CN103238522B - 东北红豆杉开放式简化培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种东北红豆杉开放式简化培养基，该培养基包括初代培养基和继代培养基；所述初代培养基通过在优化的B₅基础母液中加入卡拉胶、白砂糖、吲哚丁酸IBA、活性炭AC和农用链霉素混合制成；继代培养基通过在优化的MS基础母液中加入卡拉胶、白砂糖、吲哚丁酸IBA、6-卞氨基腺嘌呤BA、活性炭AC和农用链霉素混合制成。本发明采用开放式简化组培，用抑菌剂代替高压灭菌和严格封闭环境操作，明显节省了培养基成本和接种时间，省略了高压灭菌程序，简化了生产流程，可以使在工厂化育苗中减少人力和设备投资，节约资金30-50%。

Description

东北红豆杉开放式简化培养基

技术领域

本发明属于植物组织培养工厂化育苗培养基技术领域，涉及一种东北红豆杉开放式简化植物组织培养基。

背景技术

目前，虽然已经有上千种植物的组织培养取得了成功，但能真正用于商品化生产的植物种类不多。常规的封闭式组培有许多局限，如：配制培养基所用化学药品种类繁多，用量多，要求精细，价格昂贵，组织培养过程中对设备要求严格，并且要求严格的灭菌条件，导致耗电量较大，生根方法烦琐，且有的组培苗生根很难，移栽适应能力差，成活率低等问题使组培成本大大提高，甚至导致试管苗比普通苗价格高几倍甚至几十倍的成本，广大种植者无力购买，试管苗销售量下降，严重限制了该技术的扩大和推广，致使许多品种没有得到开发利用。针对以上问题，我们开展了开放式植物简化组织培养技术研究，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、初培芽诱导及萌动效果好，继代苗增殖率高，芽的平均伸长量大的东北红豆杉开放式简化培养基。

为了解决上述技术问题，本发明的东北红豆杉开放式简化培养基包括初代培养基和继代培养基；

所述初代培养基通过在优化的B₅基础母液中加入卡拉胶、白砂糖、吲哚丁酸IBA、活性炭AC和农用链霉素混合制成；混合液中卡拉胶浓度为6～10g/L，白砂糖浓度为20～30g/L，吲哚丁酸IBA浓度为2.5～5.0mg/L，活性炭AC浓度为0.5～2.5g/L，农用链霉素浓度为0.10～0.50g/L；

所述优化的B₅基础母液中，无机盐组成如下：

KNO3：1500-3000mg/L；MgSO4·7H2O：250-500mg/L；CaCl2·2H2O：100-150mg/L；(NH4)2SO4：70-134mg/L；NaH2PO4·H2O：75-150mg/L；其余成分及使用浓度与标准B₅培养基相同；

所述继代培养基通过在优化的MS基础母液中加入卡拉胶、白砂糖、吲哚丁酸IBA、6-卞氨基腺嘌呤BA、活性炭AC和农用链霉素混合制成；混合液中卡拉胶浓度为8～10g/L，白砂糖浓度为20～30g/L，吲哚丁酸IBA浓度为1.0～3.0mg/L，6-卞氨基腺嘌呤BA浓度为0.03～1.00mg/L，活性炭AC浓度为0.5～2.5g/L，农用链霉素浓度为0.10～0.50g/L；

所述优化的MS基础母液中，无机盐组成如下：

硝酸钾KNO3：950-1900mg/L；硝酸铵NH4NO3：825-1650mg/L；磷酸二氢钾KH2PO4：85-170mg/L；硫酸镁MgSO4·7H2O：185-370mg/L；氯化钙CaCl2·2H2O：220-440mg/L，其余成分及使用浓度与标准MS培养基相同。

所述优化的B₅基础母液中，无机盐组成优选如下：

KNO3：1500-1550mg/L；MgSO4·7H2O：250-270mg/L；CaCl2·2H2O：100-110mg/L；(NH4)2SO4：70-80mg/L；NaH2PO4·H2O：75-85mg/L；其余成分及使用浓度与标准B₅培养基相同。

