CN114480537B

CN114480537B - 一种制备高聚合度壳寡糖的方法

Info

Publication number: CN114480537B
Application number: CN202111568018.8A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 王永臻; 苏海鹏; 尹丽丽
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-12-21
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2041-12-21
Also published as: CN114480537A

Abstract

本发明公开了一种制备高聚合度壳寡糖的方法：向含有Mn²⁺的壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶或含有壳聚糖酶的溶液，进行酶解，即得聚合度为3～6的壳寡糖；所述壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述含有壳聚糖酶的溶液通过以下方法制备得到：向发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌，发酵，离心，即得。本发明的方法通过金属离子与生物酶法耦合催化调节，可使酶解产物的聚合度由2～4改变为3～6。本发明所采用的壳聚糖酶，发酵产酶时间短，可以高效降解壳聚糖，10％浓度壳聚糖溶液6h转化率可达85％以上，且加酶量仅为2.5U/g壳聚糖。本发明所采用的枯草芽孢杆菌，产酶方式为胞外酶，培养菌体后将发酵液离心取上清液即可直接用于壳聚糖的降解。

Description

一种制备高聚合度壳寡糖的方法

技术领域

本发明涉及一种制备高聚合度壳寡糖的方法，属于发酵工程、生化工程领域。

背景技术

壳聚糖具有许多重要的生物活性，但壳聚糖溶解度低，不溶于水、碱性溶液及有机溶剂，仅溶于稀酸，当溶液中的壳聚糖浓度达到5％以上时基本失去流动性，这些性质限制了壳聚糖在食品、药品和纺织等相关行业的应用。而壳聚糖的水解产物壳寡糖由于分子链较短具有良好的水溶性，与大分子壳聚糖相比具有更高的生物活性。壳寡糖可抗肿瘤、降血糖、促进有益菌群增生，作为化妆品保湿剂、植物生长调节剂等等，在生产生活上具有广阔的应用前景。

目前制备壳寡糖的方法主要有物理法、化学法和酶解法等，目前工业化生产壳寡糖主要方法是化学降解法，但该方法产物不均一、分离困难且污染严重，得到的产物均一度很低基本为单糖。而酶解法反应条件温和易控制、产率高、基本无污染，是一种生产壳寡糖较为优良的方法。专一性酶解法即利用壳聚糖酶降解壳聚糖获得壳寡糖，因此利用壳聚糖酶降解壳聚糖从而产生壳寡糖是一种较为可行的方法。而目前高产酶菌株大多数为胞内酶，发酵周期长，高浓度底物酶解效率低，产物聚合度集中在1～3，高聚合度壳寡糖含量不高，难以满足工业化制备壳寡糖的需要。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种制备高聚合度壳寡糖的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种制备高聚合度壳寡糖的方法：向含有Mn²⁺的壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶或含有壳聚糖酶的溶液，进行酶解，即得聚合度为3～6的壳寡糖；所述壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

壳聚糖酶的氨基酸序列如下所示(如SEQ ID NO.1所示)：

MNGKRNIFTCISIVGIGLASFSNSSFAASVTDNSIQNSIPVVNQQVTAAKEMKPFPQQVNYAGVIKPNHVTQESLNASVRSYYDNWKKKYLKNDLSSLPGGYYVKGEITGDADGFKPLGTSEGQGYGMIITVLMAGYDSNAQKIYDGLFKTARTFKSSQNPNLMGWVVADSKKAQGHFDSATDGDLDIAYSLLLAHKQWGSNGAVNYLKEAQDMITKGIKASNVTNNSRLNLGDWDSKSSLDTRPSDWMMSHLRAFYEFTGDKTWLTVINNLYDVYTQFSNKYSPNTGLISDFVVKNPPQPAPKDFLNESEYTNAYYYNASRVPLRIVMDYAMYGEKRSKVISDKVSSWIQNKTNGNPSKIVDGYQLNGSNIGSYPTGVFVSPFIAASITNSNNQKWVNSGWDWMKNKREGYFSDSYNLLTMLFITGNWWKPIPDNKKTQNQINDAIYEGYDN。

