CN112400696B - 一种长青常夏石竹的组织培养方法 - Google Patents
一种长青常夏石竹的组织培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种长青常夏石竹的组织培养方法，包括以下步骤：步骤1：选取常夏石竹带有生长点的芽作为外植体；对外植体进行灭菌处理后备用；步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，进行初代诱导培养分化出丛生芽；步骤3：将初代诱导培养的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；步骤4：将上述诱导生根后的常夏石竹生根苗进行炼苗和移栽。本发明提供了常夏石竹组织培养各个时期所需培养基的营养成分和配比，优化了培养条件，可为工业化生产提供大量粗壮幼苗，为常夏石竹组织培养的深入研究提供了理论依据，也为常夏石竹的大面积推广奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种长青常夏石竹的组织培养方法。
背景技术
常夏石竹( Dianthus plumarius L． ) 别称羽裂石竹、地被石竹，为石竹科石竹属多年生草本植物。全世界已发现 300 多 种石竹科品种，其中常夏石竹最矮小、最抗寒、最耐干旱、花量最大、寿命最长。常夏石竹花期长，花色艳，叶形优美，气味芳香，三季开花，四季常青，加之具有耐旱、耐寒、微抗碱等优点，因此近几年在我国北方地区被广泛引种栽培。常夏石竹的成功栽培在一定程度上解决了北方缺水和寒冷给草坪绿化带来的难题，拓展了我国北方草坪业发展的深度与广度，同时弥补了草坪无花和我国北方草坪冬季枯黄的缺陷。
常夏石竹传统的繁殖方式主要是分株和分蘖，速度慢、繁殖量小，不能大规模繁殖，无法满足市场需求。组织培养技术可在短期内获得大量种苗，缩短了育种周期，是常夏石竹满足市场需求的有效途径，且组织培养的石竹还具有苗壮、病虫害少、花枝挺拔、色泽纯正的特点。但现有组培技术步骤繁琐，培养成本高昂，周期长，诱导率、成活率、分化率低，本发明提供一种长青常夏石竹的组织培养方法，对常夏石竹的快速繁殖与大面积推广有重要的指导意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种长青常夏石竹的组织培养方法，简化组织培养步骤，降低培养成本，诱导产生的丛生芽颜色黄绿，生长快，数量多，诱导率高达94%以上，分化率高达100%，生根率高达96%以上，成活率高达94%以上；幼苗培育成本降低20%以上。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种长青常夏石竹的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤1：选取常夏石竹带有生长点的芽作为外植体；对外植体进行灭菌处理后备用；
步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，进行初代诱导培养分化出丛生芽；
所述初代诱导培养基为：
改良MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.1-0.4mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.15-0.3mg/L，其余成分不变；
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是13-23天；
步骤3：将初代诱导培养的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；
所述继代培养基为：
改良MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.1-0.4mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.15-0.3mg/L，其余成分不变；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是9-17天；
所述生根培养基为：
1/2MS+0.3-0.6mg/L B9+ IAA0.05-0.15mg/L；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是10-18天；
步骤4：将上述诱导生根后的常夏石竹生根苗进行炼苗和移栽。
而且，所述初代诱导培养基为：
改良MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.2mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述继代培养基为：
改良MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.2mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述生根培养基为：
1/2MS+ 0.5mg/L B9+ IAA 0.1mg/L。
而且，所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是18天；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是13天；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是15天。
而且，所述步骤1中常夏石竹外植体的灭菌处理过程为：采集常夏石竹带有长约0.1-0.4cm生长点的芽，在超净台上放入无菌容器中，用50ppm青霉素和100mL无菌水的混合溶液浸泡10min，再用无菌水冲洗4-5次，再用0.5%HgCl2溶液浸泡5min，期间可轻轻搅拌，随后用无菌水冲洗5次，每次5min，最后无菌滤纸上吸干水分。
