CN108484692B - 一种从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法 - Google Patents

一种从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵产物提取技术领域，具体涉及一种从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法。本发明所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，在现有技术中使用阳离子交换树脂进行氨基葡萄糖提取方法的基础上，通过对平衡活化树脂的缓冲液进行改进，有效提高了树脂对氨基葡萄糖的吸附效率，同时有效缩短了树脂的饱和吸附时间，降低了吸附处理的时间，有效提高了吸附效率。同时，通过对现有方法中洗脱液的改进，添加的甘氨酸能有效促进氨基与树脂的连接，有助于将目标产物氨基葡萄糖洗脱，有效提高了解吸附过程的效率，从而从整体上改善了发酵液中氨基葡萄糖的提取率。

Description

一种从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵产物提取技术领域，具体涉及一种从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法。
背景技术
氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)又称氨糖、氨基葡糖或葡糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是一种重要的功能单糖，也是第一个被确认结构的氨基单糖。氨糖易溶于水及亲水性溶剂，以其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)经酸解可得到氨基葡萄糖。GlcN几乎存在于所有机体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物体，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分，同时也是壳聚糖和甲壳素的主要组成成分。
氨基葡萄糖在医药、食品和保健等领域均具有广泛应用。由于氨糖能特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞正常的代谢功能，能刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，抑制损伤软骨的酶，延缓骨性关节炎的病理过程和疾病的进展，改善关节活动，缓解疼痛，因此在临床上被大量用于骨关节炎的治疗。此外，氨基葡萄糖在体内也具有重要的生理作用，如具有肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；也能作为抗菌消炎药物，治疗胃溃疡等。再者，由于GlcN对人体没有毒性，被视作天然无害的食品及保健品配料，日本和美国均将其作为食品配料广泛使用；由于氨糖有助于刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生，常被用作婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分。同时氨基葡萄糖也是合成VB6和核黄素中间体的起始原料，是一种新型生化药品、药物中间体和高档化妆品的添加剂。
目前，GlcN工业化生产的方法主要可以分为三种：酸水解法、酶解法以及微生物发酵法。酸水解法以及酶解法的生产原料主要为虾蟹的外骨骼，主要是从虾蟹壳中提取甲壳素与壳聚糖，再经酸解或者酶解获得目标产物GlcN。但是酸水解法以及酶解法自身存在着诸如原材料来源限制、水解过程的酸会污染环境、生产效率低下等问题，严重制约了氨基葡萄糖产业的发展。而微生物发酵法生产不受资源限制，对环境污染小，产品无鱼腥味，不存在过敏效应，因此，国内外学者不断探索寻求利用微生物发酵法高效生产GlcN的方法。
近年来，国内外研究人员从生化工程和代谢工程两个方面对微生物生产氨基葡萄糖的菌株及工艺进行了系统性地研究。目前已知的发酵生产氨糖的菌株主要集中在真菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。对GlcN的生物合成研究表明：在大肠杆菌中，由谷氨酰胺作为氨基供体，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖合成酶(GlmS)的催化作用下，生成GlcN。现有技术中已开发出多种能高效发酵氨基葡萄糖的基因工程菌，使得氨基葡萄糖的发酵量日益提高。