进一步地，所述壳聚糖溶液的浓度为6％～10％(质量体积比，单位mg/ml)，溶质为2％～3％(质量百分数)的醋酸溶液。

进一步地，所述壳聚糖溶液中Mn²⁺的浓度为1～20mmol/L，优选2～10mmol/L，更优选2mmol/L、5mmol/L。

进一步地，所述Mn²⁺是以可溶性锰盐的方式加入到壳聚糖溶液中的，比如氯化锰、硫酸锰。

进一步地，所述壳聚糖酶的加酶量2.0～3.0U/g壳聚糖，优选2.5U/g。

进一步地，所述酶解的温度为52～58℃，优选55℃，酶解时间为4～7h，优选6h、7h。

进一步地，所述含有壳聚糖酶的溶液，可通过以下方法制备得到：向发酵培养基中接种能表达SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌或其种子液，进行发酵；发酵结束后，发酵液离心，得上清液，即为含有壳聚糖酶的溶液。

所述枯草芽孢杆菌，为已经公开的菌株(可自菌种保藏人或菌种保藏机构购买得到)，来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Bacillussubtilis，保藏编号为CGMCC No.1.14985，保藏日期为2014年12月10日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏人为本发明的第一发明人；该枯草芽孢杆菌的生物学特性为：显微镜镜检菌株形态为杆状，属于革兰氏阳性菌，平板划线培养的形态为不透明、边缘不整齐的乳白色圆形菌落；该枯草芽孢杆菌能表达氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的壳聚糖酶。虽然该枯草芽孢杆菌是现有技术中已经公开的菌株，本领域技术人员知晓其基因组中含有能表达壳聚糖酶的基因，但这仅是从基因序列的同源性上得出的结论，现有技术中并未对其所能表达的壳聚糖酶进行具体的表达和研究，不知晓该壳聚糖酶具有何种性质；本发明首次对该枯草芽孢杆菌所能表达的壳聚糖酶进行了实际的制备和研究，并发现了其特性。另外，也可将编码SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶的基因片段(可从保藏编号为CGMCC No.1.14985的菌株中扩增得到，也可人工合成，该基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，可进一步依据密码子偏好等进行优化)通过基因重组的方式导入常规的枯草芽孢杆菌中。

该基因的核苷酸序列如下所示(如SEQ ID NO.2所示)：

5’-

ATGAATGGAAAAAGAAATATTTTCACATGTATTTCTATTGTAGGAATCGGACTAGCTAGTTTTTCTAATTCTAGTTTCGCTGCAAGTGTAACGGACAATTCAATACAAAATTCTATTCCTGTAGTTAATCAACAAGTAACTGCTGCAAAGGAAATGAAACCATTTCCCCAGCAAGTTAATTATGCAGGTGTTATAAAACCGAATCATGTTACACAAGAAAGTTTAAATGCTTCTGTAAGAAGTTACTACGATAATTGGAAAAAGAAATATTTGAAAAATGATTTATCTTCTTTACCTGGTGGTTATTACGTAAAAGGAGAGATTACAGGTGATGCGGATGGGTTTAAGCCACTTGGAACTTCAGAAGGTCAAGGGTATGGGATGATAATTACAGTATTAATGGCCGGTTATGATTCGAATGCTCAAAAAATCTATGACGGTTTATTTAAAACAGCAAGAACTTTTAAAAGCTCTCAAAATCCTAATTTAATGGGATGGGTTGTCGCAGATAGTAAAAAAGCACAAGGTCATTTTGATTCTGCTACTGATGGGGATTTAGATATTGCGTATTCTCTTCTTCTTGCTCACAAGCAGTGGGGATCAAATGGAGCAGTTAATTATTTAAAAGAAGCACAAGACATGATTACAAAAGGTATTAAAGCTAGTAATGTTACAAATAATAGCCGACTAAATTTAGGAGATTGGGATTCTAAAAGTTCACTTGATACGAGACCATCTGATTGGATGATGTCACACCTTAGAGCATTTTATGAATTTACAGGTGATAAAACTTGGCTCACTGTTATTAATAATTTGTATGATGTTTATACGCAATTTAGTAATAAGTACTCTCCAAATACAGGACTTATTTCAGATTTTGTTGTAAAAAACCCACCACAACCCGCACCTAAAGACTTCTTAAATGAGTCAGAATATACAAATGCATATTATTATAATGCTAGTCGAGTACCTTTAAGAATTGTAATGGACTATGCGATGTACGGCGAGAAGCGAAGTAAAGTCATTTCTGATAAAGTATCTTCATGGATTCAAAATAAAACGAATGGAAATCCTTCTAAAATTGTGGATGGTTATCAATTAAACGGATCCAATATTGGTAGTTATCCAACTGGTGTATTCGTTTCGCCATTTATTGCTGCAAGTATAACAAATAGCAATAATCAAAAGTGGGTAAATAGCGGTTGGGATTGGATGAAGAATAAGAGAGAAGGCTATTTTAGTGAT AGTTATAATTTATTAACTATGTTATTTATTACAGGAAATTGGTGGAAACCTATACCTGATAATAAAAAGA CACAAAATCA AATAAATGATGCAATTTATGAAGGATACGATAATTAA-3’。

