PL212003B1

PL212003B1 - Sposób otrzymywania celulozy bakteryjnej

Info

Publication number: PL212003B1
Application number: PL361067A
Authority: PL
Inventors: Alina Krystynowicz; Wojciech Czaja; Stanisław Bielecki
Original assignee: Politechnika Lodzka
Priority date: 2003-07-03
Filing date: 2003-07-03
Publication date: 2012-07-31
Also published as: PL361067A1; WO2005003366A1; EP1660670A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania celulozy bakteryjnej w formie błon, sposób immobilizowania bakterii <I>Bacillus subtilis<D> syntetyzujących proteinazę, sposób otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów, zastosowanie celulozy bakteryjnej wytworzonej w hodowli stacjonarnej szczepu <I>Acetobacter xylinum<D> jako materiału opatrunkowego, zastosowanie celulozy bakteryjnej do otrzymywania biokatalizatorów, sposób modyfikacji błon celulozowych w celu otrzymania celulozowych materiałów opatrunkowych. Ogólnie wynalazek dotyczy syntetyzowania celulozy, z której w warunkach stacjonarnych, na powierzchni ciekłej pożywki formuje się galaretowata, sprężysta błona, zastosowania celulozy bakteryjnej jako nośnika do otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów oraz sposobu zastosowania celulozy bakteryjnej jako materiału opatrunkowego w postaci membran celulozowych o dowolnych rozmiarach i formie.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania celulozy bakteryjnej, w warunkach hodowli stacjonarnej z wykorzystaniem szczepu Acetobacter xylinum, w których na powierzchni ciekłej pożywki formuje się hydrożelowa, sprężysta błona celulozowa. Celuloza bakteryjna znajduje zastosowanie w medycynie jako materiał opatrunkowy w terapii rozległ ych ran oparzeniowych 2 i 3 stopnia, stosowany w postaci membran celulozowych o dowolnych rozmiarach i formie.

Celuloza jest nierozgałęzionym homopolisacharydem, zbudowanym z jednostek e,D-glukopiranozy połączonych ze sobą wiązaniami β-1,4-glikozydowymi. Celuloza bakteryjna (BC) należy do wysokokrystalicznych celuloz, bogatych we frakcję Ia [czasopisma Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 8130-8134 i Journal of Materials Science 35, 261-270]. Syntetyzowane przez bakterie łańcuchy glukanowe łączą się i formują elementarne subfibryle celulozowe o szerokości 1,5 nm, należące do najcieńszych naturalnie występujących włókien, porównywalnych jedynie do elementarnych włókien celulozy wykrytych w kambium niektórych roślin i śluzie pigwy [czasopismo Journal of Fermentation and Bioengineering 75, 18-22]. BC jest syntetyzowana przez kilka rodzajów bakterii, spośród których do najlepiej poznanych należą szczepy bakterii octowych Acetobacter.

Synteza celulozy I przez Acetobacter xylinum, jak również przez inne organizmy wykazujące tę zdolność, obejmuje przynajmniej dwa etapy: 1) polimeryzację cząsteczek glukozy w liniowy β-1,4 glukan, 2) łączenie i krystalizację indywidualnych łańcuchów polimerowych w większe jednostki strukturalne.

Mikroskopia elektronowa negatywowo wybarwionej celulozy, wytworzonej w hodowli bakterii Acetobacter xylinum [czasopismo Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 61(9), 1585-1586], ujawniła hierarchiczny charakter procesu przestrzennego gromadzenia celulozy. W pierwszym etapie 10-15 łańcuchów e-1,4-glukanowych tworzy subfibrylę o średnicy około 1,5 nm. Subfibryle łączą się i formują mikrofibryle (3,0-3,5 nm) zbudowane z licznych, równolegle ułożonych do siebie łańcuchów. W kolejnym etapie dochodzi do asocjacji 50-80 mikrofibryli, które łączą się następnie w luźne struktury o szerokości 40-60 nm, znane jako wstążki, złożone z około 1000 indywidualnych łańcuchów glukanowych [czasopismo Biochemical Journal 58, 345-352]. Biochemiczne badania mechanizmu regulacji syntezy celulozy wykazały, iż aktywność syntazy celulozowej warunkuje obecność allosferycznego efektora, którym jest cykliczny nukleotyd - diquanozynomonofosforan (c-di-GMP) [czasopismo Carbohydrate Polymers 35, 233-23 725].

