CN108531418A - 一种壳聚糖酶的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种壳聚糖酶的制备方法。以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)116为出发菌株，并通过优化培养条件经液体发酵制备出一种胞外壳聚糖酶，发酵液中壳聚糖酶酶活可达40‑80U/mL，发酵液经冷冻离心，硫酸铵分级沉淀，DEAE‑Sepharose Fast Flow离子交换层析，浓缩，冷冻干燥后得到固态壳聚糖酶。

Description

一种壳聚糖酶的制备方法
技术领域
本发明涉及菌种发酵制备酶技术领域，特别是涉及一种壳聚糖酶 的制备方法。
背景技术
壳聚糖是由氨基葡萄糖通过β-1,4糖苷键连接而成的碱性多 糖，具有诸多优良特性，如增粘性、保湿性、生物相容性等，但由于 壳聚糖溶解性差，限制了其应用范围。其水解产物壳寡糖，具有良好 的溶解性，更易被生物机体吸收，在农业、食品、医疗、保健品、化 妆品等多个领域均有很好的应用。
壳聚糖的降解工艺主要有化学降解法和酶解法。酶法降解壳聚 糖，相对于目前常用的化学降解法，具有条件温和易控、功能性寡糖 得率高、不易造成环境污染等优势。壳聚糖酶是一种专一性降解壳聚 糖分子间β-1,4糖苷键的酶，广泛分布在细菌、真菌、放线菌等微生 物中，但由于产酶量及酶活性普遍较低，导致酶法制备壳寡糖生产成 本居高不下，因此难以满足壳寡糖生产的需要。
发明内容
本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种壳聚糖酶的制备方 法。本发明以蜡状芽孢杆菌116为出发菌株，该菌株能够诱导性分泌 一种胞外壳聚糖酶，其培养条件经优化后，发酵上清液中壳聚糖酶酶 活可达40-80U/mL。以此发酵液为粗酶液，确立了壳聚糖酶的分离纯 化方法，包括冷冻离心，硫酸铵分级沉淀，阴离子交换层析，经浓缩、 冷冻干燥后得到固态壳聚糖酶。该方法相对于常用的二次层析制备方 法，具有简单易行，成本较低的优势。
本发明的一种壳聚糖酶的制备方法技术方案为，采用蜡状芽孢杆 菌116发酵后进行分离纯化得到壳聚糖酶。
所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)116，分类命名：蜡样芽 孢杆菌116(Bacillus cereus 116)，保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号是：CCTCC NO： M2017803，保藏日期是2017年12月18日。
所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)116斜面培养基(w/v)： 硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.1％，粉末壳 聚糖1.0％，琼脂2.0％，pH 6-7；
种子培养基(w/v)：蛋白胨0.5％，粉末壳聚糖0.5％，葡萄糖0.1％， 氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％， 硫酸镁0.05％，pH 6-7；
产酶培养基(w/v)：粉末壳聚糖1.5％，葡萄糖0.1％，硫酸铵2.0％， 氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％， 硫酸镁0.05％，pH 6-7。
发酵温度为30-32℃，发酵初始pH为6-7，发酵时间55-72h。
所述的分离纯化步骤包括冷冻离心，硫酸铵分级沉淀，阴离子交 换层析，浓缩，干燥。
所述的冷冻离心具体为：将发酵液在4-8℃，5000-10000rpm离 心5-20min，弃去沉淀，获得发酵上清液。
所述的硫酸铵分级沉淀具体为：向发酵上清液中缓慢加入硫酸 铵，边加边搅拌，使溶液中硫酸铵饱和度达到35％，4℃静置过夜后 6000rpm冷冻离心10min，去除杂蛋白；在上清液中继续加入硫酸铵， 使其饱和度达到90％，4℃静置过夜后6000rpm冷冻离心10min，边 加边搅拌，弃去上清，将沉淀重悬于pH7.5，50mmol/L的PBS缓冲 液，把所得蛋白质溶液转移至透析袋中，在相同缓冲液中4℃透析24 h(定时更换缓冲液)。
所述的阴离子交换层析具体为：将透析后的样品加入到已用PBS 缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，先用 3-5倍柱床体积的PBS缓冲液洗脱，再用含0-1mol/L氯化钠的PBS 缓冲液进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，经酶活力检测后收集有酶活 组分。
将有酶活组分经浓缩、冷冻干燥后制得固态壳聚糖酶。