但是，微生物发酵法制备氨基葡萄糖工艺中，除了发酵菌株的活力外，发酵液中目标产物的高效提取也是氨基葡萄糖发酵工艺中的一个难题。在现有实际发酵生产中，氨基葡萄糖与大量杂质混合在一起，如发酵未消耗完的原料，生产过程中的副产物等，都限制了目标产物的提取，这也成为了限制微生物发酵生产氨糖工艺的技术难题。现有技术中开发除了诸如以强酸性阳离子交换树脂对发酵液中氨基葡萄糖进行离子交换提取的工艺，但一方面其吸附率仅能达到80％左右，另外，其达到饱和吸附的时间需要8h左右，导致提取周期较长。因此，如何从发酵液中高效提取氨基葡萄糖也成为氨糖发酵工艺中亟待解决的问题。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，以解决现有技术中发酵液中氨基葡萄糖提取率较低的问题。
为解决上述技术问题，本发明所述的一种从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：
(1)取含氨基葡萄糖发酵液离心去除菌体，收集上清液，备用；
(2)取强酸性阳离子交换树脂置于缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为添加有EDTA-Na的柠檬酸-Na2HPO4溶液；
(3)利用活化后的所述强酸性阳离子交换树脂对步骤(1)中的上清液进行吸附提取；并以添加有甘氨酸的硫酸铵溶液为洗脱液进行解吸附洗脱；
(4)收集洗脱液经结晶、浓缩，得到氨基葡萄糖纯品。
所述强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂001×8。
所述步骤(2)中，所述EDTA-Na与所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的添加比例为1-2g/L。
所述步骤(2)中，所述柠檬酸-Na2HPO4溶液的pH为2-2.5。
所述步骤(3)中，所述甘氨酸与所述硫酸铵溶液的添加比例为3-5g/L。
所述步骤(3)中，所述硫酸铵溶液的浓度为0.5-1.0mol/L。
所述步骤(3)中，所述发酵液的进样流速为3-3.3BV/h，所述洗脱液的流速为3.5-4BV/h。
所述步骤(3)中，所述吸附步骤的温度为25-35℃。
所述步骤(1)中，还包括以硅藻土对所述上清液进行吸附并过滤的步骤。
所述步骤(1)中，在所述离心步骤前，还包括在所述发酵液中加入0.1mol/L盐酸使N-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基的步骤。
本发明所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，在现有技术中使用阳离子交换树脂进行氨基葡萄糖提取方法的基础上，通过对平衡活化树脂的缓冲液进行改进，有效提高了树脂对氨基葡萄糖的吸附效率，同时有效缩短了树脂的饱和吸附时间，降低了吸附处理的时间，有效提高了吸附效率。同时，通过对现有方法中洗脱液的改进，添加的甘氨酸能有效促进氨基与树脂的连接，有助于将目标产物氨基葡萄糖洗脱，有效提高了解吸附过程的效率，从而从整体上改善了发酵液中氨基葡萄糖的提取率。
本发明还公开了一种高密度培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，其通过利用现有技术中常规的大肠杆菌为发酵菌株，并通过对种子培养基以及发酵培养基的优化，有效提高了大肠杆菌的菌量，同时在无需对菌株进行基因工程改造的情况下，有效提高了发酵液中氨基葡萄糖的含量。
本发明公开的高密度培养大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖的方法，在现有种子培养基的基础上，添加甘氨酸进行种子液培养，有助于提高发酵菌株的发酵活力，使得大肠杆菌在后续发酵过程中获得更高的菌种密度，并累计更多的目标产物，所得目标产物的发酵量与现有技术基因工程菌的发酵量近似甚至更高。
本发明所述方法在现有发酵培养基的基础上，通过添加甘氨酸硝酸盐，能有效降低目标产物氨基葡萄糖对菌株的刺激作用，有助于目标产物的胞外积累，而甘露糖醇的添加则有助于提高菌株的发酵密度，同时能有效提高氨基葡萄糖的含量，所得目标产物的发酵量与现有技术基因工程菌的发酵量近似甚至更高。
具体实施方式
本发明下述实施例中，所述柠檬酸-Na2HPO4溶液的配制按照现有技术方法即可，以pH2.2的柠檬酸-Na2HPO4溶液为例，其配制方法为：称取柠檬酸8.416g溶于400mL水，称取Na2HPO4.12H2O1.432g溶于20L水，调节pH为2.2即可。其他pH值的柠檬酸-Na2HPO4溶液的配制参照上述过程，并进行适应性调整即可。
本发明下述实施例中，所述硫酸铵溶液的配制按照现有技术方法即可，以摩尔浓度0.7mol/L的溶液为例，称取23.125g硫酸铵溶于250mL水混匀即可。
本发明下述实施例中所用强酸性阳离子交换树脂选用苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂001×8，其在使用前需要进行预处理，具体包括：用去离子水进行浸泡12h后，反复洗涤树脂直至出水清晰、无细碎树脂为止；再用约2倍树脂体积的4％的盐酸溶液浸泡树脂4h，倾出酸液，用去离子水洗至出水呈中性；然后用约2倍树脂体积的4％左右的氢氧化钠溶液浸泡树脂4h左右，倾出碱液，用去离子水洗至出水呈中性；再用约2倍树脂体积的4％盐酸溶液浸泡树脂4h，用去离子水洗至出水呈中性，并将与处理好的树脂贮存，备用。