所述优化的MS基础母液中，无机盐组成优选如下：

硝酸钾KNO3：950-1000mg/L；硝酸铵NH4NO3：825-850mg/L；磷酸二氢钾KH2PO4：85-90mg/L；硫酸镁MgSO4·7H2O：185-190mg/L；氯化钙CaCl2·2H2O：220-230mg/L，其余成分及使用浓度与标准MS培养基相同。

本发明的东北红豆杉组织培养方法包括下述步骤：

初代培养：取当年生半木质化2-6cm的茎尖作为外植体，接种于塑料杯的初代培养基中，用透气膜封口；接种后，将接种杯置于人工气候箱中，温度25±1℃、湿度80～85%、光照强度1700—2000lux，光暗交替12h/12h，培养15天后获得初培苗；

继代培养：取初培苗接种于塑料杯的继代培养基中，用透气膜封口；接种后，将接种杯置于人工气候箱中，温度25±1℃、湿度80～85%、光照强度1700—2000lux，光暗交替12h/12h，培养35-40天。

有益效果：

初代培养基中添加0.1%活性炭可以使初代培养芽的萌动时间从13d降为6d，大大降低了初代培养的时间，抑制了褐化现象，可以使初代培养周期缩短一周，提高了成活率，降低了生产成本。

初代培养基和继代培养基当中添加了抑菌剂农用链霉素，对真菌和细菌均有良好的抑制作用，真菌和细菌污染率均能保持在5%以下，配制好的培养基不需要高压灭菌，简化了生产程序，降低了生产成本。

初代培养和继代培养均采用塑料杯代替三角瓶，透气膜和塑料杯可再利用，降低了成本；新开封的塑料杯不需要消毒灭菌处理，可以直接利用，简化了操作程序；塑料杯无副作用，更有利于苗的生长；初代培养，虽然愈伤组织诱导率差异不显著，但芽萌动率显著提高；继代培养，增殖率及芽平均伸长高度均显著高于三角瓶；由于塑料杯内湿度较低，温度与外界环境温度基本处于平衡，不利于杂菌的滋生，因而塑料杯培养基不易发生污染，利于开放式简化组培的进行。

除各种营养元素母液采用蒸馏水配置以外，其余均可采用自来水代替蒸馏水，从而间接简化了培养程序及成本。

我们采用开放式简化组培优势：由于基础母液中大量元素减半，卡拉胶代替琼脂粉，白砂糖代替蔗糖，IBA取替NAA和BA,塑料杯代替玻璃瓶，自来水代替蒸馏水，抑菌剂代替高压灭菌和严格封闭环境操作。所以，接种速度为封闭式组培的3-5倍，明显节省了培养基成本和接种时间，省略了高压灭菌程序，简化了生产流程，可以使在工厂化育苗中减少人力和设备投资。节约资金30-50%。

初代培养基采用白砂糖作为作为碳源，在对初培芽愈伤组织诱导及芽萌动不产生影响的基础上，降低了成本；继代培养基采用白砂糖代替蔗糖作为碳源，在增殖率及芽平均伸长高度不受影响的前提下降低了成本。

当优化的B₅基础母液无机盐的含量为B₅培养基中无机盐含量的一半左右，优化的MS基础母液无机盐的含量为MS培养基中无机盐含量的一半时，在对初培芽愈伤组织诱导、芽萌动、增殖率及芽平均伸长高度不产生影响的基础上，显著降低了成本。

具体实施方式

实施例1

根据表1、表2配制初代培养基：

a、根据表1中无机盐的使用浓度和标准B₅培养基中其他成分的使用浓度配制优化的B₅基础母液，分装于1号、2号、......、7号烧杯中。

b、将吲哚丁酸IBA和农用链霉素加入各烧杯中与优化的B₅基础母液混合至所需浓度。

c、取一定量自来水（代替蒸馏水）煮沸，用电子天平秤取卡拉胶及糖，将卡拉胶倒入沸水中煮化，定容至1L，接着倒入白砂糖，溶化后，取卡拉胶液分装在1号、2号、......、7号烧杯中。分装后，搅拌均匀。

d.用分析天平称量活性炭加入1号、2号、......、7号烧杯，当液体温度降低至60℃以下时在各烧杯中加入农用链霉素，用玻璃棒搅拌均匀，得到初代培养基；然后将各烧杯置于无菌超净台下。

e.在超净台下将1号、2号、......、7号烧杯中配好初代培养基分别装入1号、2号、......、7号塑料杯中（新开封的不需要消毒），每杯50mL，晾凉，凝固后用透气膜封口，备用。