本发明的有益效果为：本发明采用蜡状芽孢杆菌116发酵后进行 分离纯化得到壳聚糖酶，采用该菌株发酵生产的壳聚糖酶酶活力较 高，培养条件经优化后，发酵液壳聚糖酶酶活可达40-80U/mL；该 菌株以粉末壳聚糖作为产酶诱导物，较之常用的胶体壳聚糖具有操作 简便、成本较低等优势；发酵液经简单的离心或过滤处理后，即可直 接用于壳聚糖的酶解，因此该菌株在壳聚糖酶的工业化生产中具有极 大的应用潜力；壳聚糖酶的分离纯化步骤简单易行，成本较低，主要 包括冷冻离心，硫酸铵分级沉淀，DEAE-Sepharose FastFlow阴离 子交换层析。
附图说明：
图1所示为本发明菌株蜡状芽孢杆菌116的菌落形态；
图2所示为本发明菌株显微形态(×1000)；
图3所示为本发明菌株蜡状芽孢杆菌116的系统发育进化树；
图4所示为碳源对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图5所示为氮源对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图6所示为温度对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图7所示为初始pH对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图8所示为发酵时间对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图9所示为装液量对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图10所示为接种量对菌株蜡状芽孢杆菌116产壳聚糖酶的影响；
图11所示为壳聚糖酶液的DEAE-Sepharose Fast Flow柱洗脱曲线， 其中，■-蛋白质浓度；○-520nm吸光值；
图12所示为壳聚糖酶的SDS-PAGE图，其中，1-经离子交换层析纯化 的酶液；2-经硫酸铵沉淀纯化的酶液；3-粗酶液；M-标准蛋白样品；
图13所示为pH对壳聚糖酶活力的影响；
图14所示为pH对壳聚糖酶稳定性的影响；
图15所示为温度对壳聚糖酶活力影响；
图16所示为温度对壳聚糖酶稳定性的影响；
图17所示为酶促反应米氏常数和最大反应速率的测定；
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技 术方案，但是本发明并不局限于此。
以下实施例中，离子交换树脂DEAE Sepharose Fast Flow购自 GE Healthcare公司。壳聚糖(脱乙酰度90～95％)购自上海生工生 物工程股份有限公司。蛋白质分子量标准品购自北京天根生化科技有 限公司。实验所用试剂均为分析纯。
实施例1
所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)116，保藏于中国典型培 养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编 号是：CCTCC NO：M2017803，保藏日期是2017年12月18日。
菌株116在斜面培养基上培养72h后，菌落呈灰白色、无光泽、 不透明、边缘不规则、圆形或近圆形，菌落直径2～4mm左右(说明 书附图图1)；菌株革兰氏染色呈阳性(说明书附图图2)，菌体为杆 状，两端钝圆，产芽孢，芽孢着生在菌体中间或侧端。
菌株116生理生化实验结果如表1所示，菌株10％NaCl生长实验、 甘露醇、山梨醇利用实验、吲哚实验及H2S实验结果为阴性，其余均 为阳性结果。
综合上述理化实验结果，并结合形态学观察，鉴定菌株116为芽 孢杆菌属(Bacillus sp.)。
表1菌株116生理生化特征
菌株的分子生物学鉴定
菌株116经PCR扩增获得16S rDNA的部分序列，长度为1512bp， 通过BLAST程序与GenBank数据库中的序列比对，构建系统发育进化 树，结果如说明书附图图3所示，菌株116与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的同源关系最近，结合形态学及生理生化实验结果，确定菌 株116为蜡状芽孢杆菌。
实施例2
菌株培养
(1)斜面培养：取保存的蜡状芽孢杆菌116菌株接种于试管斜面培养 基上，30-32℃培养2-3d；所述的斜面培养基(w/v)：硫酸铵0.5％， 磷酸氢二钾0.2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.1％，粉末壳聚糖1.0％，琼 脂2.0％，pH 6-7；
(2)种子活化：取斜面保存的蜡状芽孢杆菌116菌株接种于种子培养 基中，30-32℃，150rpm转速下培养24h，制得活化种子液；所述的 种子培养基(w/v)：蛋白胨0.5％，粉末壳聚糖0.5％，葡萄糖0.1％， 氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％， 硫酸镁0.05％，pH 6-7；
