CN112375755A - 一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产β‑葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，一种高产β‑葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法包括如下步骤：首先配置培养基及试剂，再活化出发菌种，再对种子进行培养，然后液体发酵培养，再制备单孢子菌悬液，确定最佳诱变时间之后进行对菌株进行ARTP诱变，将诱变得到的菌株进行高通量初筛和摇瓶复筛,最后将得到的高产菌株进行遗传稳定培养。本方法选用黑曲霉作为出发菌株，相较发酵周期更短、β‑葡萄糖苷酶产量更高；采用ARTP诱变技术，相较于传统诱变技术，本方法具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点；通过p‑NPG比色法和DNS法相结合的方法进行高产菌株的筛选，得到的高产菌株更加适合工业化发酵生产β‑葡萄糖苷酶。

Description

一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法
技术领域
本发明涉及一种黑霉素的选育方法，具体为一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，属于纤维素酶水解技术领域。
背景技术
β-葡萄糖苷酶是一种纤维素酶类水解酶，广泛存在于各类生物体中，作用于芳基或羟基与糖基原子团之间的糖苷键，生成β-D－葡萄糖及相应配基。β-葡萄糖苷酶是纤维素酶中的一种，可促进纤维二糖的水解，提高纤维素酶系的水解活性，在纤维素降解过程中发挥着关键作用，如果缺少β-葡萄糖苷酶就会造成纤维二糖的大量积累，而纤维二糖的大量积累又会对纤维素酶的酶解形成强烈的反馈抑制，所以增强纤维素酶体系中β-葡萄糖苷酶的活力是提高纤维素水解效率和增加葡萄糖产量的关键，为了更好地对β-葡萄糖苷酶发酵工艺和酶学特性开展研究，需要一种提取大量且酶活性高的β-葡萄糖苷酶的方法。
提取β-葡萄糖苷酶的现有技术主要有三种，方法一是从各种植物和微生物中分离纯化出β-葡萄糖苷酶，但通过该方法提取的β-葡萄糖苷酶，其酶活力较低、成本高；方法二是利用微生物发酵来生产β-葡萄糖苷酶，但该方法筛选得到的产酶菌株大部分产酶量较低；方法三是通过传统诱变技术选育出β-葡萄糖苷酶高产菌株，虽然该方法使野生型菌株的产酶水平有了很大幅度的提高,但是,到目前为止,仍未选育出能够适合于工业化发酵生产β-葡萄糖苷酶的菌株。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法包括如下步骤：
S1、培养基及试剂的配制，准备斜面培养基、种子培养基、初筛培养基、液体发酵培养基、葡萄糖标准溶液、缓冲溶液、水杨苷溶液、适量的DNS试剂以及相应的实验仪器。
S2、出发菌种的活化，将保藏的黑曲霉菌种划线接种于PDA培养基上，置于培养箱中28℃恒温培养96h。
S3、种子培养，取一环新鲜成熟的斜面培养基上的孢子，接入50mL种子培养基中，在28℃恒温摇床中，以180r/分钟的转速培养种子液24h。
S4、液体发酵培养，取发酵好的种子培养基，按照10％的接种量，将种子液接入250mL装有50mL液体发酵培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/分钟的条件下进行培养。
S5、制备单孢子菌悬液，将培养成熟的种子试管斜面加入5mL无菌生理盐水，用接种环轻轻地将孢子刮下，装入装有玻璃珠的100mL锥形瓶中，25℃150r/分钟震荡30分钟。然后用灭菌后的脱脂棉将锥形瓶中的菌液过滤，制得单孢子悬浮液。通过血球板计数，最终将孢子液制成浓度约为106个/mL的混悬液。
