CN108624638B - 一种发酵生产氨基葡萄糖的方法 - Google Patents

一种发酵生产氨基葡萄糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，属于发酵工程技术领域。本发明的方法通过将大肠杆菌接种于含有丙酮酸、氨基酸和/或肌醇的发酵培养基中进行发酵培养，大幅度提高了大肠杆菌生产氨基葡萄糖的产量；利用本发明的方法，可成功将大肠杆菌生产氨基葡萄糖的产量从22g/L提高至59g/L。

Description

一种发酵生产氨基葡萄糖的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
氨基葡萄糖(Glucosamine，GlcN)又称氨糖、氨基葡糖或葡糖胺，是葡萄糖的一个羟基被氨基取代后的化合物，是一种重要的功能单糖，也是第一个被确认结构的氨基单糖。氨糖易溶于水及亲水性溶剂，以其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)经酸解可得到氨基葡萄糖。GlcN几乎存在于所有机体中，包括细菌、酵母、丝状真菌、植物以及动物体，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要组成成分，同时也是壳聚糖和甲壳素的主要组成成分。
氨基葡萄糖在医药、食品和保健等领域均具有广泛应用。例如，由于氨糖能特异性地作用于关节软骨，恢复软骨细胞正常的代谢功能，刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，抑制损伤软骨的酶，延缓骨性关节炎的病理过程和疾病的进展，改善关节活动，缓解疼痛，因此，氨基葡萄糖在临床上被大量用于骨关节炎的治疗；此外，氨基葡萄糖在体内也具有重要的生理作用，如具有肝肾解毒，发挥抗炎、护肝的作用；也能作为抗菌消炎药物，治疗胃溃疡等；再者，由于GlcN对人体没有毒性，被视作天然无害的食品及保健品配料，日本和美国均将其作为食品配料广泛使用，尤其氨糖有助于刺激婴儿肠道中双歧杆菌的增生，常被用作婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分；同时，氨基葡萄糖也是合成VB6和核黄素中间体的起始原料，是一种新型生化药品、药物中间体和高档化妆品的添加剂。
目前，GlcN工业化生产的方法主要可以分为三种：酸水解法、酶解法以及微生物发酵法。其中，酸水解法以及酶解法的生产原料主要为虾蟹的外骨骼，主要是从虾蟹壳中提取甲壳素与壳聚糖，再经酸解或者酶解获得目标产物GlcN，但是，酸水解法以及酶解法自身存在着诸如原材料来源限制、水解过程的酸会污染环境、生产效率低下等问题，严重制约了氨基葡萄糖产业的发展；而微生物发酵法生产不受资源限制，对环境污染小，产品无鱼腥味，不存在过敏效应，因此，国内外学者不断探索寻求利用微生物发酵法高效生产GlcN的方法。
大肠杆菌是一种较为常见的氨基葡萄糖合成酶生产菌。研究表明：在大肠杆菌中，由谷氨酰胺作为氨基供体，6-磷酸果糖在氨基葡萄糖合成酶(GlmS)的催化作用下，生成GlcN。
但是，在直接以野生型大肠杆菌株进行氨糖发酵生产的工艺中，由于氨基葡萄糖对大肠杆菌具有一定的刺激作用，对大肠杆菌的生长具有较大的抑制作用，因此，都存在着菌株发酵密度较低导致氨糖生产量较低的问题，进而影响了目标产物氨基葡萄糖的胞外积累量，这也成为了限制微生物发酵生产氨糖工艺的技术难题。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种发酵生产氨基葡萄糖的方法。此方法通过将大肠杆菌接种于含有丙酮酸、氨基酸和/或肌醇的发酵培养基中进行发酵培养，大幅度提高了大肠杆菌生产氨基葡萄糖的产量；利用此方法，可成功将大肠杆菌生产氨基葡萄糖的产量从22g/L提高至59g/L。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，所述方法为将大肠杆菌接种于含有丙酮酸和/或氨基酸和/或肌醇的发酵培养基中进行发酵培养，得到氨基葡萄糖；
所述氨基酸包含丝氨酸和/或天冬氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为先将大肠杆菌接种于种子培养基进行种子培养，得到种子液；然后将种子液接种于含有丙酮酸、氨基酸和/或肌醇的发酵培养基中进行发酵培养，得到氨基葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸为天冬氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸在发酵培养基中的添加量为1～3g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸在发酵培养基中的添加量为3～5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述肌醇在发酵培养基中的添加量为0.2～0.5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述丙酮酸在发酵培养基中的添加量为2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述氨基酸在发酵培养基中的添加量为4.5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述肌醇在发酵培养基中的添加量为0.3g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含1～3g/L丙酮酸、3～5g/L氨基酸、0.2～0.5g/L肌醇、15～30g/L酵母粉、3～8g/L甘油、0.5～1g/L K2HPO4、0.1～0.5g/L KH2PO4以及8～15g/L蛋白胨。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含2g/L丙酮酸、4.5g/L氨基酸、0.3g/L肌醇、25g/L酵母粉、6g/L甘油、0.8g/L K2HPO4、0.3g/L KH2PO4以及12g/L蛋白胨。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为6～8。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为7。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含5～12g/L蛋白胨、3～8g/L酵母粉以及5～12g/L NaCl。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的成分包含10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉以及10g/LNaCl。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的pH为6～8。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的pH为7。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的温度为30～40℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的温度为36℃。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的转速为250～350rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的转速为280rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的时间为35～50h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养的时间为40h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的温度为30～40℃。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的温度为36℃。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的转速为180～250rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的转速为200rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的时间为8～15h。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养的时间为10h。
本发明提供了上述一种发酵生产氨基葡萄糖的方法在生产氨基葡萄糖方面的应用。
有益效果：
