CN112920973B

CN112920973B - 一株产纤维素酶的枯草芽孢杆菌gl-4及其应用

Info

Publication number: CN112920973B
Application number: CN202110300030.4A
Authority: CN
Inventors: 吴健敏; 覃绍敏; 曾文婷; 白安斌; 刘金凤; 陈凤莲; 秦树英; 马玲; 韦珏; 许力士
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2021-03-22
Filing date: 2021-03-22
Publication date: 2022-10-28
Anticipated expiration: 2041-03-22
Also published as: CN112920973A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株产纤维素酶的枯草芽孢杆菌GL‑4及其应用。本发明公开了保藏编号为CGMCC NO.21366的菌株Bacillus subtilis GL‑4，该菌株从竹鼠肠道内溶物中分离而得具有培养pH范围广和耐高温的特点，在培养基pH3‑8，温度为50℃时，菌株仍具有较高的对纤维素的分解能力，经测试，同时该菌株在传代10代后，仍保持较高的活性，由此说明本申请在竹鼠体内筛选得到的菌株具有：纤维素酶活力高、耐高温、pH范围广、传代活力强的优势，是一株具有优良性状的枯草芽孢杆菌，菌株具有良好的研究价值和应用前景。

Description

一株产纤维素酶的枯草芽孢杆菌GL-4及其应用

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株产纤维素酶的枯草芽孢杆菌GL-4及其应用。

【背景技术】

纤维素是植物中主要的多糖化合物(40-45％)，广泛存在于秸秆、稻草、谷物、豆类、麦类及其加工产品等动物饲料中。然而，植物细胞壁的复杂结构严重阻碍了富含纤维素的植物在畜牧业中的生产应用，为了解决这一问题，常使用纤维素酶将植物细胞壁等植物纤维降解为葡萄糖，以提高其利用率。纤维素酶是三种酶的复合物，即纤维蛋白水解酶(EC3.2.1.91)、内切葡聚糖酶或羧甲基葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和葡萄糖糖苷酶(EC3.2.1.21)，由三种酶协同作用完成纤维素的水解。将纤维素转化为葡萄糖有两种方法：化学水解和酶水解。但相对于会产生有毒糖降解产物的化学水解方法来说，酶水解更加的安全环保。自然界作为纤维素酶的重要来源被广泛研究，产纤维素酶的生物具有多样性，主要来源于三条途径：植物、微生物和动物，其中微生物是纤维素酶的主要来源。据不完全统计，迄今为止，国内外共报道了约53个属的几千个菌株可产纤维素酶，包括细菌、真菌、放线菌等。

植食性动物的胃肠道和粪便是纤维素分解菌的重要来源，竹鼠(Rhizomys)又称竹鼬、竹根鼠、芒狸等，是一种皮肉兼用、营养和药用经济价值较高的珍贵特种野生动物。竹鼠以采食植物性食物为主，对粗纤维和木质素的消化率较高，耐粗饲，粗饲料占日粮20％左右，是所有饲养动物中粗纤维利用率最高的动物，并且是唯一和大熊猫类似的能分解纤维素的单胃哺乳动物，目前，现有技术中已经有研究人员从竹鼠体内分离到7株兼性厌氧的纤维素降解菌；曹晓燕等也从竹鼠体内分离到2株具有纤维素酶活性的严格厌氧的细菌；但上述研究主要集中在厌氧菌，而青贮饲料的发酵需经过一段时间的有氧发酵后才能进入厌氧发酵，因此，对竹鼠肠道环境微生物进行研究，筛选出具有高纤维素酶活的需氧菌株尤为重要。

【发明内容】

鉴于上述内容，筛选出竹鼠体内具有高纤维素酶活的需氧菌株对今后菌株在青饲料的发酵应用是非常重要的。

为达到上述目的，本发明从竹鼠的肠道内溶物中筛选出一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GL-4，属于Bacillus属，subtilis种。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.21366，保藏日期为2020年12月14日。

进一步的，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GL-4的筛选方法为：采用刚果红培养基初筛，使用纤维素酶活力测定复筛，而不采用15min刚果红染色后用NaCl溶液清洗15min的方法。

本发明还包括包含所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GL-4的菌剂。

本发明还包括所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GL-4和/或所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GL-4菌剂在分解纤维素上的应用。

本发明还包括所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GL-4和/或所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GL-4菌剂在生产Cen酶、BG酶、FPA酶和/或Cex酶上的应用。