W czasopiśmie Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 8130-8134 oraz w opisie patentowym US 5 268 2 74 dowiedziono, że proces biosyntezy celulozy bakteryjnej jest związany z aktywnością czterech genów: bcvsA (2261 par zasad), bcsB (2405 par zasad), bcsC (3956 par zasad) oraz bcsD (467 par zasad), które tworzą operon syntazy celulozowej o długości 9217 par zasad. Funkcje białek kodowanych przez każdy z tych genów nie zostały jeszcze precyzyjnie wyjaśnione, aczkolwiek pewne informacje na temat ich potencjalnej roli zostały uzyskane dzięki metodzie komplementacji uszkodzonego genu syntazy celulozowej [czasopismo Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 8130-8134]. Analiza genu odpowiedzialnego za kodowanie podjednostki katalitycznej (cesA), analogicznego do genu bcsB [czasopismo Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 8130-8134, opis patentowy US 5 268 274], została również przedstawiona w czasopiśmie Plant Molecular Biology 16, 947-954] i następnie w czasopiśmie Journal of General Microbiology 11, 123] zidentyfikowano gen odpowiedzialny za kodowanie podjednostki regulatorowej (cesB). Jednakże badania [czasopisma Plant Molecular Biology 16, 947-954 i Journal of General Microbiology 11, 123] wykazały, że pozycje dwóch pierwszych genów w operonie syntazy celulozowej są dokładnie przeciwne, niż zademonstrowano to w czasopiśmie Proceedings of the National Academy of Sciences USA 87, 8130-8134] sugerując, że pierwszy z tych genów koduje podjednostkę katalityczną syntazy celulozowej. Rola produktów ekspresji genów bcsC i bcsD nie została jak dotąd precyzyjnie wyjaśniona.

Produkcja BC na skalę przemysłową jest jeszcze niewielka, głównie ze względu na trudności związane z wyselekcjonowaniem wysokoaktywnych szczepów, zdolnych do biosyntezy celulozy w warunkach hodowli wgłębnej i pozbawionych możliwości metabolizowania glukozy do kwasów glukonowych, a także ze względu na dość wysokie koszty składników podłoża hodowlanego.

Proces biosyntezy BC może być prowadzony zarówno w warunkach hodowli stacjonarnej jak i hodowli wgłębnej, która zapewnia pełną jego kontrolę. Wybór metody hodowli zależy ściśle od dalszego przeznaczenia syntetyzowanego polimeru [czasopismo Mededelingen Van De Faculteit Landbouwwetenschappen Universiteit Gent Proceedings Part I, 213-220]. Kontrola procesu biosyntezy BC

PL 212 003 B1 w hodowli stacjonarnej jest znacznie utrudniona ze względu na gromadzącą się na powierzchni pożywki błonę, która ogranicza dostęp do cieczy hodowlanej. Synteza BC w warunkach stacjonarnych może być prowadzona przy wykorzystaniu jednoetapowej (pożywka szczepiona 5-10% inokulum) lub dwuetapowej procedury [czasopismo Biopolymers Vol 7: Polysaccharides I Munster, Germany 37-90]. Ta ostania obejmuje etap hodowli wgłębnej w celu namnożenia biomasy, a następnie kontynuację procesu w warunkach stacjonarnych [czasopismo World Journal of Microbiology & Biotechnology 16, 245-248].

