CN108513910A - 一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法，包括以下步骤：1)将NaCl溶液浸泡处理过的黑果枸杞种子接种于MS培养基中进行培养获得无菌苗；2)剪取所述无菌苗的叶片接种于含NaCl的胚性愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养获得胚性愈伤组织颗粒；3)将所述胚性愈伤组织颗粒接种于NaCl胁迫不定芽诱导培养基中进行不定芽培养获得不定芽；4)对所述获得的不定芽进行NaCl胁迫培养获得预耐盐不定芽；5)对所述获得的预耐盐不定芽进行EMS诱变处理后筛选耐盐不定芽；6)将所述获得的耐盐不定芽进行生根培养获得黑果枸杞耐盐试管苗。所述方法有利于培养出耐盐性状更加稳定、不易发生变异的黑果枸杞耐盐突变体。

Description

一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法
技术领域
本发明属于黑果枸杞育种技术领域，具体涉及一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法。
背景技术
黑果枸杞(Lycium ruthencium)，属于茄科枸杞属，为多棘刺灌木，多分枝，枝条坚硬，常呈之字形弯曲，白色。黑果枸杞分布于中国青海、宁夏、新疆、甘肃等地及欧洲中亚，属于典型的荒漠植物，对环境条件适应能力极强，具有抗旱、耐寒、耐贫瘠、耐盐碱的特点。
黑果枸杞是重要的经济植物及药食兼用的佳品，其果实可入药，具有增强免疫力、延缓衰老、预防癌症、改善睡眠等功效。目前，由于全球气候变暖、人口增长、工业污染、化肥使用不当等因素，土壤盐渍化程度仍存在逐年加重的趋势，并成为阻碍植物生长发育及的重要因素之一，尤其是干旱荒漠区众多环境因子及其恶劣的情况下。据不完全统计，世界盐渍土的面积约1×109hm2，我国盐碱土总面积约有3×107hm2。近年农林业生产中广泛采用人工方法进行黑果枸杞的种苗繁殖，主要包括种子繁殖、扦插繁殖、组织培养、水培等等，但由于这些方法均不能完全模拟黑果枸杞野外生长的气候、水分、土壤等环境条件，使繁殖所得的苗木优良的遗传性状如耐盐性大大降低。
通过耐盐突变体的筛选能够使黑果枸杞获得优良的耐盐性状，能够在盐渍化土壤中生长和繁殖，常规育种途径能够选育耐盐黑果枸杞，但常规的非盐碱条件下的选育使品种耐盐性遗传变异非常有限，且易丢失，大多缺乏抗盐种质资源。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法，所述方法在无性繁殖的基础上，诱导黑果枸杞植株产生稳定、耐盐性状不易丢失的耐盐突变体，同时满足黑果枸杞种苗扩繁与抗逆性筛选的要求，为黑果枸杞种质资源保存提供了良好的技术支撑。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法，包括以下步骤：1)将NaCl溶液浸泡处理过的黑果枸杞种子接种于MS培养基中进行培养获得无菌苗；2)剪取所述无菌苗的叶片接种于含NaCl的胚性愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养获得胚性愈伤组织颗粒；3)将所述胚性愈伤组织颗粒接种于NaCl胁迫不定芽诱导培养基中进行不定芽培养获得不定芽；4)对所述获得的不定芽进行NaCl胁迫培养获得预耐盐不定芽；5)对所述获得的预耐盐不定芽进行EMS诱变处理后筛选耐盐不定芽；6)将所述获得的耐盐不定芽进行生根培养获得黑果枸杞耐盐试管苗。
优选的，步骤1)中所述的NaCl溶液浸泡处理中NaCl溶液的浓度为80～150mg/L。