S6、确定最佳诱变时间，将出发菌株分别处理1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟，将诱变后的菌悬液涂布在PDA平板上，以28℃的温度在恒温培养箱中培养4-5天，待长出菌落后，通过菌落数计算菌株的致死率，并绘制出致死率曲线，然后根据不同诱变时间对黑曲霉的ARTP致死率影响，确定最佳诱变时间。
S7、ARTP诱变，用移液枪吸取10微升单孢子菌悬液滴加至载片中央，用无菌镊子将载片放于ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位，并对其进行ARTP诱变处理，诱变时间为S8所确定的最佳诱变时间。
S8、高通量初筛，将制备好的单孢子菌悬液利用ARTP在最佳诱变时间下诱变后，利用微液滴器接种在装有种子培养基的24微孔板中，于30℃，200r/分钟条件下培养12h，然后在无菌条件下，取培养好的种子液10L加入含有底物p-NPG的发酵培养基的96孔板中培养48h,并喷洒Na2CO3，最后挑选有明显黄色圈的菌落，作为高产菌株进入下一轮筛选中。
S9、酶的活性验证，将上述96孔微孔板在4000r/分钟的条件下离心，取上清液5L稀释了适当倍数的粗酶液，于50℃水浴预热10分钟，然后加入100L已预热10分钟的5mmol/Lp-NPG溶液，10分钟后再立即加入1mol/L Na2CO3溶液200L直至终止反应，再将其放置5分钟，最后利用酶标仪测出吸光值。
S10、摇瓶复筛，将高通量初筛的高产菌株进行平板划线分离纯化后，进行摇瓶复筛，通过DNS法来测定所筛选菌株产β-葡萄糖苷酶酶活的能力，酶活大的菌株即为高产菌株。
S11、遗传稳定培养，将高产菌株进行传代培养10代，再进行发酵培养。
优选的，所述S1中的斜面培养基为PDA培养基，且所述PDA培养基由200g马铃薯、20g琼脂以及20g葡萄糖配置而成，所述种子培养基由0.5g磷酸二氢钾、10g硫酸铵、1g七水硫酸镁以及10g葡萄糖配置而成，所述初筛培养基由固含量为20％的土豆汁、浓度为2％的蔗糖、灭菌冷却后的p-NPG配置而成，所述液体发酵培养基由20g麸皮、1g硫酸铵、2g磷酸二氢钾、0.2g七水硫酸镁以及0.2g七水硫酸亚铁配制而成，所述初筛培养基和液体发酵培养基均保持自然PH，无需调PH值。
优选的，所述S1中的葡萄糖标准溶液的配置方法为：称取烘干至恒重的分析葡萄糖1g，用蒸馏水溶解，加50mL的浓盐酸，定容至1000mL，混匀，再放置到4℃冰箱中保存备用，所述缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配置方法为：称取柠檬酸9.66g和柠檬酸钠15.88g溶于一定量的水中，之后转入1000mL容量瓶，定容至刻度,然后调节溶液的pH到4.8±0.05，备用，所述水杨苷溶液的配置方法为：准确称取1g水杨苷，溶于pH4.8的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，再用容量瓶中定容至100mL，最后贮存于冰箱中备用，所述DNS试剂的配置方法为：将2.0g结晶酚溶于5mL10％NaOH溶液中,用水稀释23mL再加入2.30gNa2CO3，从而得到甲液，将85g酒石酸钠溶于100mLNaOH溶液中,再加入293mL的水杨苷溶液中，从而得到乙液，最后将甲液和乙液混合于棕色瓶子室温保存7－10天备用。
优选的，所述S1中的实验仪器包括高压灭菌锅、简易等离子体诱变育种仪、鼓风干燥箱、恒温培养箱、超恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、恒温摇床、超净工作台、光吸收型全波长酶标仪、电子分析天平、漩涡振荡器以及一些试剂瓶。
优选的，所述S5之前，需要用葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液以及DNS试剂混合后的液体吸光度和实际葡萄糖含量，来绘制葡萄糖标准曲线。
优选的，所述S6中的ARTP为一种主要的随机选育方法。
优选的，所述S7中的ARTP诱变处理条件为：调照射距离2mm，气流量10L/分钟，功率100W。