而且，所述步骤2和步骤3的接种过程中，将常夏石竹生长点的1/2插入培养基。
而且，所述步骤4还包括常夏石竹生根后的炼苗阶段，具体方法为：
将常夏石竹组织培养瓶盖子打开后，放置于准备好的温室苗床上，放置1-5天。
而且，所述步骤4还包括常夏石竹生根后的移栽阶段，具体方法为：
从培养瓶中取出常夏石竹组培苗，用清水将组培苗根部粘附的培养基冲洗干净，然后移栽至温室苗床培养基质上。
而且，所述苗床培养基质为草炭50%，熟羊粪20%，沙质土30%。
而且，所述炼苗时间为2天。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明操作简便，成本低廉，培养效率高，为大规模推广应用奠定了理论和实践基础。本发明经过反复试验将初代培养基与继代培养基调试为一个配方，使操作过程简便易行，不用频繁配置不同配方培养基，从而降低了20%以上的生产成本；
2、本发明系统的研究了常夏石竹外植体的选择和灭菌、不同阶段培养基的成分配比以及不同阶段的培养条件，提高了丛生芽和幼苗生长速度和数量，具有良好的工厂化应用前景。
3、本发明简化了现有培育繁琐的步骤，缩短了培养周期，诱导率高达94%以上，分化率高达100%，生根率高达96%以上，成活率高达94%以上，为常夏石竹组织培养的深入研究提供了理论依据，也为常夏石竹的大面积推广奠定了基础。
4、本发明提供了一种长青常夏石竹的组织培养方法，可以获得无毒的外植体,再用无毒外植体进行愈伤组织的诱导和愈伤组织的再分化培养,可获得大量无菌苗，可避免直接采用外植体速繁成苗而带来的消毒不彻底导致外植体中带有植物病毒的情况；
5、本发明直接利用外植体在初代诱导培养基上诱导分化产生丛生芽，这一培养过程大大降低了培养时间，为建立常夏石竹快速扩增体系提供了有力支持；
6、本发明提供了一种长青常夏石竹的组织培养方法，选用带有生长点的芽作为外植体，提高了诱导产生丛生芽的数量和效率，经过优化的最佳培养基成分和培养条件满足了常夏石竹各个时期的营养需要和生长发育，为常夏石竹组织培养成功奠定了基础，而且本发明将初代培养基与继代培养基调试为一个配方，为流程化生产提供了可能。利用本发明技术培养的常夏石竹幼苗粗壮，抗病虫害的能力强，为大规模应用于草坪绿化提供了基础；
7、本发明技术中采用改良的MS配方中，去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.15-0.3mg/L，其余成分不变；有效降低成本，同时增加了常夏石竹所需的营养成分，为常夏石竹快速繁殖提供了强有力的支持。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的内容、特点及功效，例举以下实施例。需要说明的是，本实施例是描述性的，不是限定性的，不能由此限定本发明的保护范围。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.15-0.3mg/L，其余成分不变；上述含量是指浓度（mg/L）含量。
本发明中：MS为MS培养基；6-BA为6-氨苄基嘌呤；NAA为1-萘乙酸；KT为激动素；AC为活性炭； B9 为维生素B9；IAA为吲哚乙酸；VB1为维生素B1；
诱导率、分化率、成活率、生根率的计算公式如下：
诱导率=（愈伤组织的数量/接种外植体的数量）×100%；
分化率=（分化为丛生芽的愈伤组织数 / 愈伤组织总数)×100%；
成活率=（成活株数/移栽株数）×100%；
生根率=（生根的丛生芽数/接种的丛生芽数）×100%。
实施例1
用本发明提供的一种长青常夏石竹的组织培养方法培养长青常夏石竹。
长青常夏石竹，适宜在内蒙古及我国北方年均降水量150mm以上的地区种植，由内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司提供。
一种长青常夏石竹的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤1：选取常夏石竹带有生长点的芽作为外植体；对外植体进行灭菌处理后备用；
步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，进行初代诱导培养分化出丛生芽；
所述初代诱导培养基为：
改良MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.2mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：减去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是18天；
步骤3：将初代诱导培养的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；
所述继代培养基为：
改良MS+6-BA2mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.2mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是13天；
所述生根培养基为：
1/2MS+ B90.5mg/L+ IAA0.1mg/L；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是15天；
步骤4：将上述诱导生根后的常夏石竹生根苗进行炼苗和移栽。
本实施中，所述步骤1中常夏石竹外植体的灭菌处理过程为：采集常夏石竹带有长约0.1-0.4cm生长点的芽，在超净台上放入无菌容器中，用50ppm青霉素和100mL无菌水的混合溶液浸泡10min，再用无菌水冲洗4-5次，再用0.5%HgCl2溶液浸泡5min，期间可轻轻搅拌，随后用无菌水冲洗5次，每次5min，最后无菌滤纸上吸干水分。
本实施中，所述步骤2和步骤3的接种过程中，将常夏石竹生长点的1/2插入培养基。
本实施中，所述步骤4还包括常夏石竹生根后的炼苗阶段，具体方法为：