优选的，步骤1)中所述的NaCl溶液浸泡处理包括两次高温浸泡-低温浸泡；所述高温浸泡的温度为38～42℃，所述高温浸泡的时间为1.5～2.5h；所述低温浸泡的温度为12～17℃，所述低温浸泡的时间为1.5～2.5h。
优选的，步骤1)中所述的培养获得无菌苗的过程包括3～5d暗培养和2～10d光照培养。
优选的，步骤2)中所述的胚性愈伤组织诱导培养基为包括0.5～1.5mg/L的6-BA，0.2～0.8mg/L的NAA，300～500mg/L的脯氨酸和30～35g/L的蔗糖的MS培养基；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.5～6.0。
优选的，所述愈伤组织培养依次包括黑暗震荡培养阶段和光照静置培养阶段；所述黑暗震荡培养阶段的温度为23～27℃；所述黑暗震荡培养的转速为15～25rpm；所述黑暗震荡培养的震荡时间为6～10h/d。
优选的，所述黑暗震荡培养的时间为6～8d；所述光照静置培养的时间为6～8d。
优选的，所述愈伤组织培养在静置培养阶段后还包括梯度耐盐培养；所述梯度耐盐培养为每12～14d向所述胚性愈伤组织诱导培养基添加中NaCl。
优选的，步骤3)中所述的NaCl胁迫不定芽诱导培养基为包括0.2～0.4mg/L的6-BA，1.0～2.0mg/L的2,4-D，4.5～5.5g/L的NaCl，28～32g/L的蔗糖和4.5～5.0g/L琼脂的MS培养基；所述NaCl胁迫不定芽诱导培养基的pH值为5.5～6.0。
优选的，步骤5)中所述的EMS诱变处理中EMS诱变液的浓度为3.5～4.5mg/L，所述EMS诱变处理的时间为8～10h；所述EMS诱变处理的转速为8～12rpm。
本发明的有益效果：本发明提供的黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法，改变了单纯用一种方法诱导耐盐植株的方法，采用NaCl与化学诱变剂EMS两种方法结合使用，更有利于获得突变体；在种子处理过程中采用NaCl浸泡，模拟自然条件下种子萌发环境，增加后期耐盐突变体筛选过程中幼苗的抗性；胚性愈伤组织诱导过程采用NaCl胁迫筛选，有利于培养出耐盐性状更加稳定、不易发生变异的愈伤组织体细胞。
进一步的，高温-低温浸泡交替的方式处理种子，能使种子充分吸胀吸水、打破休眠，使种子接种后快速萌发。
进一步的，愈伤组织诱导阶段采用液体培养基，配合震荡与暗培养的方法低温诱导愈伤组织，在愈伤组织培养过程中逐渐增加培养基中NaCl的浓度，使愈伤组织逐渐适应生长基质中盐分的浓度，耐盐性状更加稳定。
具体实施方式
本发明提供了一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法，包括以下步骤：1)将NaCl溶液浸泡处理过的黑果枸杞种子接种于MS培养基中进行培养获得无菌苗；2)剪取所述无菌苗的叶片接种于含NaCl的胚性愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养获得胚性愈伤组织颗粒；3)将所述胚性愈伤组织颗粒接种于NaCl胁迫不定芽诱导培养基中进行不定芽培养获得不定芽；4)对所述获得的不定芽进行NaCl胁迫培养获得预耐盐不定芽；5)对所述获得的预耐盐不定芽进行EMS诱变处理后筛选耐盐不定芽；6)将所述获得的耐盐不定芽进行生根培养获得黑果枸杞耐盐试管苗。
在本发明中，所述黑果枸杞种子优选的为当年采收的饱满、没有破损的黑果枸杞的种子。本发明中所述NaCl溶液浸泡处理黑果枸杞种子前，优选的用蒸馏水浸泡黑果枸杞种子，所述蒸馏水浸泡黑果枸杞种子的时间优选的为20～24h；所述蒸馏水浸泡黑果枸杞种子的作用是使种子充分吸水膨胀。
