CN112662583A - 一种适用于葛仙米营养生长的改良培养基及配制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于葛仙米营养生长的改良培养基及配制方法：分别配制A液母液、B液母液、C液母液、D液母液、E液母液，F液母液；A液为硝酸钠25.0g/L，磷酸氢二钾0.800g/L和七水合硫酸镁1.50g/L；B液为柠檬酸3.00g/L，柠檬酸铁铵3.00g/L和乙二胺四乙酸二钠0.500g/L；C液为无水氯化钙13.6g/L；D液为碳酸钠20.0g/L；E液为硼酸2.86g/L，四水合氯化锰1.81g/L，七水合硫酸锌0.220g/L，钼酸钠0.390g，五水合硫酸铜0.0800g/L和六水合氯化钴0.0400g/L；F液为土壤浸出液，以1000g土壤加洁净自来水1000mL搅拌，用滤纸滤过而得。溶剂为蒸馏水，使用时依次将定量A液、B液、C液、D液、E液和F液母液溶于溶剂中，用氢氧化钠或盐酸调节pH值到7.1，在121℃，0.1Mpa，灭菌20min。本发明的改良培养基可储存。
Description
技术领域
本发明涉及一种适用于微藻养殖的培养基及配制方法，具体涉及一种适用于葛仙米生长的改良培养基及配制方法，尤其涉及一种适用于葛仙米营养生长的改良培养基及配制方法，该培养基适用于普通葛仙米和翡翠绿葛仙米的规模化培养。
背景技术
葛仙米（Nostoc sphaeroides Kützing），俗称田木耳、天仙米，是一种多细胞群体淡水蓝藻，在分类学上属于蓝藻门（Cyanophyta），蓝藻纲（Cyanophyceae），藻殖段目（Hormogonales），念珠藻科（Nostocaceae），念珠藻属（Nostoc）。葛仙米是我国传统出口的一种珍贵野生食药两用蓝藻，具有丰富的营养价值。根据现代营养检测分析，葛仙米富含蛋白质、维生素、微量元素和藻胆蛋白，葛仙米的藻胆蛋白具有抗氧化和提高免疫力的功效。其中，葛仙米还可以分泌多种具生物活性的胞外多糖，多糖具有抗肿瘤、免疫、降血糖、抗病毒等生物活性。随着对葛仙米多糖的深入研究，有望生产出新的制剂或药物，其在临床应用方面具有良好的前景。野生葛仙米常见于河流石块和水稻田中，在我国大部分地区有分布，其中湖北鹤峰的走马镇产量最多，最高年产量曾达25×103kg干藻体，现在由于农药化肥的使用，使其产量锐减至0.5×103kg。因此，葛仙米的人工培植技术势在必行，葛仙米营养培养基及其高效的配制方法日趋重要。
葛仙米的发育存在不可动的原植体期和可动的藻殖段期两个明显而重要的个体发育阶段。对于葛仙米的藻殖段发育过程，一般都会经历失去伪空泡，形成胶鞘，分化出异形胞，经双线期，非丝状体到丝状体期，最后形成原植体，原植体在有硝态氮的情况下形成较快。在有硝态氮存在的情况下，葛仙米的异形胞数量会减少，但是并不阻止异形胞的分化。目前工厂化大规模培养葛仙米最大的壁垒就在于原植体期的葛仙米群体容易发生破裂，严重降低产量。
葛仙米培养一般采取传统BG11培养基，传统BG11培养基配方为硝酸钠1.50g/L，磷酸氢二钾0.0400g/L，七水硫酸镁0.0750g/L，二水氯化钙0.0360g/L，柠檬酸0.00600g/L，柠檬酸铁铵0.00600g/L，乙二胺四乙酸二钠0.00100g/L，碳酸钠0.0200g/L，微量元素溶液1.0mL内含高硼酸2.86g/L，氯化锰1.81g/L，硫酸锌0.222g/L，钼酸钠0.390g/L，五水硫酸铜0.0790g/L和硝酸钴45.4g/L。该培养基已在实验室和工厂化养殖中沿用多年，且有在葛仙米培养方面取得不错的效果。但是，传统BG11培养基仍有不足之处。1.传统培养基由于配方之间没有分批投放，易导致如七水合硫酸镁中的硫酸根离子和二水合氯化钙中的钙离子结合生成沉淀使培养基中营养缺失。2.传统培养基由于失效快，只能现用现配，无法储存，使用繁琐。3.传统培养基所使用的配方原料价格偏高，不符合大规模工厂化生产节约成本的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种适用于葛仙米营养生长的改良培养基及配制方法，对传统BG11培养基进行改良，可以有效解决传统培养基易生成沉淀导致营养缺失，无法存储，使用繁琐，原料价格高等技术缺陷。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种适用于葛仙米营养生长的改良培养基的配制方法，配制方法为：先分别配制A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液、D溶液母液、E溶液母液和F溶液母液分别保存；使用时，依次将A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液、D溶液母液、E溶液母液和F溶液母液溶于溶剂中，调节pH后，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min，待培养基温度降到室温后，即可接种葛仙米的藻种。
进一步的，所述的配制方法具体包括以下步骤：