根据表3、表4配制继代培养基：

a、根据表4中无机盐的使用浓度和标准MS培养基中其他成分的使用浓度配制优化的MS基础母液，分装于6号、7号、......、12号烧杯中。

b、将吲哚丁酸IBA，6-卞氨基腺嘌呤BA，农用链霉素加入各烧杯中与优化的MS基础母液混合至所需浓度。

c、其余成分按照与初代培养基相同的方法加入各烧杯中与优化的MS基础母液混合均匀，最后在超净台下分别装入6号、7号、......、12号塑料杯中，每杯50mL，晾凉，凝固后用透气膜封口，备用。

实施例2

外植体的制备：

试验前一天取当年生半木质化2-3cm的茎尖，用流水冲洗12-24小时；

在超净台下操作，用70%酒精将桌面及手擦拭干净，点燃酒精灯。

将清洗好的半木质化茎尖在无菌超净台下进行消毒，用75%的酒精消毒30～60s，接着用0.1%升汞（HgCl₂）消毒7～8min，消毒后用无菌水(高压灭菌的自来水)冲洗4～5次，再用无菌滤纸（高压灭菌的滤纸）吸干表面水渍。

将手术刀、镊子在酒精灯外沿灼烧，蘸95%的酒精，反复3遍（大概持续3min），晾凉后，用手术刀将消过毒的半木质化茎尖于灭过菌的培养皿上将其基部1cm处叶片切掉，同时切除因消毒而被腐蚀的切口处，外植体制备完毕。

实施例3

外植体接种及培养

初代培养：

在无菌超净台下酒精灯旁进行接种，用已杀过菌的镊子将制备好的外植体接种于各塑料杯的初代培养基中，每杯3～4个外植体，每接种一瓶用已消过毒的透气膜封口。

接种后，将接种杯置于人工气候箱中，各接种杯所处环境参数如下：

培养条件：温度26℃、湿度85%、光照强度2000lux，光暗交替12h/12h。

初代培养15天后，对各塑料杯中的芽萌动及愈伤组织诱导状况进行统计（实验数据见表2。

继代培养：

在无菌超净台下酒精灯旁进行接种，用已杀过菌的镊子将初代培养获得的生长状况相近的小苗作为材料接种于各塑料杯的继代培养基中，每接种一瓶用已消过毒的透气膜封口。

接种后，将接种杯置于人工气候箱中，各接种杯环境参数与初代培养相同。

继代培养35天后，对各塑料杯中的增值率及芽平均生长高度状况进行统计（实验数据见表4）。

表1初代培养无机盐简化方案B5

表2初代培养基其他成分使用浓度及实验结果数据

卡拉胶代替琼脂粉，白砂糖代替蔗糖，IBA代替NAA(2,2.5,3g/L)

表2中y_i ^*表示第i号初代培养基的综合评分，y_i ^*=2(y_i)₁+4(y_i)₂。

表3继代培养无机盐简化方案MS

表4继代培养其他成分使用浓度及实验结果数据

卡拉胶代替琼脂粉，白砂糖代替蔗糖,NAA(1,1.5,2g/L)，加BA(0.045,0.05,0.055)。

由表2可以看出，在同样的初代培养条件下，采用本发明初代培养基的初愈时间、愈伤组织诱导率、芽萌动时间和芽萌动率效果都比较好，特别是在无机盐使用浓度减少一半左右（1号、2号、6号、7号初代培养基）时，综合评分不仅没有降低，而且还有所提高。由表4可以看出，采用本发明继代培养基的增值率、芽平均伸长高度效果都比较好，特别是在无机盐使用浓度减少一半左右（6号、7号、11号、12号继代培养基）时，增值率、芽平均伸长高度不仅没有降低，还有所提高。