所述枯草芽孢杆菌种子液可通过以下方法制备得到的：将枯草芽孢杆菌接种至灭菌(115℃条件下灭菌30min)的LB培养基上，接种量1％，于37℃、200rpm摇床活化10～12h，制得种子液。

进一步地，所述发酵培养基的组分组成为(各组分按重量百分比)：1％酵母粉，1％(NH₄)₂SO₄，1％预糊化淀粉，0.3％壳聚糖，0.1％MgSO₄，余量为水。

进一步地，所述预糊化淀粉是通过以下方法制备得到的：将温水(温水的水温为25℃)与沸水按1:4(体积比)的比例混合，处理马铃薯淀粉(马铃薯淀粉与水的用量配比关系为质量比1:100)，得到预糊化淀粉。

进一步地，所述发酵的具体条件为：发酵温度30℃，发酵时间24h，发酵过程中维持pH在6.9～7.1(采用醋酸或氨水调节)。

进一步地，所述离心的具体条件为：10000rpm离心2min。

利用上述方法制备得到的壳寡糖，其聚合度为3～6。

氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶在制备高聚合度壳寡糖中的应用；所述高聚合度是指聚合度3～6。

本发明的制备高聚合度壳寡糖的方法，通过金属离子与生物酶法耦合催化调节，可使酶解产物的聚合度由2～4改变为3～6，而采用其他的壳聚糖酶无法提升聚合度得到3～6的壳寡糖，能够解决目前市面上壳寡糖聚合度主要集中在3糖以下的问题。

本发明所采用的壳聚糖酶，发酵产酶时间短(仅需24h)，并且可以高效降解壳聚糖，6％～8％浓度的壳聚糖溶液4h转化率即可达到90％以上，10％浓度壳聚糖溶液6h转化率可达85％以上，产物聚合度为3～6，且加酶量仅为2.5U/g壳聚糖，是目前已知所需产酶时间最短、能够作用于高浓度壳聚糖、加酶量最少的壳聚糖酶(目前已报道的有：Timenicillium oxalicum QS7-6产壳聚糖酶加酶量66.7U/g底物浓度6％，发酵产酶时间96h，产物为单糖；Microbacterium sp.A502产壳聚糖酶可作用于10％浓度壳聚糖，但产酶时间为76h，加酶量18U/g且产物为单糖；Mitsuaria sp.141-2产壳聚糖酶加酶量为6U/g，但仅能作用于4％浓度的壳聚糖且产酶时间为76h；Bacillus cereus SHS-0903产壳聚糖酶所需时间为24h，加酶量10U/g，但只能作用于6.5％浓度壳聚糖)。

本发明所采用的枯草芽孢杆菌，可表达壳聚糖酶，产酶方式为胞外酶(现有技术中的壳聚糖酶，为胞内酶，发酵周期长)，培养菌体后，将发酵液离心取上清液即可直接用于壳聚糖的降解，无需分离纯化或破碎菌体，制备简便，成本低，每生产1kg壳寡糖的物料成本仅为0.7元。目前已经成功在500L发酵罐上进行放大生产，工业化应用潜力巨大。培养枯草芽孢杆菌时，可向培养基中加入预糊化淀粉，菌体生长更快，且最高酶活力出现时间提前，使得发酵周期仅为24h，是目前生产周期最短的壳聚糖酶。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1为预糊化处理对GS522菌体生长的影响图。