将常夏石竹组织培养瓶盖子打开后，放置于准备好的温室苗床上，放置2天。
本实施中，所述步骤4还包括常夏石竹生根后的移栽阶段，具体方法为：
从培养瓶中取出常夏石竹组培苗，用清水将组培苗根部粘附的培养基冲洗干净，然后移栽至温室苗床培养基质上。
本实施中，所述苗床培养基质为草炭50%，熟羊粪20%，沙质土30%。
实施例2
一种长青常夏石竹的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤1：选取常夏石竹带有生长点的芽作为外植体；对外植体进行灭菌处理后备用；
步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，进行初代诱导培养分化出丛生芽；
所述初代诱导培养基为：
改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.1mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是13天；
步骤3：将初代诱导培养的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；
所述继代培养基为：
改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.1mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是9天；
所述生根培养基为：
1/2MS+ B90.3mg/L+ IAA0.05mg/L；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是10天；
其余步骤均与实施例1相同。
实施例3
一种长青常夏石竹的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤1：选取常夏石竹带有生长点的芽作为外植体；对外植体进行灭菌处理后备用；
步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，进行初代诱导培养分化出丛生芽；
所述初代诱导培养基为：
改良MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.4mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是25天；
步骤3：将初代诱导培养的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；
所述继代培养基为：
改良MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.4mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是17天；
所述生根培养基为：
1/2MS+ B90.3mg/L+ IAA0.15mg/L；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是18天；
其余步骤均与实施例1相同。
实施例4
一种长青常夏石竹的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤1：选取常夏石竹带有生长点的芽作为外植体；对外植体进行灭菌处理后备用；
步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，进行初代诱导培养分化出丛生芽；
所述初代诱导培养基为：
改良MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.1mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是14天；
步骤3：将初代诱导培养的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；
所述继代培养基为：
改良MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.1mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是12天；
所述生根培养基为：
1/2MS+ B90.6mg/L+ IAA0.05mg/L；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是14天；
其余步骤均与实施例1相同。
实施例5
一种长青常夏石竹的组织培养方法，包括以下步骤：
步骤1：选取常夏石竹带有生长点的芽作为外植体；对外植体进行灭菌处理后备用；
步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，进行初代诱导培养分化出丛生芽；
所述初代诱导培养基为：
改良MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.4mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是21天；
步骤3：将初代诱导培养的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；
所述继代培养基为：
改良MS+6-BA3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.4mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是16天；
所述生根培养基为：
1/2MS+ B90.6mg/L+ IAA0.15mg/L；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是16天；
其余步骤均与实施例1相同。
对比例1
对比例1主要对初代诱导培养基的条件进行改变，具体参数下所示：
