CN107603884A

CN107603884A - 一株高产中性纤维素酶的里氏木霉突变菌株

Info

Publication number: CN107603884A
Application number: CN201610546552.1A
Authority: CN
Inventors: 吴佳鹏; 刘艳萍; 黄亦钧; 王华明
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2016-07-12
Filing date: 2016-07-12
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明涉及酶制剂技术领域，具体涉及一种里氏木霉突变菌株及其应用。所述突变菌株摇瓶发酵5天后，其发酵上清液中性纤维素酶活为114u/ml，较出发菌株提高了34%，在20L发酵罐小试当中，其发酵上清液中性纤维素酶活达到1335 u/ml，表达量与摇瓶相比放大作用明显，并且该突变菌株在发酵过程中具有菌丝体粗短，溶氧水平高，发酵液黏度低等优点，取得了意料不到的技术效果。所述里氏木霉突变菌株可广泛应用于纤维素酶的生产，从而有利于降低纤维素酶的生产成本，促进纤维素酶在相关领域中的推广与应用。

Description

一株高产中性纤维素酶的里氏木霉突变菌株

技术领域

本发明属于微生物筛选技术领域，具体内容涉及一株高产中性纤维素酶的里氏木霉突变菌株及其应用。

技术背景

纤维素酶是一组可以降解纤维素并最终生成葡萄糖的酶的总称，它不是简单的一种酶，而是在降解纤维素过程中起协同作用的多组分酶系，实质上是指能够水解β-1,4-糖苷键的一类糖苷水解酶。根据酶活力的最佳pH值不同可将纤维素酶分为酸性纤维素酶、碱性纤维素酶和中性纤维素酶。

最适pH在6.0-8.0之间的纤维素酶称为中性纤维素酶，它也是多组分酶系，但各类酶的比例和组成又有其特殊性。因为最早研究的产纤维酶微生物主要是丝状真菌，而这些真菌所产的酶多是酸性纤维素酶，导致中性纤维素酶并未得到充分重视和研究；后来随着纤维素酶的应用越来越广，对纤维素酶的pH和温度适应性要求更高，特别是当纤维素酶在纺织、洗涤剂工业的广泛应用，人们发现酸性纤维素酶由于其pH适应范围窄、在中碱性环境下酶活很低、稳定性差，对染料亲和力更强的氨基酸残基，使得其在生物水洗工艺中带来严重的返沾色问题，在洗涤剂添加方面又无法适应洗涤剂应用的碱性环境，因此中性纤维素酶才开始得到较多研究。

能够产纤维素酶的生物主要有微生物、原生动物、软体动物等，目前研究最多也最成熟的是微生物中的真菌和细菌，理论上这些微生物通过生物技术处理都有产中性纤维素酶的潜力。

目前已知的来源于真菌的纤维素酶多为酸性纤维素酶，常常为胞外全值酶，要使其产中性纤维素酶就需对其进行改造，如韩铭海通过诱变育种筛选到一株产中性纤维素酶的木霉，当然也有一些真菌能产中性纤维素酶，如山东大学从青贮秸秆中分离到一株产胞外中性纤维素酶的丝状真菌。产中性纤维素酶的真菌虽然产酶能力强，但发酵时间往往很长，影响生产强度和效率；而且工业上丝状真菌多为固体发酵产酶，其不利于进行深层液态发酵；由于其为真核生物，产酶基因含有内含子，所产的酶又常常需要诱导，给构建基因工程菌带来不便。

来源于细菌的纤维素酶多为中性或碱性酶，好氧细菌所产的中性纤维素酶多数为胞外酶，厌氧菌产的常以纤维小体形式吸附在细胞壁上，多数细菌产酶无需诱导，同时细菌便于液态发酵、发酵周期短，产酶基因更加适合构建基因工程菌，但细菌所产酶的酶活力较低。因此，开发一株产中性纤维素酶活力高、稳定性强的菌株是目前亟需解决的问题。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产中性纤维素酶的里氏木霉突变菌株及其应用。本发明通过紫外诱变的方法筛选获得一株小菌落的里氏木霉(Trichodermareesei)突变株，能大幅度提高中性纤维素酶的表达量。

本发明一方面涉及一种突变菌株里氏木霉GD-5(Trichoderma reesei GD-5)，已于2016年7月11日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016383。

本发明还涉及上述里氏木霉GD-5在中性纤维素酶生产中的应用。

一种中性纤维素酶，是通过将上述里氏木霉GD-5进行发酵制备得到的。

所述发酵用培养基各组分及其质量百分比分别为：乳糖2％；葡萄糖1％；玉米浆1.5％；硫酸铵0.9％；磷酸二氢钾2％；磷酸氢二铵0.4％；七水硫酸镁0.15％；柠檬酸0.073％；氯化钙0.12％；七水硫酸亚铁0.075％；七水硫酸锌0.006％；五水硫酸铜0.0012％；一水硫酸锰0.00053％；硼酸0.0003％。

本发明所述突变菌株里氏木霉GD-5摇瓶发酵5天后，其发酵上清液中性纤维素酶活为114u/ml，较出发菌株提高了34％，在20L发酵罐小试当中，其发酵上清液中性纤维素酶活达到1335u/ml，表达量与摇瓶相比放大作用明显，并且该突变菌株在发酵过程中具有菌丝体粗短，溶氧水平高，发酵液黏度低等优点，取得了意料不到的技术效果。所述里氏木霉突变菌株可广泛应用于中性纤维素酶的生产，从而有利于降低中性纤维素酶的生产成本，促进中性纤维素酶在相关领域中的推广与应用。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1中性纤维素酶菌株摇瓶发酵及酶活检测