（1）配制A溶液母液：称取25.0g硝酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.800g磷酸氢二钾溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取1.50g七水合硫酸镁溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硝酸钠溶液、磷酸氢二钾溶液和七水合硫酸镁溶液混合均匀，用溶剂定容至1 L配成A液母液，使硝酸钾浓度为25.0g/L，磷酸氢二钾浓度为0.800g/L，七水合硫酸镁浓度为1.50g/L；
（2）配制B溶液母液：称取3.00g柠檬酸溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取3.00g柠檬酸铁铵溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.500g乙二胺四乙酸二钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的柠檬酸溶液、柠檬酸铁铵溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液混合均匀，用溶剂定容至1 L配成B液母液，使柠檬酸浓度为3.00g/L，柠檬酸铁铵浓度为3.00g/L和乙二胺四乙酸二钠浓度为0.500g/L；
（3）配制C溶液母液：称取13.6 g无水氯化钙溶于少量溶剂中使之完全溶解，用溶剂定容至1 L配成C液母液，使氯化钙浓度为 13.6 g/L；
（4）配制D溶液母液：称取20.0g碳酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解，用溶剂定容至1 L配成D液母液，使碳酸钠浓度为20.0g/L；
（5）配制E溶液母液：称取2.86g硼酸溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取1.81g四水合氯化锰溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.220g七水合硫酸锌溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.390g钼酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.0800mg五水合硫酸铜溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.0400mg六水合氯化钴溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硼酸溶液、四水合氯化锰溶液、七水合硫酸锌溶液、钼酸钠溶液、五水合硫酸铜溶液和六水合氯化钴溶液混合在一起，用溶剂定容至1 L配成E溶液母液，使硼酸浓度为2.86g/L，四水合氯化锰浓度为1.81g/L，七水合硫酸锌浓度为0.220g/L，钼酸钠浓度为0.390g，五水合硫酸铜浓度为0.0800g/L和六水合氯化钴浓度为0.0400g/L；
（6）配制F溶液母液：称取1000g土壤加溶剂1000mL搅拌，用滤纸滤过得到土壤浸出液，再用溶剂定容至1L；
（7）使用时，取40.0 mL A溶液母液、1.50mL B溶液母液、1.50mL C溶液母液、0.800mL D溶液母液，0.800mL E溶液母液和500mL F溶液母液，最后用溶剂定容至1 L；使A液使硝酸钾浓度为25.0g/L，磷酸氢二钾浓度为0.800g/L，七水合硫酸镁浓度为1.50g/L，B液柠檬酸浓度为3.00g/L，柠檬酸铁铵浓度为3.00g/L和乙二胺四乙酸二钠浓度为0.500g/L，C液氯化钙浓度为 13.6 g/L，D液碳酸钠浓度为20.0g/L，E液硼酸浓度为2.86g/L，四水合氯化锰浓度为1.81g/L，七水合硫酸锌浓度为0.220g/L，钼酸钠浓度为0.390g，五水合硫酸铜浓度为0.0800g/L和六水合氯化钴浓度为0.0400g/L；用NaOH或HCl调节pH值到7.1，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min，待培养基温度降到室温后，即可接种葛仙米的藻种。
进一步的，所述的A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液、D溶液母液、E溶液母液和F溶液母液分别于4℃、避光条件下保存，可以保存1-2个月。
进一步的，所述的溶剂为蒸馏水。
本发明还提供一种按照上述配制方法配制而成的改良培养基。
进一步的，所述的改良培养基用于葛仙米生长培养。
进一步的，所述的改良培养基用于普通葛仙米和翡翠绿葛仙米的规模化培养。
本发明所述的配制方法操作简单，可储存；获得的改良培养基，营养均衡、成本低，培养藻种生长率和生物量积累高，特别有利于提高工厂化生产效率，特别有利于提升现有情况下工厂化微藻培养的效率。
具体实施方式
下面结合实施例来对本发明配制方法以及获得的改良培养基进行具体的描述：
实施例1：
一种适用于葛仙米生长的改良培养基的配制方法，包括以下步骤：