本发明中，所述NaCl溶液浸泡处理中NaCl溶液的浓度优选的为80～150mg/L，更优选的90～120mg/L，最优选的为100mg/L。在本发明中所述NaCl溶液浸泡处理优选的包括两次高温浸泡-低温浸泡；本发明中所述高温浸泡的温度优选的为38～42℃，更优选的为40℃；所述高温浸泡的时间优选的为1.5～2.5h，更优选的为2h；所述低温浸泡的温度优选的为12～17℃，更优选的为15℃；所述低温浸泡的时间优选的为1.5～2.5h，更优选的为2h。
本发明中，黑果枸杞种子在所述NaCl溶液浸泡处理后，优选的置于无菌环境中进行消毒处理；在本发明具体实施过程中，所述无菌环境优选的为超净台；所述消毒处理优选的采用体积分数为75％酒精浸泡；所述酒精浸泡的时间优选为35～45s，更优选为40s；本发明在所述酒精浸泡期间优选的用已灭菌的玻璃棒不断搅动。本发明在所述酒精浸泡后优选的采用无菌水冲洗6～9次，冲洗期间优选的用已灭菌的玻璃棒不断搅动。本发明在无菌水冲洗后优选的倒掉无菌水，沥干种子表面的水分；将所述黑果枸杞种子置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，吸干残留水渍后待用。
本发明中，将上述NaCl溶液浸泡处理过的黑果枸杞种子接种于无菌苗培养基中进行培养获得无菌苗。所述无菌苗培养基优选的包括1/2质量浓度的Hoagland营养液和5～7g/L的琼脂粉。本发明中所述培养获得无菌苗优选的在培养瓶中进行；每瓶培养基优选的接种4～6粒种子，接种前倒掉培养基经高温灭菌后冷却凝结的水分，以减小接种后的污染率。本发明中所述培养瓶的规格优选的为250ml的三角瓶，所述培养瓶中培养基的添加量优选的为45～55ml。
本发明中所述培养获得无菌苗的过程优选的包括3～5d暗培养和2～10d光照培养；优选的包括4d暗培养和8～9d光照培养。在本发明中所述暗培养的温度优选的为24～26℃；所述光照培养的温度优选的为24～26℃，更优选的为25℃；所述光照培养的光照强度优选的为1500～1800lx、所述光照培养的光照时间优选的为12h/d；所述光照培养优选的在培养室中进行。本发明中所述培养获得无菌苗的6～9d，黑果枸杞种子大量萌发，13～20d，所述无菌苗长至5～8cm，可用于胚性愈伤组织诱导。
本发明在获得无菌苗后，剪取所述无菌苗的叶片接种于含NaCl的胚性愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养获得胚性愈伤组织颗粒。在本发明中优选的将所述无菌苗的叶片边缘剪除，将叶片剩余部分剪切成0.2×0.2cm的方块；在本发明中所述接种优选的将所述剪切后的叶片正面朝上平铺于胚性愈伤组织诱导培养基中。
在本发明中所述胚性愈伤组织诱导培养基优选的为包括0.5～1.5mg/L的6-BA，0.2～0.8mg/L的NAA，300～500mg/L的脯氨酸和30～35g/L的蔗糖的MS培养基；更优选的为包括1.0mg/L的6-BA，0.4～0.6mg/L的NAA，350～450mg/L的脯氨酸和32～34g/L的蔗糖的MS培养基。在本发明中所述胚性愈伤组织诱导培养基的PH值优选的为5.5～6.0，更优选的为5.8。
在本发明中所述愈伤组织培养依次包括黑暗震荡培养阶段和光照静置培养阶段；所述黑暗震荡培养阶段的温度优选为14～16℃，更优选的为15℃；所述震荡培养的转速优选的为15～25rpm，更优选的为20rpm，所述黑暗震荡培养的震荡时间优选的为6～10h/d；更优选的为8h/d。本发明中所述黑暗震荡培养的时间优选的为6～8d；更优选的为7d。在本发明中，所述黑暗震荡培养结束后，进行所述光照静置培养；所述光照静置培养的时间优选为6～8d，更优选的为7d，所述光照静置培养的温度优选的为28～30℃，更优选的为29℃；所述光照静置培养的光照时间优选的为14h/d，光照强度优选为1400～1600lx，更优选为1500lx。