(3)发酵产酶：将活化的种子液接入发酵产酶培养基中，30-32℃， 150rpm转速下培养60-72h；所述的发酵产酶培养基(w/v)：粉末壳 聚糖1.5％，葡萄糖0.1％，硫酸铵2.0％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾 0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，pH 6-7。 壳聚糖酶活力的测定
取0.1mL适当稀释的酶液，加入1mL 0.2mol/L pH 5.6醋酸- 醋酸钠缓冲液，0.9mL1％胶体壳聚糖(0.2mol/L，pH 5.6醋酸缓 冲液)，于50℃保温15min后加入3,5-二硝基水杨酸(DNS)1.5mL 终止反应，沸水浴5min显色，冷却后定容至25mL，过滤后测定520 nm波长处的吸光度，以等量煮沸灭活的酶液作为空白对照。每毫升 酶液每分钟催化生成1μmol还原糖(以氨基葡萄糖计算)所需的酶 量为1个酶活单位(U)。
实施例3
发酵产酶条件优化
所用的相对酶活力计算方法：每组中所测样品酶活力：每组中的 最大样品酶活力×100％。
(1)碳源对菌株产酶的影响
碳源是构建微生物细胞以及合成各种代谢产物的原料，也是微生 物获取能量的主要来源。分别以胶体壳聚糖、可溶性淀粉、葡聚糖、 麦芽糖、蔗糖、乳糖替代发酵产酶培养基中的粉末壳聚糖，考察碳源 对发酵产酶的影响，结果如说明书附图图4所示，粉末壳聚糖最利于 该菌株发酵产酶
(2)氮源对菌株产酶的影响
氮源作为构成菌体蛋白质、核酸以及其它氮素化合物的材料，对 微生物生长发育和代谢具有重要意义。分别以硝酸铵、尿素、蛋白胨、 硝酸钾替代产酶培养基中的硫酸铵，考察氮源对发酵产酶的影响。结 果入说明书附图图5可以看出，以蛋白胨为氮源时壳聚糖酶活力最 高，其次是硫酸铵和硝酸铵，相对酶活力分别达到99％和83％。综合 考虑成本和产率两方面，本发明选用无机氮源硫酸铵作为发酵氮源。
(3)温度对菌株产酶的影响
设定菌株发酵温度分别为28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，测 定发酵液的酶活力，考察温度对发酵产酶的影响。由说明书附图图6 可以看出，32℃时该菌株发酵产酶活力最高，随着温度的升高或降低， 酶活力均呈下降的趋势。
(4)初始pH对菌株产酶的影响
将产酶培养基初始pH分别调至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、 7.5、8.0、8.5，对菌株进行发酵培养，测定发酵液的酶活力，考察 初始pH对发酵产酶的影响。由说明书附图图7可以看出，初始pH对 菌株发酵产酶影响显著，当初始pH调节为6.0，更适于该菌株产壳 聚糖酶。
(5)发酵时间对菌株产酶的影响
将菌株接入产酶培养基中，分别以24h、36h、48h、60h、 72h、84h、96h、108h作为菌株培养时间，测定发酵液酶活力， 考察发酵时间对菌株产酶的影响。在不同发酵时间测定该菌株的产酶 活性，结果说明书附图图8所示，菌株发酵24h即能检测到壳聚糖 酶活力，随着发酵时间延长至72h，发酵液中酶活力达到最高，随 后酶活力呈下降趋势。
(6)装液量对菌株产酶的影响
将500mL三角瓶的培养基装液量分别设为50mL、80mL、100mL、 120mL、150mL、180mL，对菌株进行培养，考察装液量对发酵产酶 的影响。结果如说明书附图图9所示，500mL三角瓶中装液量为120 mL时，菌株产酶活力最高，随着装液量的增加或减少，酶活力都会 受到影响。
(7)接种量对菌株产酶的影响
将种子液以不同接种量2％、4％、6％、8％、10％接入产酶培养基中， 测定发酵液酶活力，考察接种量对发酵产酶的影响。接种量对菌株发 酵产酶影响不大，如说明书附图图10所示，在接种量为4％时，相对 酶活力最高，随着接种量的增加，相对酶活力随之下降，但趋势较缓， 当接种量为10％时，相对酶活力仍保持在90％以上。
(8)正交实验设计
以最适碳源添加量、最适氮源添加量、温度、初始pH、发酵时 间、装液量、接种量为因素，设计七因素三水平正交实验，确定最适 发酵条件。综合单因素实验结果，以粉末壳聚糖添加量、硫酸铵添加 量、初始pH、温度、发酵时间、装液量、接种量为因素，进行L18(37) 正交实验，结果如表2所示，在实验的7个因素中，初始pH、发酵 时间、硫酸铵添加量极差R值较大，其余因素极差R值较小，由此可 见对产壳聚糖酶活力影响较大的3个因素依次为初始pH、发酵时间、 硫酸铵添加量。由K值结果显示，该菌株最适产酶发酵条件为粉末壳 聚糖添加量1.5％，硫酸铵添加量3％，初始pH 6.0，温度32℃，发酵 72h，500mL三角瓶中装液量120mL，接种量4％，在此最适产酶发 酵条件下，蜡状芽孢杆菌116发酵液中壳聚糖酶酶活力可达43.89 U/mL。
表2L18(37)正交实验结果分析