Wytwarzanie celulozy w dużej skali, w hodowlach z ciągłym mieszaniem, napotyka na szereg trudności, z których największą jest niestabilność kultury przejawiająca się tendencją do spontanicznej mutacji w kierunku szczepów nieaktywnych, tak zwanych Cel^- [PN JP 97-21905]. Szczep niestabilny może być z powodzeniem stosowany w hodowlach stacjonarnych, w których wzrost bakterii i synteza celulozy przebiega na granicy faz pożywka-powietrze. W warunkach hodowli wstrząsanej, w której wzrost bakterii Cel+ jest ograniczony szybkością rozpuszczania się tlenu oraz agregacją komórek przez syntetyzowaną celulozę (co utrudnia dostęp tlenu), faworyzowane są komórki nieaktywne Cel^-.

BC może być również produkowana w warunkach ciągłej hodowli stacjonarnej [czasopismo Zentralblatt fur Bakteriologie, Mikrobiologie, und Hygiene 145, 247-252]. Acetobacter xylinum jest wówczas hodowany na tacach, na podłożu SH i po 2-3 dniach procesu wytworzona na powierzchni podłoża błona celulozowa jest w sposób ciągły wprowadzana do kąpieli w roztworze sodowego siarczanu dodecylu (SDS) w celu inaktywacji komórek, a następnie nawijana na specjalny wałek. Proces taki prowadzony był przez kilka tygodni, przy prędkości nawijania 35 mm/h i przy okresowym uzupełnianiu podłoża (co 8-12 h), w celu utrzymania optymalnych warunków hodowli. Wykorzystując tę metodę uzyskano pas celulozowy o długości 5 m, co wskazuje na potencjalną możliwość jej wykorzystania na skalę przemysłową.

Innym, opisywanym sposobem syntezy celulozy jest hodowla bakterii Acetobacter w specjalnych bioreaktorach poziomych, wyposażonych w zestaw obracających się wałków, na których osadzał się wytwarzany polimer. W takich warunkach [czasopismo Plant Molecular Biology 15, 673-683] obserwowano przyspieszony wzrost komórek oraz prawie 2-krotny wzrost wydajności procesu biosyntezy celulozy w stosunku do hodowli kontrolnej, prowadzonej w warunkach stacjonarnych.

Możliwości wykorzystania BC w medycynie, szczególnie jako materiału opatrunkowego oraz sztucznych organów, stwarzają takie jej właściwości, jak wysoka czystość, wytrzymałość mechaniczna, zdolność chłonięcia cieczy, bardzo dobra zgodność z żywą tkanką a w szczególności z krwią. Właściwie oczyszczone błony celulozowe, wytworzone metodą hodowli stacjonarnej, mogą stanowić gotowy materiał opatrunkowy spełniający standardy przypisane nowoczesnym materiałom opatrunkowym [czasopisma Postępy Biologii Komórki 16(2), 197-212 i Applied Biochemistry and Biotechnology 28/29, 341-351]. Jest biokompatybilny, porowaty, elastyczny, łatwy w zastosowaniu i przechowywaniu, zapewnia optymalną wilgotność sprzyjająca gojeniu się rany i może być sterylizowany termicznie. Błony celulozowe są również znakomitymi nośnikami służącymi do immobilizacji różnorodnych substancji bioaktywnych, przyspieszających proces gojenia. Z uwagi na występujące ostatnio problemy i kontrowersje związane ze stosowaniem produktów pochodzenia zwierzęcego, opatrunki kolagenowe mogą zostać zastąpione właśnie opatrunkami celulozowymi. Jak dotychczas zanotowano kilka doniesień mówiących o pozytywnych rezultatach badań klinicznych z wykorzystaniem BC jako opatrunku do leczenia ran oparzeniowych, owrzodzeń troficznych lub też jako biomateriału przy transplantacji skóry [opis zgłoszenia patentowego WO 97/05271, czasopisma British Polimer Journal 22, 167-171 i Nature 325, 279-28].

