CN104928330A

CN104928330A - 一种利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法

Info

Publication number: CN104928330A
Application number: CN201510392516.XA
Authority: CN
Inventors: 吕浩; 杨云
Original assignee: WEIDE (QINGHAI) BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: WEIDE (QINGHAI) BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-07-06
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2015-09-23

Abstract

本发明公开了一种利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)对细菌纤维素膜的表面进行预处理，扩大其表面的孔径，得到改性的细菌纤维素膜；(2)将改性细菌纤维素膜加入内切菊粉酶溶液中，使内切菊粉酶固定在细菌纤维素膜表面；(3)用0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液冲洗，得到固定化了内切菊粉酶的细菌纤维素膜；(4)将固定化了内切菊粉酶的细菌纤维素膜置于菊粉溶液中，利用内切菊粉酶酶解菊粉，得到低聚果糖溶液。(5)对得到的低聚果糖溶液进行纯化，得到纯度大于90％的低聚果糖。本发明制备的低聚果糖纯度高、杂质少，其中低聚果糖的含量大于99％，具有重要的工业应用前景。

Description

一种利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法

技术领域

本发明属于低聚果糖合成技术领域，具体涉及一种利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法。

背景技术

低聚果糖又称蔗果低聚糖，是由1～3个果糖基通过β(2-1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物；100克干重菊苣中约有60～70克菊粉，菊粉是通过线性的β-2，1-糖苷链连接的果聚糖，其末端为一蔗糖基。故以菊苣粉为原料用菊糖内切酶水解作用，经精制最终可得低聚果糖。

低聚果糖具有良好的保健作用，无毒，适合糖尿病病人使用，可以预防龋齿、调节脂类代谢、促进钙吸收、降低血清胆固醇、抑癌；并可作为双歧杆菌的增殖因子，提高人体的抗病力和免疫力；由于低聚果糖具有水溶性膳食纤维之功能，可作为流变及组织改良剂、水分保持剂等广泛应用于低热量饮料、低脂或非脂涂抹食品、酸乳、冰淇淋、巧克力等食品。

按照我国轻工行业标准将低聚果糖分为普通级低聚果糖(低聚果糖含量为50％左右)和高纯度低聚果糖(低聚果糖含量为90％以上)。普通级低聚果糖中含有50％作用的低聚果糖，还有50％左右的单糖和二糖，主要是果糖、葡萄糖和蔗糖，它们通常对人体无保健作用，而且对糖尿病人及龋齿患者并不适用。另外，普通级低聚果糖比高纯度低聚果糖热之高，对肥胖人群和特定患者群体不利。普通级低聚果糖具有较强吸湿性，不能用真空干燥或喷雾干燥法制成粉剂或颗粒，进一步限制了其应用范围。普通级低聚果糖由于副产物(葡萄糖和蔗糖)的存在而对其生理功效、营养价值以及应用范围等方面打折折扣，因而高纯度低聚果糖的制备越来越受到人们的关注。

细菌纤维素具有较高的机械强度、热稳定性、良好的生物相容性以及无毒性，使其可以广泛应用与固定化酶和固定化细胞技术领域，但是，目前还有利用细菌纤维素为载体固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的报道。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，该方法包括如下步骤：

(1)对细菌纤维素膜的表面进行预处理，扩大细菌纤维素膜表面的孔径，得到改性的细菌纤维素膜；

(2)将步骤(1)得到的改性细菌纤维素膜加入内切菊粉酶溶液中，使内切菊粉酶固定在细菌纤维素膜表面；

(3)将细菌纤维素膜从内切菊粉酶溶液中取出，用0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液冲洗，得到固定化了内切菊粉酶的细菌纤维素膜；

(4)将步骤(3)得到的固定化了内切菊粉酶的细菌纤维素膜置于菊粉溶液中，利用内切菊粉酶酶解菊粉，得到低聚果糖溶液。

(5)对步骤(4)得到的低聚果糖溶液进行纯化，得到纯度大于90％的低聚果糖。

步骤(1)中，所述的对细菌纤维素膜的表面进行预处理，按如下方法进行：

将细菌纤维素膜按5g/L～10g/L加入吡啶中，搅拌均匀，再加入硫酸，细菌纤维素与硫酸的比例为0.5～2g：100ml，反应，制备得到改性的细菌纤维素膜。

其中，反应的温度为50～120℃，反应时间为1～3h，优选110℃反应1h。

步骤(2)中，所述内切菊粉酶溶液中，其内切菊粉酶的含量为1000～5000U/L。

步骤(2)中，所述的使内切菊粉酶固定在细菌纤维素膜表面，是在0～4℃条件下静置1～24h，使内切菊粉酶吸附在细菌纤维素表面。

步骤(4)中，将固定化了内切菊粉酶的细菌纤维素膜按0.1～2g/L置于菊粉溶液中。

其中，酶解菊粉的反应温度为15～45℃，反应时间为1～36h。

步骤(5)中，所述的纯化，是利用纳滤膜对得到的低聚果糖溶液进行纳滤纯化。

其中，所述的纳滤膜为孔径为0.3～0.6nm的纤维素膜。

其中，利用纤维素膜纯化时的条件为通量150～200L/m³·h、压力0.5～1MPa、pH7.2。

有益效果：

(1)本发明先对细菌纤维素表面进行了改性预处理，使细菌纤维素表面更有利于吸附内切菊粉酶。

(2)本发明利用固定化在细菌纤维素表面的内切菊粉酶处理菊粉溶液，得到的反应液中，低聚果糖的含量高，同时固定化载体的重复利用率也比较高。

(3)本发明得到的低聚果糖纯度高、杂质少，其中低聚果糖的含量大于90％。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：细菌菌纤维素表面与处理。