将产中性纤维素酶的里氏木霉HGD43(该菌株是发明人刘艳萍构建的重组表达中性纤维素酶的工程菌)接种到新鲜的PDA平板，30℃培养5-7天。割取2cm×2cm大小的菌块，接种到50ml液体摇瓶培养基(乳糖2％；葡萄糖1％；玉米浆1.5％；硫酸铵0.9％；磷酸二氢钾2％；磷酸氢二铵0.4％；七水硫酸镁0.15％；柠檬酸0.073％；氯化钙0.12％；七水硫酸亚铁0.075％；七水硫酸锌0.006％；五水硫酸铜0.0012％；一水硫酸锰0.00053％；硼酸0.0003％)中发酵，30℃培养2天，然后25℃培养3天。培养5天后，离心发酵液获得上清液即为粗酶液，将发酵上清液进行中性纤维素酶活力测定，酶活为85u/ml。

1、中性纤维素酶活力检测

(1)纤维素酶酶活单位的定义

在50℃，pH6.0条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1umol还原糖所需要的酶量为一个活力单位(IU)，还原糖以葡萄糖等量。

(2)酶活测定方法

(2.1)标准曲线的绘制：

取8支试管按下表加入相关试液后再加入1.5mlDNS试剂，充分摇匀，置沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定容至5.0ml，用0号试管试液作为对照，在540nm波长下测其它各试管试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以(葡萄糖含量/100)为横坐标绘制标准曲线。

试管号	0	1	2	3	4	5	6	7
									缓冲液加入量(ul)	1000	990	985	980	975	970	965	960
葡萄糖标准液加入量(ul)	0	10	15	20	25	30	35	40
									葡萄糖含量(ug)	0	100	150	200	250	300	350	400

(2.2)酶活力测定：

取四支试管各加入0.5ml CMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min，前三支为样品试管，第四支为空白管。在前三支试管中各加入0.5ml待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。

反应完后在前三支试管中各加入1.5ml的DNS试剂。然后依次向各空白管加入1.5mLDNS，最后依次向空白管中补加0.5ml的待测酶液。

取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定到5.0ml。以空白试管试液为对照在540nm波长条件下测定样品管试液的吸光度，吸光度在0.25～0.30之间为宜。若不在此范围，需改变稀释倍数重测。

酶活计算公式：

酶活力(IU/ml或IU/g)＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n

式中：180――葡萄糖从微克换算成微摩尔

15――待测液与底物的反应时间

0.5――加入反应的待测酶液量

n――酶样的稀释倍数

实施例2诱变筛选与发酵验证

确定致死率：将出发菌株里氏木霉HGD43接种于PDA平板，30℃培养5-7d。待菌落表面变白，产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数，使孢子浓度约为5×10⁷个/ml。取一个放入转子的90mm无菌培养皿，加入10ml稀释好的孢子悬液，在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射60s、90s、120s、150s、180s，取照射后的孢子液稀释10000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射120s时，致死率为90％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

诱变筛选：取一个放入转子的90mm无菌培养皿，加入10ml稀释好的孢子悬液(浓度为5×10⁷)，在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射120s，然后黑暗条件下放置30min，稀释10000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

共涂布150个PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出约50个菌落，通过观察菌落形态，挑选菌落形态变异明显的突变体203个接种到PDA复筛平板(每个平板均匀接种12个突变体)，30℃培养2-3d。选取生长状态正常的菌落150个，接种到PDA平板(菌落形态较小的突变株可用无菌棉签划线接种)，30℃培养5-7d。每个突变体菌落割取2cm×2cm大小的菌块，分别接种于50ml液体摇瓶培养基(乳糖2％；葡萄糖1％；玉米浆1.5％；硫酸铵0.9％；磷酸二氢钾2％；磷酸氢二铵0.4％；七水硫酸镁0.15％；柠檬酸0.073％；氯化钙0.12％；七水硫酸亚铁0.075％；七水硫酸锌0.006％；五水硫酸铜0.0012％；一水硫酸锰0.00053％；硼酸0.0003％)中发酵，30℃培养2天，然后25℃培养3天，离心菌体获得上清液即为粗酶液。通过对获得的粗酶液进行中性纤维素酶活力检测，最终筛选出一株中性纤维素酶产量最高的突变菌株，命名为里氏木霉GD-5(Trichoderma reesei GD-5)。与出发菌株相比，该突变菌株菌落形态变小，菌丝体致密且分枝更多，发酵上清液中性纤维素酶酶活达到114u/ml，比出发菌提高了34％。

在20L发酵罐小试当中，该突变菌株发酵上清液中性纤维素酶酶活达到1335u/ml，表达量与摇瓶相比放大作用明显，并且，与出发菌株相比，该突变株在发酵过程中具有菌丝体粗短，溶氧水平高，发酵液黏度低等优点，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2016年7月11日将上述突变菌株里氏木霉GD-5(Trichoderma reeseiGD-5)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016383。

Claims

1.一种里氏木霉（Trichoderma reesei），其特征在于，所述的里氏木霉的保藏号为CCTCC NO：M2016383。

2.权利要求1所述的里氏木霉在中性纤维素酶生产中的应用。

3.一种生产纤维素酶的方法，其特征在于，所述的方法是用权利要求1所述的里氏木霉发酵来制备纤维素酶。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法中用于发酵的培养基各组分及其质量比为：乳糖2%；葡萄糖1%；玉米浆1.5%；硫酸铵0.9%；磷酸二氢钾2%；磷酸氢二铵0.4%；七水硫酸镁0.15%；柠檬酸0.073%；氯化钙0.12%；七水硫酸亚铁0.075%；七水硫酸锌0.006%；五水硫酸铜0.0012%；一水硫酸锰0.00053%；硼酸0.0003%。