本发明中，所述愈伤组织培养在静置培养阶段后优选再进行梯度耐盐培养；本发明中所述梯度耐盐培养优选的为每12～16d向所述胚性愈伤组织诱导培养基添加中NaCl。在本发明具体实施过程中，按照时间进程，所述添加NaCl后的胚性愈伤组织诱导培养基中NaCl的浓度依次为0.8～1.2g/L、1.8～2.2g/L、4.5～5.5g/L。本发明中所述梯度耐盐培养阶段除NaCl的浓度与静置培养阶段不同以外，其他的培养条件均与所述愈伤组织培养阶段一致(包括黑暗震荡培养和光照静置培养)，在此不再赘述。本发明在所述愈伤组织培养的25～30d，叶片边缘明显膨大，48～50d，所述胚性愈伤组织诱导培养基变为淡绿色，其中悬浮大量大小不一的淡绿色胚性愈伤组织颗粒。
本发明在获得胚性愈伤组织颗粒，将所述胚性愈伤组织颗粒接种于NaCl胁迫不定芽诱导培养基中进行不定芽培养获得不定芽。在本发明具体实施过程中，优选的在超净工作台上用已灭菌滤纸过滤胚性愈伤组织颗粒，然后将滤纸连同胚性愈伤组织颗粒放入培养皿中，平铺接种到NaCl胁迫不定芽诱导培养基中进行不定芽培养。
在本发明中所述的NaCl胁迫不定芽诱导培养基优选的为包括0.2～0.4mg/L的6-BA，1.0～2.0mg/L的2,4-D，4.5～5.5g/L的NaCl，28～32g/L的蔗糖和4.5～5.0g/L琼脂的MS培养基；更优选的为包括0.25～0.35mg/L的6-BA，1.2～1.8mg/L的2,4-D，4.8～5.2g/L的NaCl，30g/L的蔗糖和4.6～4.8g/L琼脂的MS培养基。所述NaCl胁迫不定芽诱导培养基的pH值优选的为5.5～6.0，更优选的为5.8。
在本发明中，所述培养获得不定芽的温度优选的为23～27℃，更优选的为25℃；所述不定芽培养的光照强度优选为1500～2000lx，更优选为1800lx；所述不定芽培养的光照时间优选的为10～14h/d，更优选的为12h/d。本发明在所述胚性愈伤组织颗粒接种后9～11d部分胚性愈伤组织颗粒逐渐长大，部分颗粒逐渐变黄，20～30d已有大量不定芽长出。
本发明在获得不定芽后，对所述获得的不定芽进行NaCl胁迫培养获得预耐盐不定芽。本发明中所述NaCl胁迫培养获得预耐盐不定芽过程优选的依次包括预耐盐培养阶段和预耐盐筛选阶段。
在本发明中所述预耐盐筛选阶段优选的剪取生长健壮的不定芽，优选的转接至包括0.2～0.4mg/L的6-BA，1.0～2.0mg/L的2,4-D，4.5～5.5g/L的NaCl，28～32g/L的蔗糖和4.5～5.0g/L琼脂的MS培养基；更优选的为包括0.25～0.35mg/L的6-BA，1.2～1.8mg/L的2,4-D，4.8～5.2g/L的NaCl，30g/L的蔗糖和4.6～4.8g/L琼脂的MS培养基。本发明中所述的转接优选的为垂直转接。本发明中所述预耐盐筛选阶段中的温度优选为23～27℃，更优选为25℃；光照强度优选为1500～2000lx，更优选为1800lx；光照时间优选的为10～14h/d，更优选的为12h/d。
本发明在所述预耐盐培养阶段培养25～30d后进入预耐盐筛选阶段，在本发明中，优选的将所述预耐盐培养阶段培养获得的能够正常生长的不定芽转接入包括1.0～1.5mg/L的KT，0.3～0.6mg/L的NAA，28～32g/L的蔗糖和4.5～5.0g/L琼脂的MS培养基中进行筛选培养，所述筛选培养用培养基的pH值优选的为5.5～6.0，更优选的为5.8。本发明中所述预耐盐筛选阶段的培养条件与预耐盐培养阶段一致，在此不再赘述；本发明中所述预耐盐筛选阶段的时间优选的为25～30d，更优选的为28d。本发明选择所述的筛选培养后能够正常生长的不定芽即为预耐盐不定芽。