将细菌纤维素膜按5g/L～10g/L加入吡啶中，搅拌均匀，再加入硫酸，细菌纤维素与硫酸的比例为0.5～2g：100ml，在110℃条件下反应1h，制备得到改性的细菌纤维素膜。

实施例2：内切菊粉酶的含量对固定化效果的影响。

将实施例1得到的改性细菌纤维素膜按0.5g/L加入内切菊粉酶溶液中，内切菊粉酶溶液中内切菊粉酶的含量设为：1000U/L、2000U/L、3000U/L、4000U/L、5000U/L。固定化的温度为4℃，反应时间为12h。固定化结束后将固定化了内切菊粉酶的细菌纤维素膜置于20g/L的菊粉溶液中，在32℃条件下反应12h，结果如表1所示。

表1内切菊粉酶的含量对固定化效果的影响

酶量	1000U/L	2000U/L	3000U/L	4000U/L	5000U/L
						低聚果糖产率	52％	73％	82％	86％	85％

实施例3：固定化时间对固定化效果的影响。

实验方法同实施例2，所不同的是，内切菊粉酶溶液中内切菊粉酶的含量设为：3000U/L。固定化时间设为3h、6h、12h、18h、24h。随着固定化时间的延长，12h时低聚果糖产率达到最高，12h后低聚果糖产率开始下降。

表2固定化时间对固定化效果的影响

时间	3h	6h	12h	18h	24h
						低聚果糖产率	40％	60％	88％	72％	65％

当固定化时间为12h，0.25L的体系中，总酶活为750U，固定化酶的总活性为500U，酶活回收率为67％。

实施例4：固定化酶的酶解温度对低聚果糖产率的影响。

实验方法同实施例2，所不同的是，内切菊粉酶溶液中内切菊粉酶的含量设为：3000U/L。固定化结束后将酶解菊粉的反应温度设为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。

表3酶解温度对低聚果糖产率的影响

温度

15℃

20℃

25℃

30℃

35℃

40℃

低聚果糖产率

33％

39％

58％

86％

77％

60％

实施例5：固定化酶的酶解时间对低聚果糖产率的影响。

实验方法同实施例2，所不同的是，内切菊粉酶溶液中内切菊粉酶的含量设为：3000U/L。固定化结束后将酶解菊粉的反应时间设为6h、12h、18h、24h、30h、36h。

表4酶解时间对低聚果糖产率的影响

时间

6h

12h

18h

24h

30h

36h

低聚果糖产率

70％

85％

88％

86％

75％

73％

实施例6：经纳滤膜处理后提取液中低聚果糖的含量。

实验方法同实施例2，所不同的是，内切菊粉酶溶液中内切菊粉酶的含量设为：

3000U/L。最终得到的低聚果糖溶液用孔径为0.3～0.6nm的纤维素膜处理。利用纤维素膜纯化时的条件为通量180L/m³·h、压力0.8MPa、pH7.2。结果如表5所示。

表5纳滤膜处理后低聚果糖含量

	单糖(％)	二糖(％)	低聚果糖(％)
				纳滤前	6	9	85
纳滤后	0	<1	99

实施例7：固定化酶的重复使用稳定性。

利用实施例2中的方法，制备吸附了内切菊粉酶的细菌纤维素膜，将该细菌纤维素膜重复置于菊粉溶液中，一共反应6次，每一次反应的条件为30℃、6h。实验结果见表6，从表6中可以看出，随着固定化酶使用次数的增加，低聚果糖的产率逐渐降低，但是，使用到第6次时仍有大于43％的产率。

表6固定化酶的重复使用稳定性

次数	1	2	3	4	5	6
							低聚果糖产率	70％	72％	63％	50％	45％	43％

Claims

1.一种利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的对细菌纤维素膜的表面进行预处理，按如下方法进行：

3.根据权利要求2所述的利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，反应的温度为50～120℃，反应时间为1～3h。

4.根据权利要求1所述的利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述内切菊粉酶溶液中，其内切菊粉酶的含量为1000～5000U/L。

5.根据权利要求1所述的利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的使内切菊粉酶固定在细菌纤维素膜表面，是在0～4℃条件下静置1～24h，使内切菊粉酶吸附在细菌纤维素表面。

6.根据权利要求1所述的利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，步骤(4)中，将固定化了内切菊粉酶的细菌纤维素膜按0.1～2g/L置于菊粉溶液中。

7.根据权利要求6所述的利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，酶解菊粉的反应温度为15～45℃，反应时间为1～36h。

8.根据权利要求1所述的利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的纯化，是利用纳滤膜对得到的低聚果糖溶液进行纳滤纯化。

9.根据权利要求8所述的利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，所述的纳滤膜为孔径为0.3～0.6nm的纤维素膜。

10.根据权利要求9所述的利用细菌纤维素固定化内切菊粉酶生产低聚果糖的方法，其特征在于，利用纤维素膜纯化时的条件为通量150～200L/m³·h、压力0.5～1MPa、pH7.2。