本发明还包括一种应用所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GL-4和/或所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis GL-4菌剂分解纤维素的方法，所述方法为：将菌种接种于种子培养基中，在37℃条件下培养12-36h得到种子液，然后按照1％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在pH值为4-8、30-50℃条件下发酵培养24h，离心、取上清液得到粗酶液；之后将粗酶液添加到含纤维素底物中。

进一步的，所述将菌种接种于种子培养基中，在种子培养基中的最佳反应时间为：24h；在发酵培养基中的最佳pH值为8；最佳反应温度为：37℃。

进一步的，所述种子培养基为：氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L；发酵培养基为：CMC-Na/微晶纤维素/D-水杨苷10g/L，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵2g/L，氯化钠2.5g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨5g/L。

本发明具有以下有益效果：

本申请的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis GL-4具有很高的对纤维素的分解能力，经测试，其Cen的酶活为49.32U/mL；FPA酶活为25.13U/mL；BG酶活为34.04U/mL；Cex酶活为21.96U/mL。而且该菌株还具有培养pH范围广和耐高温的特点，在培养基pH3-8，温度为50℃时，菌株仍具有活性；同时该菌株在传代10代后，仍保持较高的活性，由此说明本申请在竹鼠体内筛选得到的菌株具有：纤维素酶活力高、耐高温、pH范围广、传代活力强的优势，是一株具有优良性状的枯草芽孢杆菌菌株，如将该菌株用于制备菌剂，用于粗饲料中，将能快速对纤维素进行分解，提高动物对纤维素的利用能力，具有良好的研究价值和应用前景。

【附图说明】

图1为四株不同菌株在刚果红培养基上形成的透明圈；从左到右依次为：菌株GL-4、菌株GL-5、菌株GL-6、菌株GL-8；

图2为四株不同菌株酶活力测定结果图；

图3为菌株GL-4在100倍镜下的镜检图；图中，a为荚膜染色图、b为革兰色染色图、c为芽孢染色图；

图4为菌株的系统进化树图；

图5为培养时间对菌株生长和产酶影响实验结果图；

图6为pH值对菌株生长和产酶影响实验结果图；

图7为温度对菌株生长和产酶影响实验结果图。

【具体实施方式】

下面结合附图和实施例和试验对本发明作进一步说明。

实施例1：

菌株的筛选方法：

一、材料和方法

①样品来源：

广西桂林市某竹鼠养殖场成年健康竹鼠肠道内容物。

②主要试剂：

革兰氏染色液、芽孢染色液、荚膜染色液、普通营养肉汤培养基、普通琼脂培养基、LB液体培养基、LB琼脂培养基、MRS液体培养基、MRS琼脂培养基、TSA琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、PDA琼脂培养基(北京陆桥技术股份有限公司产品)；细菌微量生化管、药敏纸片(杭州滨和微生物试剂有限公司产品)；细菌DNA抽提试剂盒(北京康为世纪公司产品)；羧甲基纤维素钠(CMC)、CMC-Na培养基、CMC-Na刚果红培养基(山东拓普生物科技有限公司)；DNALadder Marker、PCR Mix,TaKaRa公司产品；微晶纤维素(COOLABER生物科技有限公司)；D-水杨苷(源叶生物有限公司)；3，5-二硝基水杨酸(国药集团化学试剂有限公司)，其他常规试剂均为分析纯。

③培养基及主要溶液

鲜血琼脂培养基：5％的无菌脱纤维羊血加入到冷却至55-60℃的普通琼脂培养基中混合后倒入平板中冷却至室温。

种子培养基：氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L。

发酵培养基：CMC-Na/微晶纤维素/D-水杨苷10g/L，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵2g/L，氯化钠2.5g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨5g/L，pH值自然。

滤纸培养基：滤纸条(每条：1cm×3.6cm，约0.03g)5g，酵母粉2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.5g，蒸馏水1 000mL，pH自然。

DNS试剂：称取3,5一二硝基水杨酸(10±1)g，置于约600mL水中，逐渐加入氢氧化钠10g，在50℃水浴中搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1L，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。

二、筛选方法：

1、样品处理：称取竹鼠胃肠道内容物1.0g转移至盛有100mL无菌水的三角瓶中，在80℃电热恒温振荡水浴锅中振荡30min，取上清液1ml于LB、MRS、营养肉汤液体培养基中，37℃、220r/min震荡培养12h后，取1ml发酵液于9ml无菌水的试管中，进行梯度稀释，分别取10-4、10-5、10-6稀释液200μl分别涂布到LB、MRS、TSA、普通琼脂、麦康凯、CMC-Na、鲜血琼脂平板上，每个稀释梯度3个重复，涂布后的平板置于37℃恒温箱培养24h。