实施例4发酵罐培养蜡状芽孢杆菌116发酵产酶
种子活化后，采用优化后的培养基和培养条件，用16L罐发酵， 控制发酵过程中pH6.0，培养温度32℃，、通风搅拌发酵55h，搅拌 速度为180rpm，通风比为1:0.8，发酵上清液中壳聚糖酶活力为 71.25U/mL，发酵液经过滤处理后，收集上清液，可直接用于壳聚糖的酶解。
实施例5
壳聚糖酶的分离纯化
1.硫酸铵分级沉淀
向粗酶液中缓慢加入硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度达到35％， 4℃静置过夜后6000r/min冷冻离心10min，去除沉淀。在上清液中 继续加入硫酸铵，使其饱和度达到90％，4℃静置过夜后6000r/min 冷冻离心10min，弃去上清，将沉淀重悬于PBS缓冲液(pH 7.5，50mmol/L磷酸盐缓冲液)，把所得蛋白质溶液转移至透析袋中，在相同 缓冲液中4℃透析24h(定时更换缓冲液)。
2.DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析
将透析后的样品加入到用PBS缓冲液预平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱(3×20cm)，先用3倍柱床体积的PBS 缓冲液洗脱至OD 280不变，再用含0-1mol/L氯化钠的PBS缓冲液 进行线性梯度洗脱，体积流量为1mL/min，每管收集6mL，经酶活 力检测后收集有酶活组分。
3.SDS-PAGE检测壳聚糖酶纯度及分子量
采用不连续垂直板电泳系统，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为 12％，缓冲体系为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲液。
结果如说明书附图图11所示，经检测，洗脱下来的蛋白峰中只 有一个峰具有壳聚糖酶活力，将不同纯化步骤后的酶液及标准分子量 蛋白样品进行SDS-PAGE检测，结果如说明书附图图12所示，经离子 交换层析后，壳聚糖酶在SDS-PAGE下只显示一条蛋白质谱带，表明 该酶已达到电泳纯，对应于标准蛋白样品分子量的迁移率，得出该酶 分子量约为43.7kDa。根据实验数据计算壳聚糖酶分步分离纯化结 果，如表3所示，经纯化后，壳聚糖酶的纯化倍数为9.55倍，酶活 回收率为57.88％。
表3壳聚糖酶分离纯化结果
实施例6
壳聚糖酶的酶学性质分析
1.pH对壳聚糖酶活性及酶的稳定性的影响
分别以不同pH缓冲液配制底物和稀释酶液，然后测其酶活力， 考察pH对壳聚糖酶活力的影响；将壳聚糖酶置于不同pH缓冲液中， 4℃保持30min，然后测其残余酶活力，考察pH对壳聚糖酶稳定性 的影响。如说明书附图13、14所示。该酶最适pH为5.6，当pH高 于5.6时，其活性迅速下降，pH为6.0时，相对酶活力已降至60％ 以下，壳聚糖酶在pH 3.6～5.6范围内有较好的催化活力，4℃下维 持30min，该酶相对酶活力仍能保持85％以上。
2.温度对壳聚糖酶活性及酶的稳定性的影响
将壳聚糖酶液置于不同温度下测其活力，考察温度对壳聚糖酶活 力的影响；在不同温度下，将壳聚糖酶液保温1h，然后测其残余酶 活力，考察温度对壳聚糖酶稳定性的影响。如说明书附图15、16所 示，该酶最适反应温度为50℃，在40～55℃范围内，该酶仍能保持 较好的酶活力，相对酶活力在85％以上；该酶在低于40℃时酶活力较 为稳定，但当温度升至50℃时，温浴1h后酶活即完全丧失。
分离纯化的壳聚糖酶分子量为43.7kDa，这与现有技术的芽孢 杆菌属菌株所产壳聚糖酶的分子量25～45kDa范围较为一致，但该 酶的pH稳定范围在pH 3.6-5.6，较其它壳聚糖酶更加耐酸，此外， 当pH升为7.0时，相对酶活力仍能保持在70％以上，可见该酶与其它芽孢杆菌属所产壳聚糖酶相比，不仅对较低的pH环境有耐受能力， 而且对pH的适应范围也相对较宽。
3.金属离子对壳聚糖酶活性的影响
在酶反应体系中分别加入不同金属离子，使其终浓度达到5 mmol/L，4℃保持4h，然后测其酶活力，考察金属离子对壳聚糖酶 活力的影响。
添加不同金属离子(5mmol/L)对壳聚糖酶酶活力的影响如表4所 示，反应体系中Mn2+对该酶有强烈的激活作用，酶活提高了1.12倍。 Mn2+可能参与到壳聚糖酶活性中心的构建，即通过结合酶活性中心以 外的部位，增大酶与底物之间的亲和力，使酶活力得到增强。而金属 离子Cu2+、Ni2+、Fe3+、Ag+对壳聚糖酶有不同程度的抑制作用，酶活分 别降低了33％、29％、28％、35％。由于重金属离子的螯合作用，干扰 了酶对底物的降解，从而导致酶活下降。因此，在以后对该酶的使用 过程中，要严格注意反应体系中金属离子的存在状况。
表4金属离子对壳聚糖酶活力的影响
4.壳聚糖酶的底物特异性