优选的，所述S8中采用自制微液滴装置，通过添加p-NPG底物的深孔板进行高通量培养，根据pNP在碱性条件下显色的原理，建立ARTP诱变高通量筛选方法，并获得高产β-葡萄糖苷酶的优势菌株。
优选的，所述S9中应于400nm处用酶标仪测吸光值。
优选的，所述S10中，一般筛选出1-3株优势菌株。
本发明的有益效果是：
(1)本发明选用黑曲霉作为出发菌株来选育出高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，从而提取所需β-葡萄糖苷酶用于研究其发酵工艺和酶学特性，相较于现有技术，本发明发酵周期短、β-葡萄糖苷酶产量高、安全可靠，且发酵过程无有毒物质的产生；
(2)本发明对黑曲霉采用ARTP诱变技术，相较于传统诱变技术，本发明利用ARTP进行微生物诱变育种具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点，而且该方法使用温度低，活性粒子种类多样，使用简便、突变率高，而且在正式诱变之前，本发明通过实验不同诱变时间对黑曲霉的ARTP致死率影响，从而确定最佳诱变时间，保证正式诱变后能获得最大量的突变体库。
(3)本发明在选育过程中，对诱变后的黑曲霉菌株进行高通量初筛和摇瓶复筛，高通量初筛是通过p-NPG比色法来筛选出高产β-葡萄糖苷酶且β-葡萄糖苷酶活性高的菌株，该方法操作简单，且分辨方法简单，摇瓶复筛采用的是DNS法，相较于现有技术，本发明通过将两种筛选方法相结合的方式来筛选高产菌株的方法能够选育出适合工业化发酵生产β-葡萄糖苷酶的菌株。
附图说明
图1为本发明方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：
一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，所述一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法包括如下步骤：
S1、培养基及试剂的配制，准备斜面培养基、种子培养基、初筛培养基、液体发酵培养基、葡萄糖标准溶液、缓冲溶液、水杨苷溶液、适量的DNS试剂以及相应的实验仪器；
S2、出发菌种的活化，将保藏的黑曲霉菌种划线接种于PDA培养基上，置于培养箱中28℃恒温培养96h；
S3、种子培养，取一环新鲜成熟的斜面培养基上的孢子，接入50mL种子培养基中，在28℃恒温摇床中，以180r/分钟的转速培养种子液24h；
S4、液体发酵培养，取发酵好的种子培养基，按照10％的接种量，将种子液接入250mL装有50mL液体发酵培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/分钟的条件下进行培养；
S5、制备单孢子菌悬液，将培养成熟的种子试管斜面加入5mL无菌生理盐水，用接种环轻轻地将孢子刮下，装入装有玻璃珠的100mL锥形瓶中，25℃150r/分钟震荡30分钟。然后用灭菌后的脱脂棉将锥形瓶中的菌液过滤，制得单孢子悬浮液。通过血球板计数，最终将孢子液制成浓度约为106个/mL的混悬液；
S6、确定最佳诱变时间，将出发菌株分别处理1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟，将诱变后的菌悬液涂布在PDA平板上，以28℃的温度在恒温培养箱中培养4-5天，待长出菌落后，通过菌落数计算菌株的致死率，并绘制出致死率曲线，然后根据不同诱变时间对黑曲霉的ARTP致死率影响，确定最佳诱变时间；
S7、ARTP诱变，用移液枪吸取10微升单孢子菌悬液滴加至载片中央，用无菌镊子将载片放于ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位，并对其进行ARTP诱变处理，诱变时间为S8所确定的最佳诱变时间；
S8、高通量初筛，将制备好的单孢子菌悬液利用ARTP在最佳诱变时间下诱变后，利用微液滴器接种在装有种子培养基的24微孔板中，于30℃，200r/分钟条件下培养12h，然后在无菌条件下，取培养好的种子液10L加入含有底物p-NPG的发酵培养基的96孔板中培养48h,并喷洒Na2CO3，最后挑选有明显黄色圈的菌落，作为高产菌株进入下一轮筛选中；