2、菌株纯化及纤维素降解菌的初筛

在培养基上，分别挑取单个不同形态的菌在平板上划线纯化，直到平板上只有单菌落生长为止。

如图1所示：将刚果红平板打孔，孔径为0.5cm，对单个纯化后的菌落进行稀释，用移液枪将其转移到刚果红平板的孔中，单个菌落重复三次，在37℃下培养24h后用游标卡尺测量刚果红平板上透明水解圈的直径，选取透明圈直径(除去打孔孔径)(D)与菌落直径(d)比值较大的菌株进行复筛：具体选择如表1所示的几株菌株：GL4、GL5、GL6、GL8。

挑取D/d值较大的菌落培养，在平板上反复划线纯化并培养4-5代后，将纯化培养后的菌种加甘油于-80℃保存备用。

表1打孔透明圈直径结果 mm

从表1可见，透明圈直径GL4＞GL5＞GL8＞GL6。

在上述筛选过程中，申请人通过刚果红平板初筛和纤维素酶活力测定复筛的方法相对于现有技术的方法更加便捷，可操作性更强；而现有技术采用15min刚果红染色后用NaCl溶液清洗15min，筛选方法，在筛选时菌落容易被洗脱而导致试验失败，不易筛选得到菌株。

实施例2：

将实施例1筛选出来的菌株进行酶学特征的研究：

一、发酵液的制备：

取纯化培养好的各平板菌种接种于种子培养基，于37℃、220r/min恒温摇床震荡培养36-48h.取液体菌种按1％的接种量接种于分别以三种底物为碳源的发酵培养基和滤纸培养基中，37℃、180r/min恒温摇床震荡培养24h，在8000r/min条件下离心5min，去除菌体，取上清液，得粗酶液。

二、标准曲线的绘制：

分别吸取不同浓度(mg/mL)的葡萄糖标准使用溶液(0、1、1.5、2、2.5、3、3.5)、缓冲溶液和DNS试剂于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL.盖塞，混匀。用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数应在0.9990以上时方可使用。

三、纤维素酶活性的测定：

FPA、Cen、Cex和BG酶的测定按常规方法进行，以灭活后的粗酶液作为空白对照，分别吸取各菌株粗酶液、缓冲溶液和DNS试剂于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25mL，盖塞，混匀。用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。以(50士0.1)℃、相应pH条件下，1min水解纤维素底物，产生出相当于lμmol葡萄糖的还原糖量为1个酶活力单位，以U/g(或U/mL)表示。

得到的结果如图2所示：从图2可知，纤维素酶活大小从高到低：菌株GL-4＞菌株GL-5＞菌株GL-8＞菌株GL-6与图1、表1中透明圈大小一致；且从菌株GL-4来讲，其对几种酶的分解能力从高到低依次为：Cen＞BG＞FPA＞Cex，其中，菌株GL-4中，Cen的酶活为49.32U/mL；FPA酶活为25.13U/mL；BG酶活为34.04U/mL；Cex酶活为21.96U/mL。

实施例3：

菌株鉴定，对上述几株菌株透明圈较大的GL-4、GL-5和GL-8株菌株进行鉴定，其结果如下：

一、形态学鉴定：

GL-4菌株分离后在普通营养平板上的形态学鉴定结果表现为：在平板上，其菌落形态为圆形、菌落边缘完整、表面凸起光滑、菌落颜色为黄粉色；显微镜下体现为革兰氏阳性、有芽孢、无荚膜、短杆菌；镜检图可参见图3。

GL-5菌株分离后在普通营养平板上的形态学鉴定结果表现为：在平板上，其菌落形态为不规则、菌落边缘撕裂状、表面扁平不光滑、菌落颜色为白色；显微镜下体现为革兰氏阳性、有芽孢、无荚膜、短杆菌；

GL-8菌株分离后在普通营养平板上的形态学鉴定结果表现为：在平板上，其菌落形态为较规则圆形、菌落边缘完整、表面凸起光滑、菌落颜色为黄色；显微镜下体现为革兰氏阳性、有芽孢、无荚膜、短杆菌。