本发明在获得预耐盐不定芽后，对所述获得的预耐盐不定芽进行EMS诱变处理后筛选耐盐不定芽。在本发明中，优选的剪取平均高度为3～4cm得预耐盐不定芽，并将所述预耐盐不定芽剪成长1.5～2cm的茎段；对所述茎段进行EMS诱变处理，在本发明中所述的EMS诱变处理优选的为将所述预耐盐不定芽接种于无菌EMS诱变液中进行震荡培养，所述接种优选的为每50ml诱变液接种8～12个预耐盐不定芽；所述接种优选的在超净工作台中进行；所述无菌EMS诱变液的浓度优选的为3.5～4.5mg/L，更优选的为4mg/L。在本发明中所述震荡培养的时间优选的为8～10h，所述震荡的频率优选的为8～12rpm。
在本发明中所述EMS诱变处理后，优选的用无菌水冲洗所述诱变后的茎段，然后将清洗后的茎段转接筛选培养基中筛选耐盐不定芽。本发明中所述的筛选培养基为包括0.45～0.55mg/L的6-BA，0.1～0.3mg/L的IBA，4.5～5.5g/L的NaCl，28～32g/L的蔗糖和4.5～5.0g/L的琼脂的MS培养基；所述筛选培养基的pH值优选的为5.5～6，更优选的为5.8。本发明中所述筛选的培养温度优选为23～27℃，更优选为25℃；所述筛选培养的光照强度优选为1500～2000lx，更优选为1800lx；所述筛选培养的光照时间优选的为10～14h/d，更优选的为12h/d；所述筛选培养的时间优选的为6～8d，更优选的为7d；本发明在所述筛选培养后选择能够正常生长的不定芽为耐盐不定芽，进行后续的培养。
本发明优选的将所述耐盐不定芽在含有NaCl和不含NaCl的固体生根培养基中交替进行培养，重复1～3次，获得正常生长耐盐突变体不定芽。在本发明中所述含NaCl的固体生根培养基优选的为包括0.45～0.55mg/L的6-BA，0.1～0.3mg/L的IBA，2.8～3.2g/L的NaCl，28～32g/L的蔗糖和4.5～5.0g/L的琼脂的MS培养基；所述不含NaCl的固体生根培养基优选的为包括0.45～0.55mg/L的6-BA，0.1～0.3mg/L的IBA，28～32g/L的蔗糖和4.5～5.0g/L的琼脂的MS培养基。本发明中所述正常生长耐盐突变体不定芽的培养时间优选的为25～30d，更优选的为28d。
本发明在获得正常生长耐盐突变体不定芽后，将所述获得的正常生长耐盐突变体不定芽进行生根培养获得黑果枸杞耐盐试管苗。本发明中所述生根培养的培养基为包括0.1～0.3mg/L的IBA，28～32g/L的蔗糖、4.5～5.0g/L的琼脂的1/2MS培养基；所述生根培养的培养基的pH值优选的为5.5～6，更优选的为5.8。本发明中所述生根培养的温度，光照强度和光照时间与上述筛选培养过程中的一致，在此不再赘述；所述生根培养的时间优选为8～12d。本发明在所述生根培养结束后获得黑果枸杞耐盐试管苗。
下面结合实施例对本发明提供的一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、所需材料及试剂
(1)材料：电热恒温震荡培养箱、冰箱、玻璃棒、剪刀、滤纸、培养皿、医用注射器、喷壶、蛭石、锯末；
(2)试剂：EMS(甲基磺酸乙酯诱变剂)、NaCl
(3)基本培养基：基本培养基为MS，配方如下
大量元素：硝酸铵400.00mg/L、氯化钙96.00mg/L、硫酸镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/、L硝酸钙556.00mg/L、硫酸钾990.00mg/L；
微量元素：硫酸锰22.40mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.25mg/L；
铁盐：Na2·EDTA37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L；
有机成分：肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L盐酸吡哆醇0.5mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L；