Właściwości BC otwierają wiele możliwości jej praktycznego wykorzystania, uzasadnionych ekonomicznie, przy uwzględnieniu udoskonalenia metod hodowli i oparciu produkcji na ulepszonych szczepach Acetobacter; wykorzystujących tanie i łatwo dostępne surowce.

Z opisu patentowego PL 171952 i z opisu zgłoszenia patentowego P 317139 jest znany sposób wytwarzania BC w postaci błon na drodze hodowli powierzchniowej bakterii Acetobacter xylinum na podłożu opartym na glukozie. Stosowany w tym sposobie szczep bakterii Acetobacter xylinum P23 wykazuje optymalny wzrost w temperaturze 28-30°C przy pH 4-6,5. Na podłożach stałych zawierających glukozę, ekstrakt drożdżowy, pepton, agar tworzy galaretowate kolonie, zaś w hodowli na podłożach płynnych tworzy śluzowatą, zwartą błonkę. Szczep Acetobacter xylinum P23 inkubuje się na podłożu płynnym.

Z opisów patentowych US 5975095, US 5962278 i US 6110712 jest znany sposób syntezy celulozy przez bakterie Acetobacter xylinum subsp.nonaacetoxidans.

PL 212 003 B1

W opisach patentowych US 6429002, US 6329192, US 5144021, US 5079162 i US 4863565 przedstawiono sposób wytwarzania BC w warunkach wstrząsania, w których w czasie 70 h uzyskano przynajmniej 0,1 g/l w czasie 1 godziny.

Z opisu patentowego US 5955325 jest znane wytwarzanie celulozy mikrobiologicznej o wysokiej zawartości wody w fermentorze dyskowym.

Opis patentowy EP 0792935 przedstawia proces wytwarzania celulozy w fermentorze, przy częściowym ciśnieniu CO2 w fazie gazowej w zbiorniku fermentacyjnym (10,13 kPa lub mniejszym).

Opis patentowy WO 8602095 dotyczy sposobu wytwarzania filmu celulozowego jako sztucznej skóry stosowanej przy przeszczepach. Sposób ten obejmuje przygotowanie medium hodowlanego, w którym pożywkę stanowią źródło azotu oraz węglowodany, zaszczepienie hodowli bakteriami Acetobacter xylinum, inkubację hodowli w temperaturze, która zapewnia aktywność bakterii w czasie koniecznym do wytworzenia wymaganego filmu, usunięcie utworzonego filmu z pożywki w celu dehydratacji w stanie rozciągniętym.

Z opisów patentowych US 4788146 i US 4588400 jest znane zastosowanie bł on celulozowych jako opatrunków do ran i skaleczeń, a także ran oparzeniowych. Błony te wytwarzane w hodowli Acetobacter xylinum, mają grubość 0,1-15 mm lub więcej i po usunięciu z nich pożywki, w stanie uwodnionym są sterylizowane.

Z publikacji w czasopiś mie Mededelingen Van De Faculteit Landbouwwetenschappen Uniwersiteit Gent, vol.65, no. 3A, 2000, s. 213-220 jest znany sposób otrzymywania BC w formie blon, w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum, polegający na zaszczepieniu podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części substancji ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4 x 7 H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5 x 10⁷ jtk/ml, użytą w ilości 5% v/v i prowadzeniu hodowli wstępnej inokularnej w temperaturze 27-33°C, wymieszaniu podłoża z otrzymanym inokulum i zaszczepieniu otrzymaną w ten sposób zawiesiną bakterii, użytą w ilości 5% v/v, podłoża produkcyjnego o składzie określonym powyżej, prowadzeniu hodowli produkcyjnej w bioreaktorach, w wyniku której otrzymuje się bł ony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegaj ą cemu na płukaniu w wodzie, gotowaniu w 1%-owym NaOH w czasie 0,5-2 godzin, ponownym płukaniu w wodzie do całkowitego usunięcia NaOH, działaniu 1%-owym kwasem octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną, odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji.