图2为预糊化处理对GS522菌体产酶的影响图。

图3为500L发酵罐发酵产酶示意图。

图4为壳聚糖酶GS522酶解高浓度底物转化率图。

图5为壳聚糖酶GS522酶解终产物TLC结果图。

图6为金属离子对GS522壳聚糖酶酶活力的影响图。

图7为不同浓度Mn²⁺对酶活力的影响图。

图8为优化酶解工艺TLC结果示意图。

图9为采用本发明的方法处理壳聚糖酶OUC-CsnCA的结果图。

图10为采用本发明的方法处理壳聚糖酶的结果图。

图11为采用本发明的方法处理壳聚糖酶Csn-PT的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

本发明所用的壳聚糖(脱乙酰度90％)，购自上海源叶生物科技有限公司，商品号A25O10K00987。

菌种活化：活化培养基：LB培养基于115℃高压灭菌锅灭菌30min后冷却备用。将保存在保菌管里的菌种(菌种来自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.1.14985)按照1％接种量移种至灭完菌的活化培养基中，在37℃、200rpm摇床活化12h至菌液浑浊。

壳聚糖酶活的定义：水解壳聚糖产生1μmol氨基葡萄糖所需要的壳聚糖酶量。

壳聚糖酶酶活力的测定方法：采用DNS法测定酶活力。

取一定量的发酵液，在10000rpm条件下离心2min得上清液，空白对照组取10μl上清液沸水浴20min灭活。取10μl上清液加入190μl的2％壳聚糖溶液及400μl的pH＝5.6的HAc-NaAc缓冲液，震荡混合均匀，在55℃水浴条件下反应15min，取出后摇匀并取出200μl反应液加入300μl DNS试剂终止反应，沸水浴反应显色10min后冰浴冷却，10000rpm离心1min，取上清液200μl加入1ml水稀释后在540nm条件下测量吸光值。

标准曲线的绘制：分别取0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml的葡萄糖标准溶液200μl，加入300μl的DNS试剂于沸水浴中显色10min，取出后冰浴冷却至室温，取200μl加入1ml水稀释后在540nm下测定吸光值。

实施例1马铃薯淀粉预糊化对菌体生长及产酶的影响

其中一组发酵培养基为：1％酵母粉、1％(NH₄)₂SO₄、1％预糊化马铃薯淀粉、0.3％壳聚糖、0.1％MgSO₄，余量为水；另一组马铃薯淀粉不做预处理。将活化的种子液按照1％的量接种至5L发酵罐中，发酵温度30℃，搅拌转速200rpm，通气量1.25vvm，利用10％醋酸及10％氨水控制发酵pH恒定7.0(±0.1)，从接种6h开始间隔3h取样测量发酵液菌体浓度(OD₆₀₀)及上清液壳聚糖酶活力变化情况，结果如图1、图2所示，将马铃薯淀粉预糊化处理可使酶活最高出现时间由36h提前至24h。

所述预糊化淀粉是通过以下方法制备得到的：将温水(温水的水温为25℃)与沸水按1:4(体积比)的比例混合，处理马铃薯淀粉(马铃薯淀粉与水的用量配比关系为质量比1:100)，得到预糊化淀粉。

实施例2大型发酵罐GS522壳聚糖酶的制备

活化培养基：LB培养基。

发酵培养基：1％酵母粉、1％(NH₄)₂SO₄、1％预糊化马铃薯淀粉、0.3％壳聚糖、0.1％MgSO₄，余量为水。

1.种子液制备

将保存在保菌管里的菌种按照1％接种量移种至灭菌的活化培养基中，在37℃、200rpm摇床活化12h得到种子液。

2.发酵罐发酵产酶

将第一步得到的种子液按照1％的量接种至500L发酵罐中，发酵温度30℃，搅拌转速150rpm，通气量1.25vvm，利用10％醋酸及10％氨水控制发酵pH恒定7.0(±0.1)，从接种6h开始间隔3h取样测量发酵液菌体浓度(OD₆₀₀)及发酵上清液壳聚糖酶活力变化情况，结果如图3所示，当发酵时间为24h时壳聚糖酶酶活力最高，为21.8U/mL。