S9、酶的活性验证，将上述96孔微孔板在4000r/分钟的条件下离心，取上清液5L稀释了适当倍数的粗酶液，于50℃水浴预热10分钟，然后加入100L已预热10分钟的5mmol/Lp-NPG溶液，10分钟后再立即加入1mol/L Na2CO3溶液200L直至终止反应，再将其放置5分钟，最后利用酶标仪测出吸光值；
S10、摇瓶复筛，将高通量初筛的高产菌株进行平板划线分离纯化后，进行摇瓶复筛，通过DNS法来测定所筛选菌株产β-葡萄糖苷酶酶活的能力，酶活大的菌株即为高产菌株；
S11、遗传稳定培养，将高产菌株进行传代培养10代，再进行发酵培养。
所述S1中的斜面培养基为PDA培养基，且所述PDA培养基由200g马铃薯、20g琼脂以及20g葡萄糖配置而成，所述种子培养基由0.5g磷酸二氢钾、10g硫酸铵、1g七水硫酸镁以及10g葡萄糖配置而成，所述初筛培养基由固含量为20％的土豆汁、浓度为2％的蔗糖、灭菌冷却后的p-NPG配置而成，所述液体发酵培养基由20g麸皮、1g硫酸铵、2g磷酸二氢钾、0.2g七水硫酸镁以及0.2g七水硫酸亚铁配制而成，所述初筛培养基和液体发酵培养基均保持自然PH，无需调PH值。
所述S1中的葡萄糖标准溶液的配置方法为：称取烘干至恒重的分析葡萄糖1g，用蒸馏水溶解，加50mL的浓盐酸，定容至1000mL，混匀，再放置到4℃冰箱中保存备用，所述缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配置方法为：称取柠檬酸9.66g和柠檬酸钠15.88g溶于一定量的水中，之后转入1000mL容量瓶，定容至刻度,然后调节溶液的pH到4.8±0.05，备用，所述水杨苷溶液的配置方法为：准确称取1g水杨苷，溶于pH4.8的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，再用容量瓶中定容至100mL，最后贮存于冰箱中备用，所述DNS试剂的配置方法为：将2.0g结晶酚溶于5mL10％NaOH溶液中,用水稀释23mL再加入2.30gNa2CO3，从而得到甲液，将85g酒石酸钠溶于100mLNaOH溶液中,再加入293mL的水杨苷溶液中，从而得到乙液，最后将甲液和乙液混合于棕色瓶子室温保存7－10天备用。
所述S1中的实验仪器包括高压灭菌锅、简易等离子体诱变育种仪、鼓风干燥箱、恒温培养箱、超恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、恒温摇床、超净工作台、光吸收型全波长酶标仪、电子分析天平、漩涡振荡器以及一些试剂瓶。
所述S5之前，需要用葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液以及DNS试剂混合后的液体吸光度和实际葡萄糖含量，来绘制葡萄糖标准曲线。
所述S6中的ARTP为一种主要的随机选育方法。
所述S7中的ARTP诱变处理条件为：调照射距离2mm，气流量10L/分钟，功率100W。
所述S8中采用自制微液滴装置，通过添加p-NPG底物的深孔板进行高通量培养，根据pNP在碱性条件下显色的原理，建立ARTP诱变高通量筛选方法，并获得高产β-葡萄糖苷酶的优势菌株。
所述S9中应于400nm处用酶标仪测吸光值。
所述S10中，一般筛选出1-3株优势菌株。
上述选育方法发酵周期短、β-葡萄糖苷酶产量高、安全可靠，且发酵过程无有毒物质的产生。
实施例二：
一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，所述一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法包括如下步骤：
S1、培养基及试剂的配制，准备斜面培养基、种子培养基、初筛培养基、液体发酵培养基、葡萄糖标准溶液、缓冲溶液、水杨苷溶液、适量的DNS试剂以及相应的实验仪器；
S2、出发菌种的活化，将保藏的黑曲霉菌种划线接种于PDA培养基上，置于培养箱中28℃恒温培养96h；