Pomimo opisanych powyżej sposobów otrzymywania BC istnieje ciągła potrzeba modyfikacji metod hodowlanych, optymalizacji podłoża hodowlanego z uwzględnieniem aspektów ekonomicznych.

Celem niniejszego wynalazku jest optymalizacja warunków syntezy BC w formie błon przeznaczonej do zastosowań medycznych, z uwzględnieniem sposobu szczepienia podłoża hodowlanego, jego kosztów decydujących o opłacalności produkcji w skali przemysłowej.

Sposób otrzymywania celulozy bakteryjnej w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum, polegający na zaszczepieniu podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4 x 7 H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5 x 10⁷ jtk/ml, uż ytą w ilości 5% v/v i prowadzeniu hodowli wstępnej inokulum w temperaturze 27-33°C, wymieszaniu podłoża z otrzymanym inokulum i zaszczepieniu otrzymaną w ten sposób zawiesiną bakterii, podłoża produkcyjnego zawierającego 20 części wagowych substancji stanowiącej źródło węgla, substancję stanowiącą źródło azotu, 2,5 części wagowych MgSO4 x 7 H2O, 2,7 części wagowych Na2HPO4, 1,15 części wagowych kwasu cytrynowego, 10 części wagowych etanolu, do 1000 części wagowych wody destylowanej, prowadzeniu hodowli produkcyjnej w bioreaktorach, w wyniku której otrzymuje się błony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegającemu na płukaniu w wodzie, gotowaniu w 1%-owym NaOH w czasie 0,5-2 godzin, ponownym płukaniu w wodzie do całkowitego usunięcia NaOH, działaniu 1%-owym kwasem octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną oraz odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji, według wynalazku charakteryzuje się tym, że przed właściwą hodowlą produkcyjną stosuje się wstępną preinkubację całej objętości podłoża w warunkach stacjonarnych w czasie 24 godzin w temperaturze 27-33°C, po czym po dokładnym wymieszaniu podłoża i przelaniu do bioreaktorów w takich ilościach, aby stosunek powierzchni do objętości wynosił 0,6-0,8 cm^-1, prowadzi się hodowlę produkcyjną właściwą w warunkach stacjonarnych w czasie 5-7 dni. Stosuje się podłoże hodowlane korzystnie uzupełnione karboksymetyPL 212 003 B1 locelulozą o masie cząsteczkowej 90.000, użytą w ilości 5 części wagowych, oraz podłoże produkcyjne, w którym źródło węgla stanowi surowiec odpadowy zawierający 45-70% glukozy, 10-15% izomaltozy i 5-6% gencjobiozy, syrop glukozo-fruktozowy 1:1, melasa o zawartości sacharozy 51% i glukozy około 15% lub odciek po mikrobiologicznej biosyntezie dekstranu zawierający 12,23% fruktozy, około 0,3% glukozy i około 2,8% sacharozy, lub glicerol, źródło azotu stanowi namok kukurydziany, ciecz hodowlana po syntezie celulozy bądź ciecz inokularna. Stosuje się 20 części wagowych namoku kukurydzianego. Wytworzone błony, po oczyszczeniu i usunięciu z nich wody, poddaje się sterylizacji radiacyjnej stosując dawkę promieniowania 20 - 25 kGy.