二、生化检测：

选择上述菌株GL4、GL5、GL8进行生化鉴定，其结果如表2所示：

表2生化鉴定结果

如表2所示，3株菌的生化试验结果大致相似，均能利用明胶、葡萄糖、蔗糖、淀粉和过氧化氢，分解糖类产生乙酰基甲醇；不能利用木糖、阿拉伯糖、吲哚、硝酸盐和枸橼酸盐，不能分解糖类产酸。另外，3株菌中仅GL-8株可利用甘露醇。生化试验结果符合芽孢杆菌的生化特性，初步确定3株菌均为枯草芽孢杆菌。

三、分子生物学鉴定：

采用PCR方法扩增GL-4、GL-5和GL-8株的16SrDNA序列，将克隆测序后序列进行BLAST比对，并用MEGA 7.0软件构建16SrDNA的遗传进化树。BLAST比对结果显示，GL-4、GL-5和GL-8株的16SrDNA基因与枯草芽孢杆菌的基因序列一致性均大于98％。遗传进化树显示，GL-4、GL-5和GL-8株分别位于3个不同的枯草芽孢杆菌分支(图4)。结果表明，3个分离菌株均为枯草芽孢杆菌，与生理生化的鉴定结果一致。

上述实验中，16S rDNA鉴定采用的引物为：上游引物序列：5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3和下游引物序列：5'-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3'；

PCR反应体系和程序为(25μL)：上、下游引物(10μmol/L)各0.5μL，细菌基因组(208ng/μL)3μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 8.5μL。反应条件为：94℃5min，94℃30s，57℃30s，72℃2min，35个循环，72℃10min。

由此鉴定得出：菌株GL4属于：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis种。申请人对菌株GL-4进行了保藏，其保藏编号为CGMCC NO.21366，保藏日期为2020年12月14日。

实施例4：

培养条件对产纤维素酶的影响

选择酶活性最高的GL-4株，进行最佳培养条件筛选：

1、培养时间对菌株产酶的影响

取菌株种子液100μL接入20mL发酵培养基中，37℃185r/min发酵培养至6，12，24，36，48，60，72小时，测定其OD₆₀₀值和FPA活力。

结果如图5所示，0～6h是菌株生长调整期，6～36h是对数生长期，36～48h是稳定期，48h后菌株进入衰亡期。发酵时间在0～24h时，菌株产酶活力随发酵时间的延长而升高，并在24h时达到顶峰，之后酶活性随发酵时间的延长逐步降低，所以菌株GL-4的最佳培养时间为24h。培养时间在0～24h时，生长曲线的变化与纤维素酶活性曲线呈正相关，培养24h之后，两者曲线变化没有明显的相关性。

2、pH对菌株产酶的影响

将发酵培养基的pH值分别调至3，4，5，6，7，8，9和10，接种后37℃185r/min发酵培养24h，测定其OD₆₀₀值和FPA活力。

结果如图6所示，当发酵培养基的pH为3～4时，GL-4的生长性能和产酶活力随着pH的升高而升高；在pH为4～6时，随pH的升高稍微有所降低；之后又随着pH的升高，在pH为8时达到峰值，当pH达到9时，菌株失活而无法产生纤维素酶。结果显示，菌株在弱碱性的环境下能很好的生长和产酶，产酶的最适pH为8。

3、温度对菌株产酶的影响

将发酵培养基接种后分别置于30，37，43，50，57，65℃，185r/min发酵培养24h，测定其OD₆₀₀值和FPA活力。

结果如图7所示，GL-4的生长性能和产酶活力在30℃～37℃时随温度升高而升高，在37℃～57℃时随温度升高而急剧降低，在57℃时菌株不再生长和产酶。结果说明菌株产纤维素酶的最适温度为37℃。

通过上述条件摸索发现：菌株GL-4具有培养pH范围广和耐高温的特点，在培养基pH3-8，温度为50℃时，菌株仍具有活性。

实施例5：

根据实施例4条件摸索出本申请的对纤维素的水解方法，具体如下：

将平板培养基的菌种接种于种子培养基中，在37℃条件下培养12-36h得到种子液，然后按照1％的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在pH值为4-8、30-50℃条件下发酵培养24h，离心、取上清液得到粗酶液；之后将粗酶液添加到含纤维素底物中。

其中，在种子培养基中的最佳反应时间为：24h；在发酵培养基中的最佳pH值为8；最佳反应温度为：37℃。

其中，所述种子培养基为：氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L；发酵培养基为：CMC-Na/微晶纤维素/D-水杨苷10g/L，磷酸氢二钾1g/l，硫酸镁0.5g/l，硫酸铵2g/L，氯化钠2.5g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨5g/L。