S3、种子培养，取一环新鲜成熟的斜面培养基上的孢子，接入50mL种子培养基中，在28℃恒温摇床中，以180r/分钟的转速培养种子液24h；
S4、液体发酵培养，取发酵好的种子培养基，按照10％的接种量，将种子液接入250mL装有50mL液体发酵培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/分钟的条件下进行培养；
S5、制备单孢子菌悬液，将培养成熟的种子试管斜面加入5mL无菌生理盐水，用接种环轻轻地将孢子刮下，装入装有玻璃珠的100mL锥形瓶中，25℃150r/分钟震荡30分钟。然后用灭菌后的脱脂棉将锥形瓶中的菌液过滤，制得单孢子悬浮液。通过血球板计数，最终将孢子液制成浓度约为106个/mL的混悬液；
S6、确定最佳诱变时间，将出发菌株分别处理1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟，将诱变后的菌悬液涂布在PDA平板上，以28℃的温度在恒温培养箱中培养4-5天，待长出菌落后，通过菌落数计算菌株的致死率，并绘制出致死率曲线，然后根据不同诱变时间对黑曲霉的ARTP致死率影响，确定最佳诱变时间；
S7、ARTP诱变，用移液枪吸取10微升单孢子菌悬液滴加至载片中央，用无菌镊子将载片放于ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位，并对其进行ARTP诱变处理，诱变时间为S8所确定的最佳诱变时间；
S8、高通量初筛，将制备好的单孢子菌悬液利用ARTP在最佳诱变时间下诱变后，利用微液滴器接种在装有种子培养基的24微孔板中，于30℃，200r/分钟条件下培养12h，然后在无菌条件下，取培养好的种子液10L加入含有底物p-NPG的发酵培养基的96孔板中培养48h,并喷洒Na2CO3，最后挑选有明显黄色圈的菌落，作为高产菌株进入下一轮筛选中；
S9、酶的活性验证，将上述96孔微孔板在4000r/分钟的条件下离心，取上清液5L稀释了适当倍数的粗酶液，于50℃水浴预热10分钟，然后加入100L已预热10分钟的5mmol/Lp-NPG溶液，10分钟后再立即加入1mol/L Na2CO3溶液200L直至终止反应，再将其放置5分钟，最后利用酶标仪测出吸光值；
S10、摇瓶复筛，将高通量初筛的高产菌株进行平板划线分离纯化后，进行摇瓶复筛，通过DNS法来测定所筛选菌株产β-葡萄糖苷酶酶活的能力，酶活大的菌株即为高产菌株；
S11、遗传稳定培养，将高产菌株进行传代培养10代，再进行发酵培养。
所述S1中的斜面培养基为PDA培养基，且所述PDA培养基由200g马铃薯、20g琼脂以及20g葡萄糖配置而成，所述种子培养基由0.5g磷酸二氢钾、10g硫酸铵、1g七水硫酸镁以及10g葡萄糖配置而成，所述初筛培养基由固含量为20％的土豆汁、浓度为2％的蔗糖、灭菌冷却后的p-NPG配置而成，所述液体发酵培养基由20g麸皮、1g硫酸铵、2g磷酸二氢钾、0.2g七水硫酸镁以及0.2g七水硫酸亚铁配制而成，所述初筛培养基和液体发酵培养基均保持自然PH，无需调PH值。
所述S1中的葡萄糖标准溶液的配置方法为：称取烘干至恒重的分析葡萄糖1g，用蒸馏水溶解，加50mL的浓盐酸，定容至1000mL，混匀，再放置到4℃冰箱中保存备用，所述缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配置方法为：称取柠檬酸9.66g和柠檬酸钠15.88g溶于一定量的水中，之后转入1000mL容量瓶，定容至刻度,然后调节溶液的pH到4.8±0.05，备用，所述水杨苷溶液的配置方法为：准确称取1g水杨苷，溶于pH4.8的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，再用容量瓶中定容至100mL，最后贮存于冰箱中备用，所述DNS试剂的配置方法为：将2.0g结晶酚溶于5mL10％NaOH溶液中,用水稀释23mL再加入2.30gNa2CO3，从而得到甲液，将85g酒石酸钠溶于100mLNaOH溶液中,再加入293mL的水杨苷溶液中，从而得到乙液，最后将甲液和乙液混合于棕色瓶子室温保存7－10天备用。