分别将以上大量元素混合溶解为1000ml，微量元素、铁盐、有机成分溶解为500ml制作成试剂母液。制备培养基时，每1000ml蒸馏水中加入大量元素50ml，微量元素、铁盐、有机成分5ml，蔗糖30g/L、琼脂5g/L(以上试剂成分可按蒸馏水量的多少的比例增减)，之后根据具体培养基配方加入激素和其它试剂后蒸煮，调整pH值为5.8，分装每瓶约60～70ml，高温高压灭菌后待用。pH值采用质量浓度为4％的氢氧化钠溶液或质量浓度为8.3％的盐酸溶液进行调节。
2、培养步骤
一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法，具体有如下步骤：
1)种子处理及消毒
挑选当年采收的饱满、没有破损的黑果枸杞的种子，用常温的蒸馏水浸泡22h使种子充分吸水膨胀。使用浓度100mg/L的NaCl溶液40℃条件下浸泡2h，之后再采用15℃的低温条件下用浓度100mg/L的NaCl溶液浸泡2h，之后重复一遍高温和低温浸泡的操作处理，之后将种子放在超净工作台用75％的乙醇溶液浸泡40s，(常规方法采用乙醇结合氯化汞消毒，消毒用后的氯化汞不能重复使用，处理后对水源、土壤等环境资源造成很大污染)，浸泡期间用玻璃棒不断搅动，之后倒掉乙醇，倒入无菌水冲洗7～8次，冲洗期间用玻璃棒不断搅动，冲洗完后倒掉无菌水，将沥干水分的种子置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，吸干残留水渍后待用。
2)无菌苗培养
处理完成的黑果枸杞种子接种到无菌苗培养基上，培养基配方为1/2Hoagland营养液+琼脂粉6g/l，每瓶培养基接种5粒种子(接种前倒掉培养基经高温灭菌后冷却凝结的水分，以减小接种后的污染率，下同)。接种后置于黑暗条件下培养3d，黑暗培养的温度为25～30℃；之后在培养室培养，温度为25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12～14h/d。4d左右，黑果枸杞大量萌发，15d左右，无菌苗长至5～8cm，可用于进行胚性愈伤组织诱导的材料。
3)胚性愈伤组织诱导与NaCl胁迫
剪取生长15～20d无菌苗的叶片，将叶缘剪除，剩余部分剪切成0.3×0.5～0.3～0.5cm的小方块，平铺接种于胚性愈伤组织诱导液体培养基中，每瓶接种5个小块。培养基配方为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+脯氨酸400mg/L，附加蔗糖30g/L、培养基PH5.8，对照培养基中不加NaCl。
接种后放入恒温震荡培养箱中进行震荡培养，温度25℃、震荡频率20r/min、震荡时间为8h/d，黑暗条件下震荡培养7d后常规培养7d，常规培养时每天光照时间12～14h，光照强度1500～2000lx，温度29℃。即这一阶段的培养周期为14d，其中前7d黑暗条件下震荡培养，后7d光照条件下不震荡，其它参数均不变。
第一阶段后，在将培养14d的外植体连同培养基置于超净工作台上，之后将配制好的已灭菌NaCl溶液加入原液体培养基中，封口后重复第一阶段的培养方法，如此每14d增加1次，增加后培养基中NaCl的质量浓度依次为依次为1.0g/L、2.0g/L、5g/L，添加NaCl后每一阶段的培养方式与第一阶段均相同。28d后进入第三阶段，叶片边缘明显膨大。42d左右，培养基逐渐变为淡绿色，56d左右，液体培养基中可明显看见悬浮着大量大小不等的淡绿色颗粒，即为胚性愈伤组织；培养70d，即完成第五阶段的培养，此时，液体培养基中的胚性愈伤组织长至黄豆粒大小，可用于下一阶段的培养。
4)NaCl胁迫不定芽诱导与筛选