实施例3壳聚糖酶GS522酶解能力研究

分别配置6％壳聚糖溶液(2％醋酸溶解)、8％壳聚糖溶液(2.5％醋酸溶解)及10％壳聚糖溶液(3％醋酸溶解)各100ml，分别加入0.6、0.8、1ml的上清液(实施例2中，发酵24h时的发酵液，离心所得，离心条件为：10000rpm条件下离心2min)，在55℃条件下水浴震荡反应，分别在3-6h间隔1h取样测量壳聚糖转化率，结果如图4所示，该酶解体系能有效降解高浓度的壳聚糖溶液，6％、8％浓度的壳聚糖溶液4h转化率即可达到90％以上，10％浓度壳聚糖溶液6h转化率可达85％以上，加酶量仅需2.5U/g壳聚糖(酶液酶活力为25U/mL，加酶量＝酶液酶活力*加入酶液体积/壳聚糖质量)，是目前已知加酶量最少的且能作用10％浓度底物的壳聚糖酶(现有报道中，Timenicillium oxalicum QS7-6产壳聚糖酶加酶量66.7U/g，Microbacterium sp.A502产壳聚糖酶加酶量18U/g，Mitsuaria sp.141-2产壳聚糖酶加酶量为6U/g，Bacillus cereus SHS-0903加酶量10U/g)。

实施例4壳聚糖酶GS522酶解产物控制研究

配置0.5％壳聚糖溶液(0.5％醋酸溶解)100mL，加入1ml的壳聚糖酶液(即实施例3中的上清液)；配制10％壳聚糖溶液(3％醋酸溶解)100ml，加入1ml的壳聚糖酶液(即实施例3中的上清液)，于55℃水浴震荡反应至产物不再发生变化，如图5所示(图中的“std”为壳1～6糖标准品混合物)，GS522壳聚糖酶降解终产物为2～4糖，且底物浓度对酶解终产物无影响。

进一步研究金属离子对酶活力的影响，研究的金属离子种类为Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Cu² ⁺、Fe²⁺、Fe³⁺、K⁺、Ba²⁺，金属离子以ZnCl₂、MnCl₂、CaCl₂、CuCl₂、FeCl₂、FeCl₃、KCl、BaCl₂的形式加入至10％壳聚糖溶液中，金属离子的浓度分别设置为1mM、10mM、100mM，结果如图6所示，Mn²⁺能显著提高酶活力。

进一步研究Mn²⁺浓度对酶活力影响，将MnCl₂加入至100mL 10％壳聚糖溶液中(考察的Mn²⁺浓度分别为：0.5、1、2、5、10、20、50、100mM)，加入1ml的壳聚糖酶液(即实施例3中的上清液)，结果如图7所示(图中的对照为空白对照，即不添加Mn²⁺)，由图可知，1～10mM的Mn² ⁺能够提高酶活力3.5倍左右。在加酶量2.5U/g壳聚糖的基础上进一步优化Mn²⁺添加量及酶解时间，当Mn²⁺添加量为2mM、酶解时间为6h、7h时，产物聚合度为3～6(如图8所示)，且酶解转化率提高至90％以上。

而采用同样的方式处理其它壳聚糖酶(向100mL 10％壳聚糖溶液中加入2mM的MnCl₂，加入1mL其它所处理的壳聚糖酶，55℃水浴震荡反应至产物不再发生变化)，结果显示添加Mn²⁺后不能将产物的聚合度提高至3～6，具体如图9、图10、图11所示。

图9所示为Mn²⁺对壳聚糖酶OUC-CsnCA(公开号为CN111500555A的与本申请为同一申请人的中国发明专利申请中所记载的壳聚糖酶)的酶活力的影响，从图中可以看到，产物聚合度为1～3。

图10所示为Mn²⁺对壳聚糖酶(公开号为CN111235131A的与本申请为同一申请人的中国发明专利申请中所记载的壳聚糖酶)的酶活力的影响，从图中可以看到，产物聚合度为1～3。