Claims (5)

1.一种东北红豆杉开放式简化培养基，包括初代培养基和继代培养基；

所述初代培养基通过在优化的B₅基础母液中加入卡拉胶、白砂糖、吲哚丁酸IBA、活性炭AC和农用链霉素混合制成；混合液中卡拉胶浓度为6~10g/L，白砂糖浓度为20 ~30g/L，吲哚丁酸IBA浓度为2.5~5.0mg/L，活性炭AC浓度为0.5~2.5g/L，农用链霉素浓度为0.10~0.50g/L；

所述优化的B₅基础母液中，无机盐组成如下：

KNO₃：1500-3000mg/L；MgSO₄·7H₂O：250 -500mg/L；CaCl₂·2H₂O：100-150mg/L；(NH₄)₂SO₄：70-134mg/L ；NaH₂PO₄·H₂O：75-150mg/L；其余成分及使用浓度与标准B₅培养基相同；

所述继代培养基通过在优化的MS基础母液中加入卡拉胶、白砂糖、吲哚丁酸IBA、6-卞氨基腺嘌呤BA、活性炭AC和农用链霉素混合制成；混合液中卡拉胶浓度为8~10g/L，白砂糖浓度为20~30g/L，吲哚丁酸IBA浓度为1.0~3.0mg/L，6-卞氨基腺嘌呤BA浓度为0.03~1.00mg/L，活性炭AC浓度为0.5~2.5g/L，农用链霉素浓度为0.10~0.50g/L；

所述优化的MS基础母液中，无机盐组成如下：

硝酸钾KNO₃：950-1900mg/L；硝酸铵NH₄NO₃：825-1650 mg/L；磷酸二氢钾KH₂PO₄：85-170 mg/L；硫酸镁MgSO₄·7H₂O：185-370mg/L ；氯化钙CaCl₂·2H₂O：220-440 mg/L，其余成分及使用浓度与标准MS培养基相同；初代培养的外植体是当年生半木质化2-3cm的茎尖；继代培养对象是初代培养获得的生长状况相近的小苗。

2.根据权利要求1所述的东北红豆杉开放式简化培养基，其特征在于所述优化的B₅基础母液中，无机盐组成如下：

KNO₃：1500-1550mg/L；MgSO₄·7H₂O：250 -270mg/L；CaCl₂·2H₂O：100-110mg/L；(NH₄)₂SO₄：70-80mg/L ；NaH₂PO₄·H₂O：75-85mg/L；其余成分及使用浓度与标准B₅培养基相同。

3.根据权利要求2所述的东北红豆杉开放式简化培养基，其特征在于所述优化的B₅基础母液中，无机盐组成如下：

KNO₃：1500mg/L；MgSO₄·7H₂O：250mg/L；CaCl₂·2H₂O：100mg/L；(NH₄)₂SO₄：70mg/L ；NaH₂PO₄·H₂O：75mg/L；其余成分及使用浓度与标准B₅培养基相同。

4.根据权利要求1所述的东北红豆杉开放式简化培养基，其特征在于所述优化的MS基础母液中，无机盐组成如下：

硝酸钾KNO₃：950-1000mg/L；硝酸铵NH₄NO₃：825-850 mg/L；磷酸二氢钾KH₂PO₄：85-90mg/L；硫酸镁MgSO₄·7H₂O：185-190mg/L ；氯化钙CaCl₂·2H₂O：220-230 mg/L，其余成分及使用浓度与标准MS培养基相同。

5. 根据权利要求4所述的东北红豆杉开放式简化培养基，其特征在于所述优化的MS基础母液中，无机盐组成如下：

硝酸钾KNO₃：950mg/L；硝酸铵NH₄NO₃：825 mg/L；磷酸二氢钾KH₂PO₄：85mg/L；硫酸镁MgSO₄·7H₂O：185mg/L ；氯化钙CaCl₂·2H₂O：220mg/L，其余成分及使用浓度与标准MS培养基相同。