在超净台上用已灭菌纱布过滤液体培养基中的胚性愈伤组织颗粒，过滤完放入培养皿中，用手术刀将愈伤组织切成0.5×0.5cm的小块，平铺接种到NaCl胁迫不定芽诱导固体培养基中。培养基配方MS+6-BA 0.5～0.6mg/L+NAA0.2～0.5mg/L+NaCl 5g/L，附加蔗糖30g/L、琼脂4.5～5.0g/L、培养基PH5.8，接种进入常规培养，温度25℃、光照强度1500lx、光照时间12h/d。接种后10d部分胚性愈伤组织颗粒逐渐长大，部分颗粒逐渐变黄，28d已有大量不定芽长出。
剪取生长正常的不定芽，垂直转接入MS+6～BA0.2～0.6mg/L+2，4～D1.0～2.0mg/L+NaCl 5g/L培养基中，附加蔗糖30g/L、琼脂4.5～5.0g/L、培养基pH值5.8～6.0，接种后进入常规培养，温度25±2℃、光照强度1800lx、光照时间12h/d。28d后将正常生长的不定芽转接入MS+KT1.0～1.5mg/L+NAA0.3～0.6mg/L培养基中，附加蔗糖30g/L、琼脂4.5～5.0g/L、培养基pH值5.8～6.0。温度25±2℃、光照强度1500～2000lx、光照时间12～14h/d的培养室无菌培养28d；之后转接入相同培养基配方并附加NaCl 10g/L的培养基中培养28d，这一阶段培养条件和一阶段相同。
5)EMS诱变处理与不定芽增殖
经过以上阶段的培养，50％以上的愈伤组织能正常诱导产生不定芽，平均高度约3cm，之后将生长正常的不定芽剪成长1.5～2cm的茎段，在超净工作台上接种入浓度为4mg/L的EMS的诱变液中(诱变液已灭菌)，每瓶分装诱变液50ml并放入10个茎段，之后封口进行常规条件下震荡培养9h，震荡频率10r/min。
震荡培养结束后用已灭菌的纱布将茎段过滤，之后用无菌水将经过诱变处理的茎段冲洗3～5次，放入培养皿中并用滤纸吸干茎段表面的水渍。之后将茎段切成长0.5cm左右的小段，转接至培养基配方为MS+6～BA0.5mg/L+IBA0.1～0.3mg/L+NaCl 5g/L的增殖培养基中，培养基附加蔗糖30g/L、琼脂4.5～5.0g/L、pH值5.8～6.0，接种后常规条件培养，温度25±2℃、光照强度1500l～2000x、光照时间12～14h/d。培养7d后，转至不含NaCl的相同培养基中7d，之后转接至培养基配方为MS+6～BA0.5mg/L+IBA0.1～0.3mg/L+NaCl 10g/L的增殖培养基中，培养基附加蔗糖30g/L、琼脂4.5～5.0g/L、pH值5.8～6.0，接种后培养条件同上。培养7d后，转至不含NaCl的相同培养基中7d，增殖培养28d后，耐盐性较强的小茎段大量增殖，耐盐性弱的茎段不增殖。
6)生根培养
28d后将增殖培养中正常生长的增殖芽剪切为长2～3cm的小段，垂直插入配方为1/2MS+IBA0.1～0.3mg/L的培养基中，附加蔗糖10g/L、琼脂4.5～5.0g/L、培养基pH值5.8～6.0，接种后黑暗条件下培养72h，温度为28℃；72h后常规条件培养，温度25±2℃、光照强度1500l～2000x、光照时间12～14h/d。6d左右根系开始生长发育，30d左右，根系可长至4～5cm，即获得经过耐盐筛选的带根试管苗。
6)耐盐植株获得
将耐盐试管苗先进行闭瓶炼苗2d，而后将瓶盖打开1/2后注入100ml蒸馏水，室内自然光下放置3d后将瓶盖全部打开，随后将瓶苗移至温室全部打开瓶盖后放置2d，用自来水清洗瓶苗根部的培养基，清洗干净后移栽至锯末、河沙按照体积为1：1配比的基质中，常规培养使其成活，20～30d后，再进行移栽和耐盐植株的鉴定。
7)耐盐植株的鉴定
利用土壤全盐含量1.5％左右的盐碱原土盆栽法对获得的耐盐植株进行耐盐性鉴定，结果见表1，以未经诱变和NaCl筛选的再生植株作对照，未经过诱变的植株成活率为43.14％，而经过耐盐筛选后的植株移栽后成活率为81.25％，且植株长势良好，各项生长指标明显优于未经过诱变筛选的植株。
不同土壤盐分条件诱变株与其它植物移栽后成活率对比分析