对比1号：
所述初代诱导培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA 1.0mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比2号：
所述初代诱导培养基为：MS+6-BA 3.5mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+AC 1.5mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比3号：
所述初代诱导培养基为：MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 0.05mg/L+AC 1.5mg/L，其余步骤与实施例1相同。
从表1结果可以看出，本发明所采用的初代诱导培养基在培养8天后，愈伤组织的诱导率高达94%以上，其中实施例1更是高达100%，而且愈伤组织较大，颜色黄绿，疏松；对比例所采用的初代诱导培养基在培养8天后，愈伤组织的诱导率最高为82%，且愈伤组织体积小，颜色浅绿，紧实；可见本发明的初代诱导培养基对愈伤组织诱导效率高，而且所需时间短，缩短了常夏石竹的培养时间。
本发明在初代诱导培养周期结束时，全部愈伤组织都分化成丛生芽，分化率高达100%，可见本发明初代诱导培养基营养成分及配比适合产生丛生芽，而且本发明直接利用初代诱导培养基诱导产生丛生芽，简化了诱导产生愈伤组织的过程，节约了培养时间，降低了培养成本，为大规模工业化应用奠定了基础。
对比例2
对比例2主要对继代培养基的条件进行改变，具体参数下所示：
对比4号：
所述继代培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA 1.0mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比5号：
所述继代培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 2.0mg/L+AC 1.5mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比6号：
所述继代培养基为：MS+6-BA1.5mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 0.2mg/L+AC 1.5mg/L，其余步骤与实施例1相同。
从表2结果可以看出，本发明提供的继代培养基所包含的营养成分和配比可以使得丛生芽在短时间内大量扩增为接种量的14倍以上，而对比例所采用的继代培养基最高可以使丛生芽扩增12.46倍。本发明提供的一种长青常夏石竹的组织培养方法为建立常夏石竹快速扩增体系提供了理论基础和实践依据。
对比例3
对比例3主要对生根培养基的条件进行改变，具体参数下所示：
对比7号：
所述生根培养基为：1/2MS+ B9 0.2mg/L+ IAA0.03mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比8号：
所述生根培养基为：1/2MS+ B90.8mg/L+IAA 0.3mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比9号：
所述生根培养基为：1/2MS+ B90.2mg/L+IAA 0.2mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比10号：
所述生根培养基为：1/2MS+ B90.8mg/L+IAA0.03mg/L，其余步骤与实施例1相同。
对比11号：
所述生根培养基为：1/2MS+ BA1.0mg/L+IBA0.2mg/L，其余步骤与实施例1相同。
从表3中可以看出，对比例7-10与本发明的生根培养基营养成分相同，但配比不同，实验结果显示对比例7-10的生根率最高为88%，最低为78%，平均单芽生根数在3-4，实施例1-5的生根率最低为96%，最高可达100%，平均单芽生根数在6-7，可见本发明在诱导常夏石竹丛生芽生根明显优于对比例7-11。
对比例11号是传统生根培养基，从表3数据可知，对比例11号生根率仅为72%，平均单芽生根数为2-3，本发明采用的生根培养基生根率高达96以上，平均单芽生根数在6-7，优于对比例11号。本发明为常夏石竹大规模应用奠定了基础。
对比例4
对比例4主要对苗床培基质的条件进行改变，具体参数下所示：
对比12号：
所述苗床培养基质为：草炭50%，熟羊粪20%，沙质土30%，其余步骤与实施例1相同。
对比13号：
所述苗床培养基质为：60%锯末，20%炉渣，20%肥沃园土，其余步骤与实施例1相同。
从表4可以看出，对比12号移栽成活率为89%，对比13号移栽成活率为88%，本发明提供了苗床培养基质可实现移栽成活率高达94%，说明经过初代诱导培养，继代培养，生根培养，炼苗和移栽整个过程，本发明不仅诱导率、分化率高，而且可以大量提供粗壮幼苗用于移栽，进而提高了幼苗的成活率。
对比例5
对比14号：
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是10天；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是7天；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是8天；
其余步骤均与实施例1相同。
对比15号：
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是28天；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是23天；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是20天；
其余步骤均与实施例1相同。
