CN112662572A - 一种高产壳聚糖酶的菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水产品废弃物生物加工技术领域，具体涉及一种高产壳聚糖酶菌株及其应用。菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月31日，保藏编号为：CGMCC 21422。本发明利用从土壤中筛选到的高产壳聚糖酶的菌株生产壳聚糖酶，并应用于壳聚糖的降解，相较于目前普遍应用的壳聚糖酶，该菌株产生的壳聚糖酶活性高，应用范围更广(可在多种酸溶液中降解壳聚糖)，更适合于工业化生产壳寡糖。

Description

一种高产壳聚糖酶的菌株及其应用

技术领域

本发明属于水产品废弃物生物加工技术领域，具体涉及一种高产壳聚糖酶菌株及其应用。

背景技术

随着糖生物学的不断深入发展，壳聚糖以及壳寡糖相继被发现，并被研究与开发。由于它们在农业、食品、保健品、医药与医用材料等领域均有很高的利用价值，人们对壳聚糖以及壳寡糖的需求在不断增加。壳寡糖，又叫壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是将壳聚糖经特殊的生物酶技术(也有使用化学降解、微波降解技术的报道)降解得到的一种聚合度在2～20之间寡糖产品，分子量≤3200Da，是水溶性较好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品。它具有壳聚糖所没有的较高溶解度，全溶于水，容易被生物体吸收利用等诸多独特的功能，其作用为壳聚糖的14倍。传统的壳寡糖制备方法一般是以虾壳、蟹壳为原料经过酸、碱、氧化剂处理来获得目标产物，具体过程如下：

虾壳、蟹壳原料→粉碎→酸浸脱钙→水洗过滤→稀碱脱蛋白→氧化脱色→洗涤→浓碱脱酰基→水洗至中性→干燥→壳聚糖→稀酸/氧化降解→透析→冷冻干燥→壳寡糖

传统的酸碱法降解条件较难控制，对环境污染严重，降解产品主要为单糖和双糖，活性较高的寡糖含量较低，生产成本高，产物产量低等弊端。开发环保的、经济的、易于工业化的壳聚糖降解技术是突破壳寡糖制备瓶颈的主要方向。

进20年来，国内外关于壳聚糖的微生物发酵酶解法的研究工作十分活跃。酶降解法与传统的方法相比具有许多优点，其降解过程和降解产物相对分子质量更容易控制，降解条件更温和，反应过程中不需要大量的反应试剂，对环境污染较小。我国每年有大量的虾蟹外壳等物质被直接废弃，开发高产壳聚糖酶的微生物对废弃物二次利用具有极高的价值，随着对微生物产壳聚糖酶的深入研究，今后必定可通过微生物降解开发出高质量的壳寡糖产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产壳聚糖酶菌株及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高产壳聚糖酶的菌株，菌株为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年12月31日，保藏编号为：CGMCC 21422。

一种高产壳聚糖酶的菌株的应用，所述烟曲霉属烟曲霉在降解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

将所述菌株接种于产壳聚糖酶培养基所得培养液与壳聚糖酸溶液混合，混合后25-50℃水域反应12-120小时，即可降解获得不同小分子量的壳寡糖溶液。

所述菌株接种于PDA液体培养基中获得菌株种子培养液；种子培养液按1％-4％(V/V)比例接种于产壳聚糖酶培养基中，25℃-45℃，发酵培养2-14天，获得富含壳聚糖酶的发酵液。

所述壳聚糖酸溶液为壳聚糖、酸和水，其中，酸的添加量0.1％-20％(固体酸W/V；液体酸V/V)，壳聚糖的添加量为0.1％-30％(w/v)；酸溶液为谷氨酸、乳酸、己二酸、乙酰水杨酸、苹果酸、盐酸、乙酸、丁二酸其中的一种或几种的混合。

一种壳聚糖酶的制备方法，含所述菌株的发酵液与壳聚糖酸溶液混合，混合后25-50℃水域反应12-120小时，即可降解获得不同小分子量的壳寡糖溶液；其中，发酵液与壳聚糖酸溶液体积比为按照1：1-10(V/V)。

所述含所述菌株的发酵液为将所述菌株接种于PDA液体培养基中获得菌株种子培养液；种子培养液按1％-4％(V/V)比例接种于产壳聚糖酶培养基中，25℃-45℃，发酵培养2-14天，获得富含壳聚糖酶的发酵液。

所述产壳聚糖酶培养基为，氮源添加量0.1％-5％(W/V)，磷酸氢二钾添加量0.01％-0.5％(W/V)，磷酸二氢钾添加量0.01％-0.5％(W/V)，氯化钠添加量0.1％-2％(W/V)，碳源添加量0.1％-3％(W/V)，余量为水，pH值4.0-7.0，120℃灭菌20分钟后，冷却至室温。