实施例1
本实施例中提取所述氨基葡萄糖的发酵液为按照现有技术方法发酵获得，即以大肠杆菌BL21进行发酵获得含有氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖的发酵液。所述培养基及培养条件可参照江南大学梁芳《氨基葡萄糖的发酵中试放大和提取工艺研究》中记载的培养方法。
本实施例所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，具体包括如下步骤：
(1)取含氨基葡萄糖发酵液加入0.1mol/L盐酸使N-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基；并取上述处理后的发酵液进行高速离心以去除菌体，收集上清液，并加入硅藻土(质量比为100：4)以去除发酵液中含有的色素等杂质，离心过滤除去硅藻土，得到澄清发酵液，备用；经检测，所述发酵液中含有氨基葡萄糖的含量为32.7g/L；
(2)取预处理后的10g强酸性阳离子交换树脂001×8，置于75ml缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为添加有EDTA-Na的pH2.0的柠檬酸-Na2HPO4溶液；所述EDTA-Na与所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的添加比例为1g/L；充分平衡后(约30min)倾去缓冲液；
(3)利用上述活化后的所述强酸性阳离子交换树脂进行装柱，树脂柱型号为Φ1cm×10cm，装入6g上述平衡后的树脂001×8，制成树脂柱；以步骤(1)中处理好的发酵液1L进行上样吸附，控制吸附温度30℃，发酵液的进样流速为3BV/h；
吸附后并以添加有甘氨酸的硫酸铵溶液为洗脱液进行解吸附洗脱，控制所述洗脱液的流速为3.5BV/h；所述硫酸铵溶液的摩尔浓度为0.5mol/L，所述甘氨酸与所述硫酸铵溶液的添加比例为5g/L；
(4)收集洗脱液，并按照现有技术常规方法进行结晶、浓缩，得到氨基葡萄糖纯品。
实施例2
本实施例中提取所述氨基葡萄糖的发酵液与实施例1中相同。
本实施例所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，具体包括如下步骤：
(1)取含氨基葡萄糖发酵液加入0.1mol/L盐酸使N-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基；并取上述处理后的发酵液进行高速离心以去除菌体，收集上清液，并加入硅藻土(质量比为100：4)以去除发酵液中含有的色素等杂质，离心过滤除去硅藻土，得到澄清发酵液，备用；经检测，所述发酵液中含有氨基葡萄糖的含量为32.7g/L；
(2)取预处理后的10g强酸性阳离子交换树脂001×8，置于75ml缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为添加有EDTA-Na的pH2.5的柠檬酸-Na2HPO4溶液；所述EDTA-Na与所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的添加比例为2g/L；充分平衡后(约30min)倾去缓冲液；
(3)利用上述活化后的所述强酸性阳离子交换树脂进行装柱，树脂柱型号为Φ1cm×10cm，装入6g上述平衡后的树脂001×8，制成树脂柱；以步骤(1)中处理好的发酵液1L进行上样吸附，控制吸附温度30℃，发酵液的进样流速为3.3BV/h；
吸附后并以添加有甘氨酸的硫酸铵溶液为洗脱液进行解吸附洗脱，控制所述洗脱液的流速为4BV/h；所述硫酸铵溶液的摩尔浓度为1.0mol/L，所述甘氨酸与所述硫酸铵溶液的添加比例为3g/L；
(4)收集洗脱液，并按照现有技术常规方法进行结晶、浓缩，得到氨基葡萄糖纯品。
实施例3
本实施例中提取所述氨基葡萄糖的发酵液与实施例1中相同。
本实施例所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，具体包括如下步骤：
(1)取含氨基葡萄糖发酵液加入0.1mol/L盐酸使N-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基；并取上述处理后的发酵液进行高速离心以去除菌体，收集上清液，并加入硅藻土(质量比为100：4)以去除发酵液中含有的色素等杂质，离心过滤除去硅藻土，得到澄清发酵液，备用；经检测，所述发酵液中含有氨基葡萄糖的含量为32.7g/L；
(2)取预处理后的10g强酸性阳离子交换树脂001×8，置于75ml缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为添加有EDTA-Na的pH2.2的柠檬酸-Na2HPO4溶液；所述EDTA-Na与所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的添加比例为1.5g/L；充分平衡后(约30min)倾去缓冲液；