Sposób według wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

P r z y k ł a d 1

Podłoże binokularne P1 o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4 x 7H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, szczepiono 5% v/v zawiesiny bakterii Acetobacter (5 x 10⁷ jtk/ml) przechowywanych na tymże podłożu nie dłużej niż 7 dni, w temperaturze 4°C i hodowano w czasie 2 dni w temperaturze 30°C, po czym po intensywnym mieszaniu zaszczepiono zawiesiną bakterii w ilości 5% objętości podłoża produkcyjnego o tym samym składzie i preinkubowano całą objętość jedną dobę w temperaturze 30°C, po czym przeniesiono je do bioreaktorów o wymaganej powierzchni, w takiej ilości aby stosunek S/V (powierzchnia/objętość) wynosił 0,7 cm^-1. Wytworzenie błon w tych warunkach wymagało przygotowania 14 dm³ podłoża hodowlanego, które po zaszczepieniu i preinkubacji rozlano do bioreaktorów i prowadzono proces biosyntezy błon celulozowych w czasie 7 dni. Uformowane błony o grubości około 5 mm oczyszczano stosując płukanie w wodzie wodociągowej, następnie traktowano je 1%-owym NaOH w temperaturze 100°C w czasie 1 h, po czym ponownie płukano w wodzie wodociągowej, następnie w 1%-owym kwasie octowym, ponownie w wodzie i na końcu w wodzie destylowanej, a nadmiar wody (około 90%) usunięto stosując wyciskanie, po czym wilgotne błony pakowano do szczelnych woreczków foliowych i poddano sterylizacji radiacyjnej stosując dawkę promieniowania γ = 25 kGy.

Uzyskano około 3,5 g suchej, oczyszczonej masy celulozowej z 1 dm³ podłoża, w której zawartość białka nie przekraczała 3%.

P r z y k ł a d 2

Inokulum otrzymanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono sterylne podłoże produkcyjne o składzie w częściach wagowych: odciek po krystalizacji glukozy w ilości odpowiadającej 2% glukozy, 20 części namoku kukurydzianego, 10 części etanolu i wody destylowanej do 1000 części.

Dalej postępowano jak w przykładzie 1.

W rezultacie otrzymano porównywalną ilość masy celulozowej jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 3

Inokulum otrzymanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono sterylne podłoże produkcyjne zawierające jako źródło węgla syrop glukozo-fruktozowy (1:1) w ilości odpowiadającej 1% glukozy i 1% fruktozy oraz pozostałe składniki jak w podłożu P1.

Dalej postępowano jak w przykładzie 1.

W rezultacie otrzymano masę celulozową w iloś ci okoł o 15% wyż szej w porównaniu z wynikiem przykładu 1.

P r z y k ł a d 4

Inokulum otrzymanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono sterylne podłoże produkcyjne, w którym jako źródło fruktozy w ilości 50 części wagowych stosowano odciek fruktozowy - surowiec odpadowy po wytrąceniu i oddzieleniu dekstranu z cieczy hodowlanej Leuconostoc mesenteroides oraz 2 części etanolu i 5 części ekstraktu droż d ż owego, woda destylowana do 1000 części.

Dalej postępowano jak w przykładzie 1.

Uzyskano o około 20% więcej masy celulozowej w porównaniu z wynikiem przykładu 1.

P r z y k ł a d 5

Inokulum otrzymanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono sterylne podłoże produkcyjne, w którym jako źródło węgla stosowano roztwór melasy w takiej ilości, aby sacharoza w podłożu stanowiła 50 części wagowych, źródło azotu - ekstrakt drożdżowy stanowił 5 części, etanol 10 części oraz woda destylowana do 1000 części.

W rezultacie otrzymano masę celulozową w ilości odpowiadającej około 75% masy celulozowej z przykł adu 1.

PL 212 003 B1

P r z y k ł a d 6

Inokulum otrzymanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono sterylne podłoże produkcyjne P1, w którym 5 części ekstraktu drożdżowego i 5 części peptonu zastą piono 20 częściami namoku kukurydzianego, nie zmieniając ilości pozostałych składników.

Dalej postępowano jak w przykładzie 1.

W rezultacie otrzymano o 10% więcej masy celulozowej w porównaniu z wynikiem przykładu 1.