（1）配制A溶液母液：称取25.0g硝酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.800g磷酸氢二钾溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取1.50g七水合硫酸镁溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硝酸钠溶液、磷酸氢二钾溶液和七水合硫酸镁溶液混合均匀，用溶剂定容至1 L配成A液母液，使硝酸钾浓度为25.0g/L，磷酸氢二钾浓度为0.800g/L，七水合硫酸镁浓度为1.50g/L；
（2）配制B溶液母液：称取3.00g柠檬酸溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取3.00g柠檬酸铁铵溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.500g乙二胺四乙酸二钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的柠檬酸溶液、柠檬酸铁铵溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液混合均匀，用溶剂定容至1 L配成B液母液，使柠檬酸浓度为3.00g/L，柠檬酸铁铵浓度为3.00g/L和乙二胺四乙酸二钠浓度为0.500g/L；
（3）配制C溶液母液：称取13.6 g无水氯化钙溶于少量溶剂中使之完全溶解，用溶剂定容至1 L配成C液母液，使氯化钙浓度为 13.6 g/L；
（4）配制D溶液母液：称取20.0g碳酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解，用溶剂定容至1 L配成D液母液，使碳酸钠浓度为20.0g/L；
（5）配制E溶液母液：称取2.86g硼酸溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取1.81g四水合氯化锰溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.220g七水合硫酸锌溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.390g钼酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.0800mg五水合硫酸铜溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.0400mg六水合氯化钴溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硼酸溶液、四水合氯化锰溶液、七水合硫酸锌溶液、钼酸钠溶液、五水合硫酸铜溶液和六水合氯化钴溶液混合在一起，用溶剂定容至1 L配成E溶液母液，使硼酸浓度为2.86g/L，四水合氯化锰浓度为1.81g/L，七水合硫酸锌浓度为0.220g/L，钼酸钠浓度为0.390g，五水合硫酸铜浓度为0.0800g/L和六水合氯化钴浓度为0.0400g/L；
（6）配制F溶液母液：称取1000g土壤加溶剂1000mL搅拌，用滤纸滤过得到土壤浸出液，再用溶剂定容至1L；
（7）使用时，取40.0 mL A溶液母液、1.50mL B溶液母液、1.50mL C溶液母液、0.800mL D溶液母液，0.800mL E溶液母液和500mL F溶液母液，最后用溶剂定容至1 L。使A液、B液、C液、D液、E液、F液各化合物的最终浓度如表1所示；用NaOH或HCl调节pH值到7.1，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min，即得改良培养基。
所述的溶剂为蒸馏水。
表1：本发明改良培养基配方含中文名与化学式对照表:
应用实施例1：本发明现配改良培养基培养普通葛仙米：
（1）准备：6个5L已高压灭菌透明玻璃锥形瓶，实验组3个5L透明玻璃锥形瓶内含本发明改良培养基，对照组3个5L透明玻璃锥形瓶内含传统BG11培养基，pH均用pH计调为7.1，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min，培养基均为现用现配，并且每瓶内均含3L培养基；
（2）接种：第1天在实验组、对照组分别接种普通葛仙米指数生长期藻殖段藻种，使每锥形瓶中细胞接种密度均为1.0×106cells/ml；
（3）培养：实验组和对照组在同一光照培养箱中培养，光暗周期8:16，温度23℃，光强50μmol·m-2·s-1；实验组和对照组均采取充气培养；
（4）结果比较：培养10天后，实验组葛仙米群体密度达2.0×106 cells/ml，对照组葛仙米群体密度达1.6×106 cells/ml；实验组相对于对照组，葛仙米产量提高了25.00%。
应用实施例2：本发明储存1个月的改良培养基培养普通葛仙米：
（1）准备：6个5L已高压灭菌透明玻璃锥形瓶，实验组3个5L透明玻璃锥形瓶内含本发明改良培养基，对照组3个5L透明玻璃锥形瓶内含传统BG11培养基，本发明改良培养基的A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液、D溶液母液、E溶液母液和F溶液母液分别于4℃、避光条件下储存1个月，然后配制成改良培养基；传统BG11培养也于4℃、避光条件下储存1个月之后使用；两种培养基pH均用pH计调为7.1，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min，并且每瓶内均含3L培养基；