(3)利用上述活化后的所述强酸性阳离子交换树脂进行装柱，树脂柱型号为Φ1cm×10cm，装入6g上述平衡后的树脂001×8，制成树脂柱；以步骤(1)中处理好的发酵液1L进行上样吸附，控制吸附温度30℃，发酵液的进样流速为3.19BV/h；
吸附后并以添加有甘氨酸的硫酸铵溶液为洗脱液进行解吸附洗脱，控制所述洗脱液的流速为3.8BV/h；所述硫酸铵溶液的摩尔浓度为1.0mol/L，所述甘氨酸与所述硫酸铵溶液的添加比例为4g/L；
(4)收集洗脱液，并按照现有技术常规方法进行结晶、浓缩，得到氨基葡萄糖纯品。
实施例4
本实施例中提取所述氨基葡萄糖的发酵液为按照如下步骤获得：
(1)将经过所述LB平板培养基活化培养的大肠杆菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为35℃，控制摇床转速200rpm，培养时间为10h，得到种子液；
所述种子培养基包括：蛋白胨10g/L，酵母膏25g/L，甘油2g/L，甘氨酸8g/L，生物素0.1g/L，调pH7.0-7.2；
(2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为35℃，搅拌速度为300rpm，通气量为1.2vvm，培养时间为40h，得到含氨基葡萄糖的发酵液；
所述发酵培养基包括：葡萄糖25g/L，酵母膏25g/L，无氨基氮源8g/L，甘露糖醇10g/L，乳酸钠3g/L，甘氨酸硝酸盐8g/L，MgSO4.7H2O 0.4g/L，K2HPO4 1.2g/L，(NH4)2SO4 2g/L，FeSO4.7H2O 0.6mg/L，调pH7.0-7.2；
发酵过程中取样检测发酵液的OD660，当OD660＝2.0时，开始进行补料培养基补料，所述补料培养基包括：葡萄糖500g/L，半乳聚糖60g/L，控制补料速率为6L/h。
本实施例所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，具体包括如下步骤：
(1)取含氨基葡萄糖发酵液加入0.1mol/L盐酸使N-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基；并取上述处理后的发酵液进行高速离心以去除菌体，收集上清液，并加入硅藻土(质量比为100：4)以去除发酵液中含有的色素等杂质，离心过滤除去硅藻土，得到澄清发酵液，备用；经检测，所述发酵液中含有氨基葡萄糖的含量为77.8g/L；
(2)取预处理后的10g强酸性阳离子交换树脂001×8，置于75ml缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为添加有EDTA-Na的pH2.0的柠檬酸-Na2HPO4溶液；所述EDTA-Na与所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的添加比例为1g/L；充分平衡后(约30min)倾去缓冲液；
(3)利用上述活化后的所述强酸性阳离子交换树脂进行装柱，树脂柱型号为Φ1cm×10cm，装入6g上述平衡后的树脂001×8，制成树脂柱；以步骤(1)中处理好的发酵液1L进行上样吸附，控制吸附温度30℃，发酵液的进样流速为3BV/h；
吸附后并以添加有甘氨酸的硫酸铵溶液为洗脱液进行解吸附洗脱，控制所述洗脱液的流速为3.5BV/h；所述硫酸铵溶液的摩尔浓度为0.5mol/L，所述甘氨酸与所述硫酸铵溶液的添加比例为5g/L；
(4)收集洗脱液，并按照现有技术常规方法进行结晶、浓缩，得到氨基葡萄糖纯品。
实施例5
本实施例中提取所述氨基葡萄糖的发酵液为按照如下步骤获得：
(1)将经过所述LB平板培养基活化培养的大肠杆菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为37℃，控制摇床转速220rpm，培养时间为10h，得到种子液；
所述种子培养基包括：蛋白胨20g/L，酵母膏15g/L，甘油4g/L，甘氨酸3g/L，生物素0.3g/L，调pH7.0-7.2；
(2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为37℃，搅拌速度为250rpm，通气量为1.8vvm，培养时间为40h，得到含氨基葡萄糖的发酵液；
所述发酵培养基包括：葡萄糖35g/L，酵母膏15g/L，无氨基氮源12g/L，甘露糖醇6g/L，乳酸钠8g/L，甘氨酸硝酸盐3g/L，MgSO4.7H2O 0.8g/L，K2HPO4 0.8g/L，(NH4)2SO4 4g/L，FeSO4.7H2O 0.4mg/L，调pH7.0-7.2；
发酵过程中取样检测发酵液的OD660，当OD660＝2.0时，开始进行补料培养基补料，所述补料培养基包括：葡萄糖600g/L，半乳聚糖100g/L，控制补料速率为5L/h。