所述氮源为硝酸钾、牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵中的一种或几种的混合；所述碳源为胶体壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、可溶性淀粉、葡萄糖、羧甲基纤维素钠中的一种或几种混合。

所述壳聚糖酸溶液为壳聚糖、酸和水，其中，酸的添加量0.1％-20％(固体酸W/V；液体酸V/V)，壳聚糖的添加量为0.1％-30％(w/v)；酸溶液为谷氨酸、乳酸、己二酸、乙酰水杨酸、苹果酸、盐酸、乙酸、丁二酸其中的一种或几种的混合。

采用本发明方法降解壳聚糖，降解获得不同分子量的壳聚糖在上述条件范围内可调控酸的加入量和反应时间进行处理，即，时间越长、酸量越多所得壳聚糖分子量越小。

本发明所具有的有点：

1.本发明所获得的烟曲霉分离自土壤中，具有培养条件简单，对环境适应能力强，存活能力强等特点。发酵培养后，菌体聚团成菌球，只需简单的滤纸过滤或低速离心既可以从发酵液中去除。

2.本发明所获得的富含壳聚糖酶的烟曲霉发酵液制备过程简单，能耗极低，所需原料种类少，可在25℃左右的室温进行发酵培养。

3.本发明所获得的富含壳聚糖酶的烟曲霉发酵液，壳聚糖酶酶活高，耐高温、耐低温(-20℃-55℃酶不失活)，对壳聚糖的降解能力强，可降解含量接近30％的壳聚糖溶液，可在多种酸溶液中降解壳聚糖，获得多种形式的壳聚糖降解产物，25℃-55℃温度范围内均可降解壳聚糖，降解过程所需能耗低，降解产物应用范围广。

附图说明

图1为本发明实施例提供的筛选菌株16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明实施例2提供的10％浓度壳聚糖降解24小时后聚合度液相图谱。

图3为本发明实施例2提供的10％浓度壳聚糖降解48小时后聚合度液相图谱。

图4为本发明实施例2提供的10％浓度壳聚糖降解72小时后聚合度液相图谱。

图5为本发明实施例3提供的20％浓度壳聚糖降解72小时后聚合度液相图谱。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。

实施例1

将土壤滤液稀释10^-9倍后涂布于PDA固体培养基上获得菌株单菌落，菌株单菌落分别接种于PDA液体培养基中获得菌株种子培养液；种子培养液按1％(V/V)比例接种于产壳聚糖酶培养基中，28℃，发酵培养5天，测发酵液壳聚糖酶酶活，酶活最高的菌株为-2T-2：183U/ml(壳聚糖酶活检测方法参考文献《3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定壳聚糖酶活力的探讨》)。

产壳聚糖酶培养基为，硫酸铵添加量1％(W/V)，磷酸氢二钾添加量0.07％(W/V)，磷酸二氢钾添加量0.03％(W/V)，氯化钠添加量1％(W/V)，葡萄糖添加量0.1(W/V)，胶体壳聚糖添加量1％(W/V)，pH值5.0，120℃灭菌20分钟后，冷却至室温。

菌株-2T-2通过16S rDNA全序列分析确定菌株为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月31日，保藏编号为：CGMCC 21422。

-2T-2的16S rDNA 1290bp

GGCCCGCAAATGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACACCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGATTCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCGAAGTCGAGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACCG

由上述16S rDNA全序列与其他烟曲霉属烟曲霉进行比对，参见下表：

通过对比，该菌株被鉴定为Aspergillus(曲霉属)，为Aspergillus fumigatus(烟曲霉)。其分类单元为：Eukaryota；Fungi；Dikarya；Ascomycota；Pezizomycotina；Eurotiomycetes；Eurotiomycetidae；Eurotiales；Aspergillaceae；Aspergillus.

实施例2

将上述烟曲霉-2T-2培养至PDA固体培养基上置于恒温培养箱中28℃静置24小时，而后将菌株接种于PDA液体培养基中，置于28℃恒温培养箱中培养24小时后，获得菌株种子培养液；种子培养液按1％(V/V)比例接种于产壳聚糖酶培养基中，28℃，发酵培养5天，获得富含壳聚糖酶的烟曲霉发酵液。

产壳聚糖酶培养基为，硫酸铵添加量1.5％(W/V)，磷酸氢二钾添加量0.07％(W/V)，磷酸二氢钾添加量0.03％(W/V)，氯化钠添加量1％(W/V)，葡萄糖添加量0.1(W/V)，壳聚糖粉末(分子量1600000Da)添加量1％(W/V)，余量为水，pH值5.0，120℃灭菌20分钟后，冷却至室温。