所述S1中的实验仪器包括高压灭菌锅、简易等离子体诱变育种仪、鼓风干燥箱、恒温培养箱、超恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、恒温摇床、超净工作台、光吸收型全波长酶标仪、电子分析天平、漩涡振荡器以及一些试剂瓶。
所述S5之前，需要用葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液以及DNS试剂混合后的液体吸光度和实际葡萄糖含量，来绘制葡萄糖标准曲线。
所述S6中的ARTP为一种主要的随机选育方法。
所述S7中的ARTP诱变处理条件为：调照射距离2mm，气流量10L/分钟，功率100W。
所述S8中采用自制微液滴装置，通过添加p-NPG底物的深孔板进行高通量培养，根据pNP在碱性条件下显色的原理，建立ARTP诱变高通量筛选方法，并获得高产β-葡萄糖苷酶的优势菌株。
所述S9中应于400nm处用酶标仪测吸光值。
所述S10中，一般筛选出1-3株优势菌株。
上述选育方法操作简便、成本低，能选育出适合于工业化发酵生产β-葡萄糖苷酶的菌株。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法包括如下步骤：
S1、培养基及试剂的配制，准备斜面培养基、种子培养基、初筛培养基、液体发酵培养基、葡萄糖标准溶液、缓冲溶液、水杨苷溶液、适量的DNS试剂以及相应的实验仪器；
S2、出发菌种的活化，将保藏的黑曲霉菌种划线接种于PDA培养基上，置于培养箱中28℃恒温培养96h；
S3、种子培养，取一环新鲜成熟的斜面培养基上的孢子，接入50mL种子培养基中，在28℃恒温摇床中，以180r/分钟的转速培养种子液24h；
S4、液体发酵培养，取发酵好的种子培养基，按照10％的接种量，将种子液接入250mL装有50mL液体发酵培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/分钟的条件下进行培养；
S5、制备单孢子菌悬液，将培养成熟的种子试管斜面加入5mL无菌生理盐水，用接种环轻轻地将孢子刮下，装入装有玻璃珠的100mL锥形瓶中，25℃150r/分钟震荡30分钟。然后用灭菌后的脱脂棉将锥形瓶中的菌液过滤，制得单孢子悬浮液。通过血球板计数，最终将孢子液制成浓度约为106个/mL的混悬液；
S6、确定最佳诱变时间，将出发菌株分别处理1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟，将诱变后的菌悬液涂布在PDA平板上，以28℃的温度在恒温培养箱中培养4-5天，待长出菌落后，通过菌落数计算菌株的致死率，并绘制出致死率曲线，然后根据不同诱变时间对黑曲霉的ARTP致死率影响，确定最佳诱变时间；
S7、ARTP诱变，用移液枪吸取10微升单孢子菌悬液滴加至载片中央，用无菌镊子将载片放于ARTP系统操作室旋转台上的对应孔位，并对其进行ARTP诱变处理，诱变时间为S8所确定的最佳诱变时间；
S8、高通量初筛，将制备好的单孢子菌悬液利用ARTP在最佳诱变时间下诱变后，利用微液滴器接种在装有种子培养基的24微孔板中，于30℃，200r/分钟条件下培养12h，然后在无菌条件下，取培养好的种子液10L加入含有底物p-NPG的发酵培养基的96孔板中培养48h,并喷洒Na2CO3，最后挑选有明显黄色圈的菌落，作为高产菌株进入下一轮筛选中；
S9、酶的活性验证，将上述96孔微孔板在4000r/分钟的条件下离心，取上清液5L稀释了适当倍数的粗酶液，于50℃水浴预热10分钟，然后加入100L已预热10分钟的5mmol/Lp-NPG溶液，10分钟后再立即加入1mol/L的Na2CO3溶液200L直至终止反应，再将其放置5分钟，最后利用酶标仪测出吸光值；
S10、摇瓶复筛，将高通量初筛的高产菌株进行平板划线分离纯化后，进行摇瓶复筛，通过DNS法来测定所筛选菌株产β-葡萄糖苷酶酶活的能力，酶活大的菌株即为高产菌株；