本实施例所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，具体包括如下步骤：
(1)取含氨基葡萄糖发酵液加入0.1mol/L盐酸使N-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基；并取上述处理后的发酵液进行高速离心以去除菌体，收集上清液，并加入硅藻土(质量比为100：4)以去除发酵液中含有的色素等杂质，离心过滤除去硅藻土，得到澄清发酵液，备用；经检测，所述发酵液中含有氨基葡萄糖的含量为79.2g/L；
(2)取预处理后的10g强酸性阳离子交换树脂001×8，置于75ml缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为添加有EDTA-Na的pH2.5的柠檬酸-Na2HPO4溶液；所述EDTA-Na与所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的添加比例为2g/L；充分平衡后(约30min)倾去缓冲液；
(3)利用上述活化后的所述强酸性阳离子交换树脂进行装柱，树脂柱型号为Φ1cm×10cm，装入6g上述平衡后的树脂001×8，制成树脂柱；以步骤(1)中处理好的发酵液1L进行上样吸附，控制吸附温度30℃，发酵液的进样流速为3.3BV/h；
吸附后并以添加有甘氨酸的硫酸铵溶液为洗脱液进行解吸附洗脱，控制所述洗脱液的流速为4BV/h；所述硫酸铵溶液的摩尔浓度为1.0mol/L，所述甘氨酸与所述硫酸铵溶液的添加比例为3g/L；
(4)收集洗脱液，并按照现有技术常规方法进行结晶、浓缩，得到氨基葡萄糖纯品。
实施例6
本实施例中提取所述氨基葡萄糖的发酵液为按照如下步骤获得：
(1)将经过所述LB平板培养基活化培养的大肠杆菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为35℃，控制摇床转速220rpm，培养时间为10h，得到种子液；
所述种子培养基包括：蛋白胨15g/L，酵母膏20g/L，甘油3g/L，甘氨酸5g/L，生物素0.2g/L，调pH7.0-7.2；
(2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为32℃，搅拌速度为280rpm，通气量为1.5vvm，培养时间为42h，得到含氨基葡萄糖的发酵液；
所述发酵培养基包括：葡萄糖30g/L，酵母膏20g/L，无氨基氮源10g/L，甘露糖醇8g/L，乳酸钠5g/L，甘氨酸硝酸盐5g/L，MgSO4.7H2O 0.6g/L，K2HPO4 1.0g/L，(NH4)2SO4 3g/L，FeSO4.7H2O 0.5mg/L，调pH7.0-7.2；
发酵过程中取样检测发酵液的OD660，当OD660＝2.0时，开始进行补料培养基补料，所述补料培养基包括：葡萄糖550g/L，半乳聚糖80g/L，控制补料速率为5.5L/h。
本实施例所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，具体包括如下步骤：
(1)取含氨基葡萄糖发酵液加入0.1mol/L盐酸使N-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基；并取上述处理后的发酵液进行高速离心以去除菌体，收集上清液，并加入硅藻土(质量比为100：4)以去除发酵液中含有的色素等杂质，离心过滤除去硅藻土，得到澄清发酵液，备用；经检测，所述发酵液中含有氨基葡萄糖的含量为81.5g/L；
(2)取预处理后的10g强酸性阳离子交换树脂001×8，置于75ml缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为添加有EDTA-Na的pH2.2的柠檬酸-Na2HPO4溶液；所述EDTA-Na与所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的添加比例为1.5g/L；充分平衡后(约30min)倾去缓冲液；
(3)利用上述活化后的所述强酸性阳离子交换树脂进行装柱，树脂柱型号为Φ1cm×10cm，装入6g上述平衡后的树脂001×8，制成树脂柱；以步骤(1)中处理好的发酵液1L进行上样吸附，控制吸附温度30℃，发酵液的进样流速为3.19BV/h；
吸附后并以添加有甘氨酸的硫酸铵溶液为洗脱液进行解吸附洗脱，控制所述洗脱液的流速为3.8BV/h；所述硫酸铵溶液的摩尔浓度为1.0mol/L，所述甘氨酸与所述硫酸铵溶液的添加比例为4g/L；
(4)收集洗脱液，并按照现有技术常规方法进行结晶、浓缩，得到氨基葡萄糖纯品。
对比例1
本实施例所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法同实施例3，其区别仅在于，所述缓冲液为pH2.2的柠檬酸-Na2HPO4溶液，所述洗脱液为0.7mol/L的硫酸铵溶液。
对比例2