图11所示为Mn²⁺对壳聚糖酶Csn-PT(公开号为CN111471667A的与本申请为同一申请人的中国发明专利申请中所记载的壳聚糖酶)的酶活力的影响，从图中可以看到，产物聚合度为1～3。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种制备高聚合度壳寡糖的方法

<141> 2021-12-16

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 453

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

Met Asn Gly Lys Arg Asn Ile Phe Thr Cys Ile Ser Ile Val Gly Ile

1 5 10 15

Gly Leu Ala Ser Phe Ser Asn Ser Ser Phe Ala Ala Ser Val Thr Asp

20 25 30

Asn Ser Ile Gln Asn Ser Ile Pro Val Val Asn Gln Gln Val Thr Ala

35 40 45

Ala Lys Glu Met Lys Pro Phe Pro Gln Gln Val Asn Tyr Ala Gly Val

50 55 60

Ile Lys Pro Asn His Val Thr Gln Glu Ser Leu Asn Ala Ser Val Arg

65 70 75 80

Ser Tyr Tyr Asp Asn Trp Lys Lys Lys Tyr Leu Lys Asn Asp Leu Ser

85 90 95

Ser Leu Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Lys Gly Glu Ile Thr Gly Asp Ala

100 105 110

Asp Gly Phe Lys Pro Leu Gly Thr Ser Glu Gly Gln Gly Tyr Gly Met

115 120 125

Ile Ile Thr Val Leu Met Ala Gly Tyr Asp Ser Asn Ala Gln Lys Ile

130 135 140

Tyr Asp Gly Leu Phe Lys Thr Ala Arg Thr Phe Lys Ser Ser Gln Asn

145 150 155 160

Pro Asn Leu Met Gly Trp Val Val Ala Asp Ser Lys Lys Ala Gln Gly

165 170 175

His Phe Asp Ser Ala Thr Asp Gly Asp Leu Asp Ile Ala Tyr Ser Leu

180 185 190

Leu Leu Ala His Lys Gln Trp Gly Ser Asn Gly Ala Val Asn Tyr Leu

195 200 205

Lys Glu Ala Gln Asp Met Ile Thr Lys Gly Ile Lys Ala Ser Asn Val

210 215 220

Thr Asn Asn Ser Arg Leu Asn Leu Gly Asp Trp Asp Ser Lys Ser Ser

225 230 235 240

Leu Asp Thr Arg Pro Ser Asp Trp Met Met Ser His Leu Arg Ala Phe

245 250 255

Tyr Glu Phe Thr Gly Asp Lys Thr Trp Leu Thr Val Ile Asn Asn Leu

260 265 270

Tyr Asp Val Tyr Thr Gln Phe Ser Asn Lys Tyr Ser Pro Asn Thr Gly

275 280 285

Leu Ile Ser Asp Phe Val Val Lys Asn Pro Pro Gln Pro Ala Pro Lys

290 295 300

Asp Phe Leu Asn Glu Ser Glu Tyr Thr Asn Ala Tyr Tyr Tyr Asn Ala

305 310 315 320

Ser Arg Val Pro Leu Arg Ile Val Met Asp Tyr Ala Met Tyr Gly Glu

325 330 335

Lys Arg Ser Lys Val Ile Ser Asp Lys Val Ser Ser Trp Ile Gln Asn

340 345 350

Lys Thr Asn Gly Asn Pro Ser Lys Ile Val Asp Gly Tyr Gln Leu Asn

355 360 365

Gly Ser Asn Ile Gly Ser Tyr Pro Thr Gly Val Phe Val Ser Pro Phe

370 375 380

Ile Ala Ala Ser Ile Thr Asn Ser Asn Asn Gln Lys Trp Val Asn Ser

385 390 395 400

Gly Trp Asp Trp Met Lys Asn Lys Arg Glu Gly Tyr Phe Ser Asp Ser

405 410 415

Tyr Asn Leu Leu Thr Met Leu Phe Ile Thr Gly Asn Trp Trp Lys Pro

420 425 430

Ile Pro Asp Asn Lys Lys Thr Gln Asn Gln Ile Asn Asp Ala Ile Tyr

435 440 445

Glu Gly Tyr Asp Asn

450

<210> 2

<211> 1362

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 2

atgaatggaa aaagaaatat tttcacatgt atttctattg taggaatcgg actagctagt 60

ttttctaatt ctagtttcgc tgcaagtgta acggacaatt caatacaaaa ttctattcct 120

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ggttattacg taaaaggaga gattacaggt gatgcggatg ggtttaagcc acttggaact 360