（2）接种：第1天在实验组、对照组接种普通葛仙米指数生长期藻殖段藻种，使每锥形瓶中细胞接种密度均为1.0×106cells/ml；
（3）培养：实验组和对照组在同一光照培养箱中培养，光暗周期8:16，温度23℃，光强50μmol·m-2·s-1；实验组和对照组均采取充气培养；
（4）结果比较：培养10天后，实验组葛仙米群体密度达1.8×106 cells/ml，对照组葛仙米群体密度达1.4×106 cells/ml；实验组相对于对照组，细胞培养浓度提高了28.57%。
应用实施例3：本发明现配改良培养基培养翡翠绿葛仙米：
（1）准备：6个5L已高压灭菌透明玻璃锥形瓶，实验组3个5L透明玻璃锥形瓶内含本发明改良培养基，对照组3个5L透明玻璃锥形瓶内含传统BG11培养基，pH均用pH计调为7.1，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min，培养基均为现用现配，并且每瓶内均含3L培养基；
（2）接种：第1天在实验组、对照组分别接种翡翠绿葛仙米指数生长期藻殖段藻种，使每锥形瓶中细胞接种密度均为1.0×106cells/ml；
（3）培养：实验组和对照组在同一光照培养箱中培养，光暗周期8:16，温度23℃，光强50μmol·m-2·s-1；实验组和对照组均采取充气培养；
（4）结果比较：培养10天后，实验组葛仙米群体密度达1.9×106 cells/ml，对照组葛仙米群体密度达1.5×106 cells/ml；实验组相对于对照组，葛仙米产量提高了26.67%。
应用实施例4：本发明储存1个月的改良培养基培养翡翠绿葛仙米：
（1）准备：6个5L已高压灭菌透明玻璃锥形瓶，实验组3个5L透明玻璃锥形瓶内含本发明改良培养基，对照组3个5L透明玻璃锥形瓶内含传统BG11培养基，本发明改良培养基的A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液、D溶液母液、E溶液母液和F溶液母液分别于4℃、避光条件下储存1个月，然后配制成改良培养基；传统BG11培养也于4℃、避光条件下储存1个月之后使用；两种培养基pH均用pH计调为7.1，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min，并且每瓶内均含3L培养基；
（2）接种：第1天在实验组、对照组接种翡翠绿葛仙米指数生长期藻殖段藻种，使每锥形瓶中细胞接种密度均为1.0×106cells/ml；
（3）培养：实验组和对照组在同一光照培养箱中培养，光暗周期8:16，温度23℃，光强50μmol·m-2·s-1；实验组和对照组均采取充气培养；
（4）结果比较：培养10天后，实验组葛仙米群体密度达1.7×106 cells/ml，对照组葛仙米群体密度达1.3×106 cells/ml；实验组相对于对照组，葛仙米产量提高了30.77%。
由上述结果可知，本发明的改良培养基，现配培养基与传统现配培养基相比，细胞浓度可提高25.00-26.67%；而本发明培养基储存一个月后用于细胞培养，与传统培养基相比，细胞浓度可提高28.57-30.77%；本发明的改良培养基，无论是现配培养基还是储存一个月的培养基，均有利于葛仙米生长。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种适用于葛仙米营养生长的改良培养基的配制方法，其特征在于，包括以下步骤：先分别配制A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液、D溶液母液、E溶液母液和F溶液母液，A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液、D溶液母液、E溶液母液和F溶液母液分别保存；使用时，依次将A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液、D溶液母液、E溶液母液和F溶液母液溶于溶剂中，调节pH后，调节pH后，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min，待培养基温度降到室温后，即可接种葛仙米的藻种；其特征在于，所述的配制方法具体包括以下步骤：
（1）配制A溶液母液：称取25.0g硝酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.800g磷酸氢二钾溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取1.50g七水合硫酸镁溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硝酸钠溶液、磷酸氢二钾溶液和七水合硫酸镁溶液混合均匀，用溶剂定容至1 L配成A液母液，使硝酸钾浓度为25.0g/L，磷酸氢二钾浓度为0.800g/L，七水合硫酸镁浓度为1.50g/L；