本实施例所述从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法同实施例6，其区别仅在于，所述缓冲液为pH2.2的柠檬酸-Na2HPO4溶液，所述洗脱液为0.7mol/L的硫酸铵溶液。
实验例
1、饱和吸附时间
取预处理后的10g强酸性阳离子交换树脂001×8，置于75ml缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为添加有EDTA-Na的pH2.2的柠檬酸-Na2HPO4溶液；所述EDTA-Na与所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的添加比例为1.5g/L；充分平衡后(约30min)倾去缓冲液，备用。
另取预处理后的10g强酸性阳离子交换树脂001×8，置于75ml缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为pH2.2的柠檬酸-Na2HPO4溶液；充分平衡后(约30min)倾去缓冲液，作为对照，备用。
分别取上述平衡后的树脂2g加入100ml三角瓶中，加入35ml实施例1中处理后的发酵液，放在37℃、180r/min的摇床上，间隔取样测定其在的氨基葡萄糖浓度，得到树脂吸附氨基葡萄糖的饱和时间。
经测定，本发明所述缓冲液平衡处理后的树脂，其饱和吸附时间为4h，而对照例中按现有技术缓冲液处理的树脂其饱和吸附时间为8h左右。可见，本发明所述缓冲液有助于提升树脂的吸附性能。
2、吸附率
分别测定上述实施例1-6及对比例1-2中收集的洗脱液中含有的氨基葡萄糖的含量，并计算其提取率，记录于下表1。
表1提取率结果
编号 氨基葡萄糖含量/g 提取率/％
实施例1 31.5 96.3
实施例2 31.2 95.5
实施例3 31.9 97.7
实施例4 74.8 96.2
实施例5 75.5 95.3
实施例6 79.5 97.5
对比例1 25.6 78.2
对比例2 63.2 77.6
从上表数据可知，本发明所述提取方法中，通过对平衡树脂的缓冲液和洗脱液的改性，使得现有技术常规使用的阳离子交换树脂的吸附效率和洗脱效率都有提高，有效改善了发酵液中氨基葡萄糖的提取率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取含氨基葡萄糖发酵液离心去除菌体，收集上清液，备用；
(2)取强酸性阳离子交换树脂置于缓冲液中进行活化平衡处理；所述缓冲液为添加有EDTA-Na的柠檬酸-Na2HPO4溶液；
(3)利用活化后的所述强酸性阳离子交换树脂对步骤(1)中的上清液进行吸附提取；并以添加有甘氨酸的硫酸铵溶液为洗脱液进行解吸附洗脱；
(4)收集洗脱液经结晶、浓缩，得到氨基葡萄糖纯品。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述强酸性阳离子交换树脂为苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂001×8。
3.根据权利要求1或2所述的从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述EDTA-Na与所述柠檬酸-Na2HPO4缓冲液的添加比例为1-2g/L。
4.根据权利要求3所述的从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述柠檬酸-Na2HPO4溶液的pH为2-2.5。
5.根据权利要求4所述的从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述甘氨酸与所述硫酸铵溶液的添加比例为3-5g/L。
6.根据权利要求5所述的从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述硫酸铵溶液的浓度为0.5-1.0mol/L。
7.根据权利要求6所述的从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述发酵液的进样流速为3-3.3BV/h，所述洗脱液的流速为3.5-4BV/h。
8.根据权利要求7所述的从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述吸附步骤的温度为25-35℃。
9.根据权利要求8所述的从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，还包括以硅藻土对所述上清液进行吸附并过滤的步骤。
10.根据权利要求9所述的从发酵液中高效提取氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在所述离心步骤前，还包括在所述发酵液中加入0.1mol/L盐酸使N-乙酰氨基葡萄糖脱去乙酰基的步骤。
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