P r z y k ł a d 7

Inokulum otrzymanym jak w przykładzie 1 (w ilości 10% v/v) zaszczepiono sterylne podłoże produkcyjne P1, w którym 50% stanowiła ciecz pozostała po 7-dniowej hodowli.

Dalej postępowano jak w przykładzie 1.

Uzyskano wynik porównywalny z wynikiem przykładu 1.

P r z y k ł a d 8

Postępując jak w przykładzie 1 zastosowano podłoże hodowlane P1 uzupełnione karboksymetylocelulozą (CMC) o masie cząsteczkowej 90.000 w ilości 5 części wagowych.

Dalej postępowano jak w przykładzie 1.

Uzyskano masę celulozową, w której ilość suchej masy przekraczała o 30% ilość masy z przykładu 1. Wytworzona z dodatkiem CMC błona celulozowa po wysuszeniu charakteryzowała się około 10-krotnie wyższą wodochłonnością w porównaniu z wodochłonnością błon otrzymanych na podłożach bez CMC.

Claims

1. Sposób otrzymywania celulozy bakteryjnej w drodze hodowli bakterii Acetobacter xylinum, polegający na zaszczepieniu podłoża hodowlanego o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO4 x 7 H2O, 2,7 części Na2HPO4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, zawiesiną bakterii przechowywanych na podłożu o takim samym składzie w czasie nie dłuższym niż 7 dni, o gęstości 5 x 10⁷ jtk/ml, uż ytą w ilości 5% v/v i prowadzeniu hodowli wstępnej inokulum w temperaturze 27-33°C, wymieszaniu podłoża z otrzymanym inokulum i zaszczepieniu otrzymaną w ten sposób zawiesiną bakterii, podłoża produkcyjnego zawierającego 20 części wagowych substancji stanowiącej źródło węgla, substancję stanowiącą źródło azotu, 2,5 części wagowych MgSO4 x 7 H2O, 2,7 części wagowych Na2HPO4, 1,15 części wagowych kwasu cytrynowego, 10 części wagowych etanolu, do 1000 części wagowych wody destylowanej, prowadzeniu hodowli produkcyjnej w bioreaktorach, w wyniku której otrzymuje się błony celulozowe, które poddaje się oczyszczeniu polegającemu na płukaniu w wodzie, gotowaniu w 1%-owym NaOH w czasie 0,5-2 godzin, ponownym płukaniu w wodzie do całkowitego usunięcia NaOH, działaniu 1%-owym kwasem octowym, przemyciu wodą i w końcu wodą destylowaną oraz odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji, znamienny tym, że przed właściwą hodowlą produkcyjną stosuje się wstępną preinkubację całej objętości podłoża w warunkach stacjonarnych w czasie 24 godzin w temperaturze 27-33°C, po czym po dokładnym wymieszaniu podłoża i przelaniu do bioreaktorów w takich ilościach, aby stosunek powierzchni do objętości wynosił 0,6-0,8 cm^-1, prowadzi się hodowlę produkcyjną właściwą w warunkach stacjonarnych w czasie 5-7 dni, przy czym stosuje się podłoże hodowlane korzystnie uzupełnione karboksymetylocelulozą o masie cząsteczkowej 90.000, użytą w ilości 5 części wagowych, oraz podłoże produkcyjne, w którym źródło węgla stanowi surowiec odpadowy zawierający 45-70% glukozy, 10-15% izomaltozy i 5-6% gencjobiozy, syrop glukozo-fruktozowy 1:1, melasa o zawartości sacharozy 51% i glukozy około 15% lub odciek po mikrobiologicznej biosyntezie dekstranu zawierający 12,23% fruktozy, około 0,3% glukozy i około 2,8% sacharozy, lub glicerol, źródło azotu stanowi namok kukurydziany, ciecz hodowlana po syntezie celulozy bądź ciecz inokularna.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się 20 części wagowych namoku kukurydzianego.