配制壳聚糖醋酸溶液为壳聚糖(分子量1600000Da)含量为10％(W/V)，醋酸3％(v/v)，余量为水。将富含壳聚糖酶的烟曲霉发酵液通过抽滤去除菌体后按照发酵液：壳聚糖醋酸溶液＝1:3(V/V)的比例进行混合。在40℃水浴锅中反应24、48、72小时，利用高效液相色谱法测定溶液中被降解的壳聚糖的分子量和聚合度(参见表1-表3)。反应24、48、72小时后，分子量分别为4900Da、2439Da、1389Da，聚合度分别见图2、图3、图4。

表1 10％壳聚糖醋酸溶液降解24小时后聚合度分布

表2 10％壳聚糖醋酸溶液降解48小时后聚合度分布

表3 10％壳聚糖醋酸溶液降解72小时后聚合度分布

实施例3

将上述烟曲霉-2T-2培养至PDA固体培养基上置于恒温培养箱中28℃培养24小时，而后将菌株接种于PDA液体培养基中，置于恒温培养箱28℃培养24小时，获得菌株种子培养液；种子培养液按2％(V/V)比例接种于产壳聚糖酶培养基中，28℃，发酵培养6天，获得富含壳聚糖酶的烟曲霉发酵液。

产壳聚糖酶培养基为，硫酸铵添加量2.5％(W/V)，磷酸氢二钾添加量0.07％(W/V)，磷酸二氢钾添加量0.03％(W/V)，氯化钠添加量1％(W/V)，葡萄糖添加量0.1(W/V)，壳聚糖粉末(分子量1600000Da)添加量1％(W/V)，余量为水，pH值5.0，120℃灭菌20分钟后，冷却至室温。

配制壳聚糖醋酸溶液为壳聚糖(分子量1600000Da)含量为20％(W/V)，醋酸6％(v/v),余量为水。将富含壳聚糖酶的烟曲霉发酵液通过抽滤去除菌体后按照发酵液：壳聚糖醋酸溶液＝1:5(V/V)的比例进行混合。在40℃水浴锅中反应72小时，利用高效液相色谱法测定溶液中被降解的壳聚糖的分子量和聚合度(参见表4)。反应72小时后，分子量为1389Da，聚合度分布图见图5。

表4 20％壳聚糖醋酸溶液降解72小时后聚合度分布

实施例4

将上述烟曲霉-2T-2培养至PDA固体培养基上，置于恒温培养箱中28℃培养24小时，而后将菌株接种于PDA液体培养基中，置于恒温培养箱中28℃培养24小时，获得菌株种子培养液；种子培养液按2％(V/V)比例接种于产壳聚糖酶培养基中，28℃，发酵培养6天，获得富含壳聚糖酶的烟曲霉发酵液。

产壳聚糖酶培养基为，蛋白胨添加量3％(W/V)，磷酸氢二钾添加量0.07％(W/V)，磷酸二氢钾添加量0.03％(W/V)，氯化钠添加量1％(W/V)，葡萄糖添加量0.1(W/V)，壳聚糖粉末(分子量1600000Da)添加量1％(W/V)，余量为水，pH值4.5，120℃灭菌20分钟后，冷却至室温。

分别配制各种壳聚糖酸溶液为壳聚糖(分子量1600000Da)含量为3％(W/V)，各种不同酸加量为6％(V/V)(己二酸、谷氨酸、丁二酸、苹果酸、乙酰水杨、乳酸、盐酸、乙酸)，余量为水。

将富含壳聚糖酶的烟曲霉发酵液通过抽滤去除菌体后按照发酵液：不同壳聚糖酸溶液＝1:5(V/V)的比例进行混合。在45℃水浴锅中反应48小时，利用高效液相色谱法测定溶液中被降解的壳聚糖的分子量，见下表5。

表5各种壳聚糖酸溶液降解48小时后分子量

酸	分子量	酸	分子量
				丁二酸	431Da	苹果酸	520Da
乙酸	553Da	乙酰水杨酸	528Da
				己二酸	796Da	乳酸	154Da
谷氨酸	720Da	盐酸	1851Da

序列表

<110> 中国科学院海洋研究所

<120> 一种高产壳聚糖酶的菌株及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1290

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcccgcaaa tgcggaccgg gctatttaag ggccgaggtc tcgttcgtta tcgcaattaa 60

