶活性测定，过程如下：
将初筛菌株接入种子培养基中，15℃，150r/min条件下培养12h得到种子液。将种子液按2％接种至100mL液体发酵培养基，同一条件培养72h。所得发酵液于4℃、10000r/min条件下高速离心15min，收集上清即为粗酶液。
(1)内切葡聚糖酶活力：取4支试管，1支为对照，3支为试验管，分别加入1.5mL的1％CMC-Na溶液，向试管中加入0.5mL粗酶液，其中对照中加入2mL DNS以钝化酶活性，50℃反应30min。反应结束后，向3支试验管中加入2mL DNS以终止反应，摇匀后沸水浴10min，用蒸馏水定容至20mL，混匀，在540nm波长下测定吸光值。根据每次测定的葡萄糖量，计算出相应的酶活力。
(2)外切葡聚糖酶活力：取4支试管，1支对照，3支为试验管，分别加入1.5mL的0.05mol/LpH4.8的柠檬酸缓冲溶液及50mg脱脂棉，向试管中加入0.5mL粗酶液，其中对照中加入2mL DNS以钝化酶活性，50℃反应30min。反应结束后，向3支试验管中加入2mL DNS以终止反应，摇匀后沸水浴10min，用蒸馏水定容至20mL，混匀。在540nm波长下测定吸光值。根据每次测定的葡萄糖量，计算出相应的酶活力。
(3)β-葡聚糖苷酶活力：取4支试管，1支为对照，3支为试验管，分别加入1.5mL的1％水杨苷溶液，向试管中加入0.5mL粗酶液，其中对照中加入2mL DNS以钝化酶活性，50℃反应30min。反应结束后，向3支试验管中加入2mL DNS以终止反应，摇匀后沸水浴10min，蒸馏水定容至20mL，混匀。在540nm波长下测定吸光值。根据每次测定的葡萄糖量，计算出相应的酶活力。
(4)滤纸酶活力：取4支试管，1支为对照，3支为试验管，分别加入1.5mL的0.05mol/L pH4.8的柠檬酸缓冲液及0.5g无淀粉滤纸条(1cm×6cm)，50℃预热5min，取出后快速向试管中分别加入0.5mL稀释后的粗酶液，对照中加入2mL DNS以钝化酶活性，充分摇匀后50℃反应30min。反应结束后，向3支试验管中加入2mL DNS以终止反应，摇匀后沸水浴10min，蒸馏水定容至20mL，混匀。在540nm波长下测定吸光值。根据每次测定的葡萄糖量，计算出相应的酶活力。
以上各种酶活的检测结果如表2所示。
表2枯草芽孢杆菌GN19纤维素酶酶活
酶活
内切葡聚糖酶活力(U/mL) 19.47
外切葡聚糖酶活力(U/mL) 16.25
β-葡聚糖苷酶活力(U/mL) 9.12
滤纸酶活力(U/mL) 19.1
实施例3
本实施例对GN19菌株进行拮抗试验，过程如下：
在PDA固体培养基中心接种植物病原菌菌饼，在距离病原菌饼2cm处用牙签点接枯草芽孢杆菌GN19，直接接种病原菌饼为对照，28℃恒温培养3到7天，测量菌落半径，计算抑菌率，结果如表3所示，以另一枯草芽孢杆菌DN5作为对比。
抑菌率＝[(对照菌落半径－处理菌落半径)/对照菌落半径]×100％
表3枯草芽孢杆菌GN19抑菌率
Figure BDA0002491885490000051
Figure BDA0002491885490000061
由上表可知，GN19菌株对多种病原菌具有拮抗作用，尤其对油菜菌核病菌和马铃薯疮痂病菌的抑菌率达到90.70％和81.24％，且GN19菌株的抑菌率高于另一枯草芽孢杆菌DN5。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河北环境工程学院
<120> 一株具有拮抗作用低温降解纤维素的枯草芽孢杆菌及其应用
<130> 2020.5.6
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1482
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌属()
<400> 1
tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcggacag atgggagctt 60
gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg 120
ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt ttgaaccgca tggttcaaac 180
ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg 240
aggtaacggc tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300
gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 360
acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct 420
gttgttaggg aagaacaagt accgttcgaa tagggcggta ccttgacggt acctaaccag 480
aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540
ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg 600
gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 660
ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 720
ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 780
ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg 840
ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900
ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960
gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg 1020
gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080
cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1140
actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200
cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag 1260
ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1320
ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380
caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttagg 1440
agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt cg 1482

Claims (3)

1.一株具有拮抗作用低温降解纤维素的枯草芽孢杆菌，其特征在于，该菌株具有多种抑菌活性，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年01月09日，保藏编号为CGMCC No.19320，分类学命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
2.权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌在制备纤维素酶中的应用。
3.权利要求1中所述的枯草芽孢杆菌在抗油菜菌核病菌和马铃薯疮痂病菌中的应用。
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