S11、遗传稳定培养，将高产菌株进行传代培养10代，再进行发酵培养。
2.根据权利要求1所述的一种高产β一葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S1中的斜面培养基为PDA培养基，且所述PDA培养基由200g马铃薯、20g琼脂以及20g葡萄糖配置而成，所述种子培养基由0.5g磷酸二氢钾、10g硫酸铵、1g七水硫酸镁以及10g葡萄糖配置而成，所述初筛培养基由固含量为20％的土豆汁、浓度为2％的蔗糖、灭菌冷却后的p-NPG配置而成，所述液体发酵培养基由20g麸皮、1g硫酸铵、2g磷酸二氢钾、0.2g七水硫酸镁以及0.2g七水硫酸亚铁配制而成，所述初筛培养基和液体发酵培养基均保持自然PH，无需调PH值。
3.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S1中的葡萄糖标准溶液的配置方法为：称取烘干至恒重的分析葡萄糖1g，用蒸馏水溶解，加50mL的浓盐酸，定容至1000mL，混匀，再放置到4℃冰箱中保存备用，所述缓冲溶液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的配置方法为：称取柠檬酸9.66g和柠檬酸钠15.88g溶于一定量的水中，之后转入1000mL容量瓶，定容至刻度,然后调节溶液的pH到4.8±0.05，备用，所述水杨苷溶液的配置方法为：准确称取1g水杨苷，溶于pH4.8的0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中，再用容量瓶中定容至100mL，最后贮存于冰箱中备用，所述DNS试剂的配置方法为：将2.0g结晶酚溶于5mL10％NaOH溶液中,用水稀释23mL再加入2.30gNa2CO3，从而得到甲液，将85g酒石酸钠溶于100mLNaOH溶液中,再加入293mL的水杨苷溶液中，从而得到乙液，最后将甲液和乙液混合于棕色瓶子室温保存7－10天备用。
4.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S1中的实验仪器包括高压灭菌锅、简易等离子体诱变育种仪、鼓风干燥箱、恒温培养箱、超恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、恒温摇床、超净工作台、光吸收型全波长酶标仪、电子分析天平、漩涡振荡器以及一些试剂瓶。
5.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S5之前，需要用葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液以及DNS试剂混合后的液体吸光度和实际葡萄糖含量，来绘制葡萄糖标准曲线。
6.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S6中的ARTP为一种主要的随机选育方法。
7.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S7中的ARTP诱变处理条件为：调照射距离2mm，气流量10L/分钟，功率100W。
8.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S8中采用自制微液滴装置，通过添加p-NPG底物的深孔板进行高通量培养，根据pNP在碱性条件下显色的原理，建立ARTP诱变高通量筛选方法，并获得高产β-葡萄糖苷酶的优势菌株。
9.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S9中应于400nm处用酶标仪测吸光值。
10.根据权利要求1所述的一种高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉的选育方法，其特征在于：所述S10中，一般筛选出1-3株优势菌株。
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