gcagacaaat cactccacca actaagaacg gccatgcacc accatccaaa agatcaagaa 120

agagctctca atctgtcaat ccttattttg tctggacctg gtgagtttcc ccgtgttgag 180

tcaaattaag ccgcaggctc cacgccttgt ggtgcccttc cgtcaatttc tttaagtttc 240

agccttgcga ccatactccc cccagaaccc aaaaactttg atttctcgta aggtgccgag 300

cgggtcatca tagaaacacc gcccgatccc tagtcggcat agtttatggt taagactacg 360

acggtatctg atcgtcttcg atcccctaac tttcgttccc tgattaatga aaacatcctt 420

ggcgaatgct ttcgcagtag ttagtcttca gcaaatccaa gaatttcacc tctgacagct 480

gaatactgac gcccccgact atccctatta atcattacgg cggtcctaga aaccaacaaa 540

atagaaccgc acgtcctatt ctattattcc atgctaatgt attcgagcaa aggcctgctt 600

tgaacactct aattttttca cagtaaaagt cctggttccc cccacagcca gtgaaggcca 660

tgaggttccc cagaaggaaa ggtccagccg gaccagtact cgcggtgagg cggaccggcc 720

agccagaccc aaggttcaac tacgagcttt ttaactgcaa caactttaat atacgctatt 780

ggagctggaa ttaccgcggc tgctggcacc agacttgccc tccaattgtt cctcgttaag 840

ggatttagat tgtactcatt ccaattacga gacccaaaag agccccgtat cagtatttat 900

tgtcactacc tccccgtgtc gggattgggt aatttgcgcg cctgctgcct tccttggatg 960

tggtagccgt ttctcaggct ccctctccgg aatcgaaccc taattccccg ttacccgttg 1020

ccaccatggt aggccactat cctaccatcg aaagttgata gggcagaaat ttgaatgaac 1080

catcgccggc gcaaggccat gcgattcgtt aagttattat gattcaccaa ggagccccga 1140

agggcattgg ttttttatct aataaataca ccccttccga agtcgaggtt tttagcatgt 1200

attagctcta gaattaccac aggtatccat gtagtaaggt actatcaaat aaacgataac 1260

tgatttaatg agccattcgc agtttcaccg 1290

Claims (10)

1.一种高产壳聚糖酶的菌株，其特征在于：菌株为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年12月31日，保藏编号为：CGMCC21422。

2.一种权利要求1所述的高产壳聚糖酶的菌株的应用，其特征在于：所述烟曲霉属烟曲霉在降解壳聚糖制备壳寡糖中的应用。

3.按权利要求2所述的高产壳聚糖酶的菌株的应用，其特征在于：将所述菌株接种于产壳聚糖酶培养基所得培养液与壳聚糖酸溶液混合，混合后25-50℃水域反应12-120小时，即可降解获得不同小分子量的壳寡糖溶液。

4.按权利要求3所述的高产壳聚糖酶的菌株的应用，其特征在于：所述菌株接种于PDA液体培养基中获得菌株种子培养液；种子培养液按1％-4％(V/V)比例接种于产壳聚糖酶培养基中，25℃-45℃，发酵培养2-14天，获得富含壳聚糖酶的发酵液。

5.按权利要求3或4所述的高产壳聚糖酶的菌株的应用，其特征在于：所述壳聚糖酸溶液中酸的添加量0.1％-20％(固体酸W/V；液体酸V/V)，酸溶液为谷氨酸、乳酸、己二酸、乙酰水杨酸、苹果酸、盐酸、乙酸、丁二酸其中的一种或几种的混合。

6.一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：含权利要求1所述菌株的发酵液与壳聚糖酸溶液混合，混合后25-50℃水域反应12-120小时，即可降解获得不同小分子量的壳寡糖溶液；其中，发酵液与壳聚糖酸溶液体积比为按照1：1-10(V/V)。

7.按权利要求6所述的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述含权利要求1所述菌株的发酵液为将所述菌株接种于PDA液体培养基中获得菌株种子培养液；种子培养液按1％-4％(V/V)比例接种于产壳聚糖酶培养基中，25℃-45℃，发酵培养2-14天，获得富含壳聚糖酶的发酵液。

8.按权利要求6所述的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述产壳聚糖酶培养基为，氮源添加量0.1％-5％(W/V)，磷酸氢二钾添加量0.01％-0.5％(W/V)，磷酸二氢钾添加量0.01％-0.5％(W/V)，氯化钠添加量0.1％-2％(W/V)，碳源添加量0.1％-3％(W/V)，余量为水，pH值4.0-7.0，120℃灭菌20分钟后，冷却至室温。

9.按权利要求8所述的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述氮源为硝酸钾、牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵中的一种或几种的混合；所述碳源为胶体壳聚糖、羧甲基壳聚糖、几丁质、可溶性淀粉、葡萄糖、羧甲基纤维素钠中的一种或几种混合。

10.按权利要求6所述的壳聚糖酶的制备方法，其特征在于所述壳聚糖酸溶液中酸的添加量0.1％-20％(固体酸W/V；液体酸V/V)，酸溶液为谷氨酸、乳酸、己二酸、乙酰水杨酸、苹果酸、盐酸、乙酸、丁二酸其中的一种或几种的混合。

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