实施例6：

上述菌株经过多代培养研究后发现，其传代10代后，仍能保持较高的酶活，经检测传代10代后菌株的Cen酶活为42.18U/mL；FPA酶活为20.36U/mL；BG酶活为28.45U/mL；Cex酶活为17.32U/mL；将上述菌株制备成冻干粉后，添加到粗饲料中，能有效软化粗饲料,是一株可用作粗纤维饲料添加剂的优良候选菌株。

综上，本研究从竹鼠肠道内容物中获得的纤维素分解菌：枯草芽孢杆菌GL-4对纤维素有较高的分解能力；通过上述实验发现：相同环境下的菌株,其纤维素酶活力在不同碳源存在时也存在差异。纤维素酶降解纤维素的过程被认为是三种酶协同作用的结果，有观点认为，纤维素酶发挥作用首先由Cen在纤维素分子内部的无定形区进行酶切产生新的末端,然后由外切葡聚糖酶，又被称为Cex以纤维二糖为单位由末端进行水解,每次切下1个纤维二糖分子,最后由BG将纤维二糖以及短链的纤维寡糖水解为葡萄糖。纤维素酶的三种组分分别作用的底物不同，Cen的水解底物包括羧甲基纤维素和磷酸溶胀纤维素等无定形纤维素；Cex水解底物包括棉花和微晶纤维素等结晶度较高的纤维素；BG的水解底物是纤维寡糖和纤维二糖。GL-4株的FPA和Cen活性最高，说明此菌株对于多种成分的纤维素底物和无定形纤维素底物有较强的水解能力；GL-8的Cex活性最高，说明该菌株对葡聚糖和纤维二糖有较强的水解能力；GL-5的BG活性最高，说明该菌株对纤维寡糖和纤维二糖的水解能力较强。因此，在后续的应用研究中，可根据不同的发酵原料，选择其中的1株或多个菌株混合使用，筛选出最佳的纤维降解效果。

同时，纤维素降解菌的酶活性受到培养条件的影响。培养基的pH值和培养温度的改变，影响菌株的生长，从而间接影响酶活性，在强酸强碱和高温条件下，菌株无法生长及产酶。根据本文研究结果，培养时间在0-24h时，菌株生长与酶活呈正相关，即随着菌量的增加，产酶量也随之增加，并且在24h时达到最高，24h后，菌株依然处于对数生长期，但酶活却不再升高，直到48h后，两者又重新呈正相关。出现这种现象的可能原因如下：1、GL-4株的生长曲线与现有技术大致相同，但其对数生长期持续时间较长，达30h，在24h后随着菌株生长代谢的增强，培养基中的营养物质不断被消耗，菌株死亡率上升，产酶量下降；2、GL-4株对温度的变化较敏感，除了37℃培养时，在其它温度培养24h后，其酶活性均不高，在细菌发酵培养过程中的温度升高可能也会导致酶活性的降低，这与菌株的热稳定性有关；3、GL-4株在pH4-8时，其酶活性一直保持较高状态，但当培养基pH离开这个区间值后，酶活性急剧下降，这是因为，枯草芽孢杆菌在发酵时会产生乳酸，从发酵开始分泌直至48h到达峰值，乳酸的生成导致培养基中pH值发生改变，从而使酶活性发生改变。

本申请在竹鼠肠道中筛选得到的GL-4株是目前竹鼠源分离菌中纤维素酶活性最强的细菌，对常见的四种纤维素底物均有较好的分解能力。其Cen酶活力为49.32U/mL；FPA酶活力为25.13U/mL；BG酶活为34.04U/mL；Cex酶活为21.96U/mL；同时，其在传代10代后仍保持了较高的酶活活性，说明其产酶稳定性要优于其它菌株。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims

1.枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）GL-4，其保藏编号为CGMCC NO.21366。

2.包含如权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GL-4的菌剂。

3.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GL-4和/或权利要求2所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）GL-4菌剂在分解纤维素上的应用。

4.一种应用如权利要求1所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）GL-4和/或权利要求2所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）GL-4菌剂分解纤维素的方法，其特征在于，所述方法为：将菌种接种于种子培养基中，在37℃条件下培养12-36h得到种子液，然后按照1%的接种量将种子液接种到发酵培养基中，在pH值为4-8、30-50℃条件下发酵培养24h，离心、取上清液得到粗酶液；之后将粗酶液添加到含纤维素底物中。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述将菌种接种于种子培养基中，在种子培养基中的最佳反应时间为：24h；在发酵培养基中的最佳pH值为8；最佳反应温度为：37℃。