对比16号：
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是12天；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是19天；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是22天；
其余步骤均与实施例1相同。
从表5中可以看出：对比14-16号与实施例各个时期培养基成分和配比完全相同，只是更改了培养条件，但诱导率、分化率、成活率数值出现明显下降，说明常夏石竹组织培养培养条件至关重要，本发明提供的培养条件可以提高培养的诱导率、分化率和成活率，有助于常夏石竹大规模培养。
从表1-表5 的实验数据综合分析可知：本发明为常夏石竹快速组织培养提供了各个时期最优培养基营养成分组成和配比、最佳培养条件，保障了常夏石竹组织培养的成功实施，而且利用本发明培养过程中，诱导率高达94%以上，分化率高达100%，生根率高达96%以上，成活率高达94%以上，幼苗培育成本降低20%以上，缩短了培养时间，为常夏石竹组织培养的深入研究提供了理论依据，也为常夏石竹的大面积推广奠定了基础。
Claims (9)
1.一种长青常夏石竹的组织培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：选取常夏石竹带有生长点的芽作为外植体；对外植体进行灭菌处理后备用；
步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，进行初代诱导培养分化出丛生芽；
所述初代诱导培养基为：
改良MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.1-0.4mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.15-0.3mg/L，其余成分不变；
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是13-23天；
步骤3：将初代诱导培养的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；
所述继代培养基为：
改良MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.1-0.4mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.15-0.3mg/L，其余成分不变；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是9-17天；
所述生根培养基为：
1/2MS+ 0.3-0.6mg/L 维生素B9+ IAA0.05-0.15mg/L；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是10-18天；
步骤4：将上述诱导生根后的常夏石竹生根苗进行炼苗和移栽。
2.根据权利要求1所述的一种长青常夏石竹的组织培养方法，其特征在于：
所述初代诱导培养基为：
改良MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.2mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述继代培养基为：
改良MS+6-BA 2mg/L+NAA 0.5mg/L+KT0.2mg/L+AC1.5mg/L；
改良MS配方为：去掉MS基础培养基中的微量元素碘化钾，将有机组分VB1增加至0.2mg/L，其余成分不变；
所述生根培养基为：
1/2MS+ 0.5mg/L 维生素B9+ IAA 0.1mg/L。
3.根据权利要求1所述的一种长青常夏石竹的组织培养方法，其特征在于：
所述初代诱导培养的条件为培养温度23±1℃，光照强度2000Lx，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是18天；
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2500-3500Lx，除白天自然光照外，夜间补光1.5小时/天，培养周期是13天；
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光，培养周期是15天。
4.根据权利要求1所述的一种长青常夏石竹的组织培养方法，其特征在于：
所述步骤1中常夏石竹外植体的灭菌处理过程为：采集常夏石竹带有长约0.1-0.4cm生长点的芽，在超净台上放入无菌容器中，用50ppm青霉素和100mL无菌水的混合溶液浸泡10min，再用无菌水冲洗4-5次，再用0.5%HgCl2溶液浸泡5min，期间可轻轻搅拌，随后用无菌水冲洗5次，每次5min，最后无菌滤纸上吸干水分。
5.根据权利要求1所述的一种长青常夏石竹的组织培养方法，其特征在于：
所述步骤2和步骤3的接种过程中，将常夏石竹生长点的1/2插入培养基。
6.根据权利要求1所述的一种长青常夏石竹的组织培养方法，其特征在于：
所述步骤4还包括常夏石竹生根后的炼苗阶段，具体方法为：
将常夏石竹组织培养瓶盖子打开后，放置于准备好的温室苗床上，放置1-5天。
7.根据权利要求1所述的一种长青常夏石竹的组织培养方法，其特征在于：
所述步骤4还包括常夏石竹生根后的移栽阶段，具体方法为：
从培养瓶中取出常夏石竹组培苗，用清水将组培苗根部粘附的培养基冲洗干净，然后移栽至温室苗床培养基质上。
8.根据权利要求7所述的一种长青常夏石竹的组织培养方法，其特征在于：
所述苗床培养基质为草炭50%，熟羊粪20%，沙质土30%。
9.根据权利要求6所述的一种长青常夏石竹的组织培养方法，其特征在于：
所述炼苗时间为2天。
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