tcagaaggtc aagggtatgg gatgataatt acagtattaa tggccggtta tgattcgaat 420

gctcaaaaaa tctatgacgg tttatttaaa acagcaagaa cttttaaaag ctctcaaaat 480

cctaatttaa tgggatgggt tgtcgcagat agtaaaaaag cacaaggtca ttttgattct 540

gctactgatg gggatttaga tattgcgtat tctcttcttc ttgctcacaa gcagtgggga 600

tcaaatggag cagttaatta tttaaaagaa gcacaagaca tgattacaaa aggtattaaa 660

gctagtaatg ttacaaataa tagccgacta aatttaggag attgggattc taaaagttca 720

cttgatacga gaccatctga ttggatgatg tcacacctta gagcatttta tgaatttaca 780

ggtgataaaa cttggctcac tgttattaat aatttgtatg atgtttatac gcaatttagt 840

aataagtact ctccaaatac aggacttatt tcagattttg ttgtaaaaaa cccaccacaa 900

cccgcaccta aagacttctt aaatgagtca gaatatacaa atgcatatta ttataatgct 960

agtcgagtac ctttaagaat tgtaatggac tatgcgatgt acggcgagaa gcgaagtaaa 1020

gtcatttctg ataaagtatc ttcatggatt caaaataaaa cgaatggaaa tccttctaaa 1080

attgtggatg gttatcaatt aaacggatcc aatattggta gttatccaac tggtgtattc 1140

gtttcgccat ttattgctgc aagtataaca aatagcaata atcaaaagtg ggtaaatagc 1200

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Claims

1.一种制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于：向含有Mn²⁺的壳聚糖溶液中加入壳聚糖酶或含有壳聚糖酶的溶液，进行酶解，即得聚合度为3～6的壳寡糖；所述壳聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述壳聚糖溶液的浓度为6%～10%，溶质为2%～3%的醋酸溶液；

所述壳聚糖溶液中Mn²⁺的浓度为1～20 mmol/L；

所述壳聚糖酶的加酶量2～3 U/g壳聚糖；

所述酶解的温度为52～58℃，酶解时间为4～7 h。

2.根据权利要求1所述的制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于：所述壳聚糖溶液的浓度为6%、8%或10%，溶质为2%～3%的醋酸溶液；

所述壳聚糖溶液中Mn²⁺的浓度为2 mmol/L或5 mmol/L；

所述壳聚糖酶的加酶量2.5 U/g壳聚糖；

所述酶解的温度为55℃，酶解时间为6或7 h。

3.根据权利要求1所述的制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于，所述含有壳聚糖酶的溶液是通过以下方法制备得到的：向发酵培养基中接种能表达SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶的枯草芽孢杆菌或其种子液，进行发酵；发酵结束后，发酵液离心，得上清液，即为含有壳聚糖酶的溶液。

4.根据权利要求3所述的制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为：保藏编号为CGMCC No. 1. 14985的枯草芽孢杆菌，或导入了编码SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶的基因片段的重组枯草芽孢杆菌。

5.根据权利要求3所述的制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组分组成为：1 %酵母粉，1 % (NH₄)₂SO₄，1 %预糊化淀粉，0.3 %壳聚糖，0.1% MgSO₄，余量为水。

6.根据权利要求5所述的制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于，所述预糊化淀粉是通过以下方法制备得到的：将温水与沸水按1:4的比例混合，处理马铃薯淀粉，得到预糊化淀粉。

7.根据权利要求3所述的制备高聚合度壳寡糖的方法，其特征在于，所述发酵的具体条件为：发酵温度30 ℃，发酵时间24 h，发酵过程中维持pH在6.9～7.1。

8.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的壳聚糖酶在制备聚合度为3～6的壳寡糖中的应用。