（2）配制B溶液母液：称取3.00g柠檬酸溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取3.00g柠檬酸铁铵溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.500g乙二胺四乙酸二钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的柠檬酸溶液、柠檬酸铁铵溶液和乙二胺四乙酸二钠溶液混合均匀，用溶剂定容至1 L配成B液母液，使柠檬酸浓度为3.00g/L，柠檬酸铁铵浓度为3.00g/L和乙二胺四乙酸二钠浓度为0.500g/L；
（3）配制C溶液母液：称取13.6 g无水氯化钙溶于少量溶剂中使之完全溶解，用溶剂定容至1 L配成C液母液，使氯化钙浓度为 13.6 g/L；
（4）配制D溶液母液：称取20.0g碳酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解，用溶剂定容至1L配成D液母液，使碳酸钠浓度为20.0g/L；
（5）配制E溶液母液：称取2.86g硼酸溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取1.81g四水合氯化锰溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.220g七水合硫酸锌溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.390g钼酸钠溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.0800mg五水合硫酸铜溶于少量溶剂中使之完全溶解；称取0.0400mg六水合氯化钴溶于少量溶剂中使之完全溶解；将溶解的硼酸溶液、四水合氯化锰溶液、七水合硫酸锌溶液、钼酸钠溶液、五水合硫酸铜溶液和六水合氯化钴溶液混合在一起，用溶剂定容至1 L配成E溶液母液，使硼酸浓度为2.86g/L，四水合氯化锰浓度为1.81g/L，七水合硫酸锌浓度为0.220g/L，钼酸钠浓度为0.390g，五水合硫酸铜浓度为0.0800g/L和六水合氯化钴浓度为0.0400g/L；
（6）配制F溶液母液：称取1000g土壤加溶剂1000mL搅拌，用滤纸滤过得到土壤浸出液，再用溶剂定容至1L；
（7）使用时，取40.0 mL A溶液母液、1.50mL B溶液母液、1.50mL C溶液母液、0.800mL D溶液母液，0.800mL E溶液母液和500mL F溶液母液，最后用溶剂定容至1 L；使A液使硝酸钾浓度为25.0g/L，磷酸氢二钾浓度为0.800g/L，七水合硫酸镁浓度为1.50g/L，B液柠檬酸浓度为3.00g/L，柠檬酸铁铵浓度为3.00g/L和乙二胺四乙酸二钠浓度为0.500g/L，C液氯化钙浓度为 13.6 g/L，D液碳酸钠浓度为20.0g/L，E液硼酸浓度为2.86g/L，四水合氯化锰浓度为1.81g/L，七水合硫酸锌浓度为0.220g/L，钼酸钠浓度为0.390g，五水合硫酸铜浓度为0.0800g/L和六水合氯化钴浓度为0.0400g/L；用NaOH或HCl调节pH值到7.1，在121℃，0.1Mpa条件下灭菌20min，待培养基温度降到室温后，然后用于接种所需培养的葛仙米藻种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液、D溶液母液、E溶液母液和F溶液母液分别于4℃、避光条件下保存。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的溶剂为普通蒸馏水。
4.一种按照权利要求1-3任一项所述的配制方法配制而成的改良培养基。
5.一种权利要求4所述的改良培养基的应用，其特征在于，所述的改良培养基用于葛仙米营养生长阶段。
6.一种权利要求4所述的改良培养基的应用，其特征在于，所述的改良培养基用于普通葛仙米或翡翠绿葛仙米的规模化培养。
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| CN115011511A (zh) * | 2022-05-24 | 2022-09-06 | 中国海洋大学 | 一种适用于葛仙米生长的混合营养培养方法 |
Citations (5)
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| CN1294190A (zh) * | 1999-10-22 | 2001-05-09 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种培养葛仙米的方法 |
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-
2020
- 2020-12-31 CN CN202011628566.0A patent/CN112662583A/zh active Pending
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