本发明的方法通过将大肠杆菌接种于含有丙酮酸、氨基酸和/或肌醇的发酵培养基中进行发酵培养，大幅度提高了大肠杆菌生产氨基葡萄糖的产量；利用本发明的方法，可成功将大肠杆菌生产氨基葡萄糖的产量从22g/L提高至59g/L。
具体实施方式
下面结合具体实施例和对比例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的氨基葡萄糖生产菌株为大肠杆菌BL21。
下述实施例中涉及的培养基如下：
种子培养基：10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉以及10g/L NaCl
发酵培养基：25g/L酵母粉、6g/L甘油、0.8g/L K2HPO4、0.3g/L KH2PO4、12g/L蛋白胨
下述实施例中涉及的检测方法如下：
氨基葡糖糖产量检测：使用Morgan-Elson方法进行检测，发酵液中氨基葡萄糖含量为胞外氨基葡萄糖含量与胞内氨基葡萄糖含量之和。
对比例1
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(3)将100mL发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为22g/L。
实施例1
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入2g/L丙酮酸、4.5g/L天冬氨酸、0.3g/L肌醇；
(3)将100mL含有2g/L丙酮酸、4.5g/L天冬氨酸、0.3g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为59g/L。
实施例2
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入2g/L丙酮酸、4.5g/L丝氨酸、0.3g/L肌醇；
(3)将100mL含有2g/L丙酮酸、4.5g/L丝氨酸、0.3g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为52g/L。
实施例3
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入1g/L丙酮酸、3g/L天冬氨酸、0.2g/L肌醇；
(3)将100mL含有1g/L丙酮酸、3g/L天冬氨酸、0.2g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为46g/L。
实施例4
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入1g/L丙酮酸、3g/L丝氨酸、0.2g/L肌醇；
(3)将100mL含有1g/L丙酮酸、3g/L丝氨酸、0.2g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为44g/L。
实施例5
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入3g/L丙酮酸、5g/L天冬氨酸、0.5g/L肌醇；
(3)将100mL含有3g/L丙酮酸、5g/L天冬氨酸、0.5g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为55g/L。
实施例6
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入3g/L丙酮酸、5g/L丝氨酸、0.5g/L肌醇；
(3)将100mL含有3g/L丙酮酸、5g/L丝氨酸、0.5g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为51g/L。
实施例7
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入2g/L丙酮酸、4.5g/L精氨酸、0.3g/L肌醇；
(3)将100mL含有2g/L丙酮酸、4.5g/L精氨酸、0.3g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为38g/L。
实施例8
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入2g/L丙酮酸、4.5g/L赖氨酸、0.3g/L肌醇；
(3)将100mL含有2g/L丙酮酸、4.5g/L赖氨酸、0.3g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为37g/L。
实施例9
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入2g/L丙酮酸、0.3g/L肌醇；
(3)将100mL含有2g/L丙酮酸、0.3g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为33g/L。
实施例10
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入2g/L丙酮酸、4.5g/L赖氨酸；
(3)将100mL含有2g/L丙酮酸、4.5g/L赖氨酸的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为29g/L。
实施例11
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入4.5g/L赖氨酸、0.3g/L肌醇；
(3)将100mL含有4.5g/L赖氨酸、0.3g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为31g/L。
实施例12
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入2g/L丙酮酸；
(3)将100mL含有2g/L丙酮酸的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为25g/L。
实施例13
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入4.5g/L赖氨酸；
(3)将100mL含有4.5g/L赖氨酸的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为28g/L。
实施例14
具体步骤如下：
(1)将50mL种子培养基装于250mL摇瓶中，121℃灭菌20min，从大肠杆菌BL21种子斜面上挑取直径1cm的带有菌体的琼脂块接种到培养基中，36℃、200rpm培养10h，得到种子液；
(2)在发酵培养基中加入0.3g/L肌醇；
(3)将100mL含有0.3g/L肌醇的发酵培养基装于500nL摇瓶中，121℃灭菌20min，以10％的接种量将种子液接种至培养基中，36℃、280rpm培养40h，得到发酵液。
检测发酵液中氨基葡萄糖的产量，产量为27g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法为将大肠杆菌接种于含有丙酮酸和氨基酸和肌醇的发酵培养基中进行发酵培养，得到氨基葡萄糖；所述丙酮酸在发酵培养基中的添加量为1～3g/L，所述氨基酸在发酵培养基中的添加量为3～5g/L，所述肌醇在发酵培养基中的添加量为0.2～0.5g/L；
所述氨基酸为丝氨酸、天冬氨酸中至少一种。
2.如权利要求1所述的一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述方法为先将大肠杆菌接种于种子培养基进行种子培养，得到种子液；然后将种子液接种于含有丙酮酸、氨基酸和肌醇的发酵培养基中进行发酵培养，得到氨基葡萄糖。
3.如权利要求1或2所述的一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分包含1～3g/L丙酮酸、3～5g/L氨基酸、0.2～0.5g/L肌醇、15～30g/L酵母粉、3～8g/L甘油、0.5～1g/L K2HPO4、0.1～0.5g/L KH2PO4以及8～15g/L蛋白胨。
4.如权利要求1或2所述的一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH为6～8。
5.如权利要求3所述的一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH为6～8。
6.如权利要求2所述的一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述种子培养基的成分包含5～12g/L蛋白胨、3～8g/L酵母粉以及5～12g/L NaCl。
7.如权利要求2或6所述的一种发酵生产氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述种子培养基的pH为6～8。
8.权利要求1-7任一所述的一种发酵生产氨基葡萄糖的方法在生产氨基葡萄糖方面的应用。
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