分别以胶体壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素、甲壳素为底物，考 察不同底物对壳聚糖酶活力的影响。
在酶反应体系中分别以1％胶体壳聚糖、葡聚糖、羧甲基纤维素 和甲壳素作为底物，以考察菌株116所产壳聚糖酶对不同底物的降解 特性。结果如表5所示，该酶只对胶体壳聚糖具有降解活性，对葡聚 糖、羧甲基纤维素和甲壳素均没有降解作用。
表5壳聚糖酶的底物特异性
5.壳聚糖酶动力学参数的测定
在壳聚糖酶活力测定体系中，改变底物胶体壳聚糖溶液浓度，以 底物浓度的倒数为横坐标(1/[S])，反应速度的倒数为纵坐标(1/V)， 按照Lineweaver-Burk法作图，求得米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax)。
采用双倒数作图法(Lineweaver-Burk)对该酶动力学参数进行 测定，结果如说明书附图17所示，经线性拟合后，求得该酶的米氏 常数(Km)为11.10mg/mL，最大反应速率(Vmax)为1.38μmol/min·mL。

Claims (9)

1.一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，采用蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)116发酵液进行分离纯化得到壳聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)116，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO：M2017803，保藏日期是2017年12月18日。
3.根据权利要求1所述的一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)116斜面培养基(w/v)：硫酸铵0.5％，磷酸氢二钾0.2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.1％，粉末壳聚糖1.0％，琼脂2.0％，pH 6-7；
种子培养基(w/v)：蛋白胨0.5％，粉末壳聚糖0.5％，葡萄糖0.1％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，pH 6-7；
产酶培养基(w/v)：粉末壳聚糖1.5％，葡萄糖0.1％，硫酸铵2.0％，氯化钠0.5％，磷酸氢二钾0.07％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.3％，硫酸镁0.05％，pH 6-7。
4.根据权利要求1所述的一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，发酵温度为30-32℃，发酵初始pH为6-7，发酵时间50-72h。
5.根据权利要求1所述的一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的分离纯化步骤包括冷冻离心，硫酸铵分级沉淀，阴离子交换层析，浓缩，干燥。
6.根据权利要求5所述的一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的冷冻离心具体为：将发酵液在4-8℃，5000-10000rpm离心5-20min，弃去沉淀，获得发酵上清液。
7.根据权利要求6所述的一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的硫酸铵分级沉淀具体为：向发酵上清液中缓慢加入硫酸铵，边加边搅拌，使溶液中硫酸铵饱和度达到35％，4℃静置过夜后6000rpm冷冻离心10min，去除杂蛋白；在上清液中继续加入硫酸铵，使其饱和度达到90％，4℃静置过夜后6000rpm冷冻离心10min，边加边搅拌，弃去上清，将沉淀重悬于pH7.5，50mmol/L的PBS缓冲液，把所得蛋白质溶液转移至透析袋中，在相同缓冲液中4℃透析24h。
8.根据权利要求7所述的一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，所述的阴离子交换层析具体为：将透析后的样品加入到已用PBS缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，先用3-5倍柱床体积的PBS缓冲液洗脱，再用含0-1mol/L氯化钠的PBS缓冲液进行线性梯度洗脱，收集洗脱液，经酶活力检测后收集有酶活组分。
9.根据权利要求8所述的一种壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，将有酶活组分经浓缩、冷冻干燥后制得固态壳聚糖酶。
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