表1不同土壤含盐量标准下诱变株与其它植物移栽后生长情况对比
根据土壤盐渍化程度的不同，将土壤分为非盐碱土、弱盐碱土、中盐碱土、强盐碱土、盐土物种类型，将玉米、未诱变黑果枸杞、诱变黑果枸杞分别移栽至盐渍化程度不同的5中土壤类型中，20d后，三种植物在不同土壤中的生长情况如表1所示。
玉米在含盐量小于0.3％的土壤中可以正常生长，成活率为100％，当土壤含盐量0.3～1.0％时，玉米不能正常生长，成活率为52.27％，当含盐量大于1.0％时，所移栽的玉米全部死亡。
黑果枸杞本身具有较强的耐盐性，未经过诱变的黑果枸杞植株在含盐量≤1.0％的盐渍化土壤中可以正常生长，成活率均大于90％，当土壤含盐量大于1.0％时，未经诱变的黑果枸杞植株成活率降低，在强盐渍土壤中成活率为63.14％，当含盐量大于2.0％时，大部分植株死亡，成活率仅为13.03％。
经过耐盐突变体筛选后的黑果枸杞诱变植株具有很强的耐盐性，在含盐量≤1.0％的盐渍化土壤中均可以正常生长，成活率均为100％，在土壤含盐量1.0～2.2的强盐渍化土壤中，成活率也高达81.25％，当土壤含盐量大于2.0％时，经过诱变筛选的黑果枸杞植株大部分生长正常，成活率达76.18％。
因此，经过耐盐突变体的筛选，大大提高了黑果枸杞植株的耐盐性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种黑果枸杞耐盐突变体的离体筛选方法，包括以下步骤：
1)将NaCl溶液浸泡处理过的黑果枸杞种子接种于无菌苗培养基中进行培养，获得无菌苗；
2)将所述无菌苗的叶片接种于含NaCl的胚性愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织培养，获得胚性愈伤组织颗粒；
3)将所述胚性愈伤组织颗粒接种于NaCl胁迫不定芽诱导培养基中进行不定芽培养，获得不定芽；
4)对所述不定芽进行NaCl胁迫培养，获得预耐盐不定芽；
5)对所述预耐盐不定芽进行EMS诱变处理后筛选耐盐不定芽；
6)将所述筛选得到的耐盐不定芽进行生根培养，获得黑果枸杞耐盐试管苗。
2.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述的NaCl溶液的浓度为80～150mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的离体筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述的NaCl溶液浸泡处理包括两轮高温浸泡-低温浸泡；所述高温浸泡的温度为38～42℃，所述高温浸泡的时间为1.5～2.5h；所述低温浸泡的温度为12～17℃，所述低温浸泡的时间为1.5～2.5h。
4.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，步骤1)中所述的培养获得无菌苗的过程包括依次进行的3～5d暗培养和2～10d光照培养。
5.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，步骤2)中所述的胚性愈伤组织诱导培养基为包括0.5～1.5mg/L的6-BA，0.2～0.8mg/L的NAA，300～500mg/L的脯氨酸和30～35g/L的蔗糖的MS培养基；所述胚性愈伤组织诱导培养基的pH值为5.5～6.0。
6.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，所述愈伤组织培养依次包括黑暗震荡培养阶段和光照静置培养阶段；所述黑暗震荡培养阶段的温度为23～27℃；所述黑暗震荡培养的转速为15～25rpm；所述黑暗震荡培养的震荡时间为6～10h/d。
7.根据权利要求6所述的离体筛选方法，其特征在于，所述黑暗震荡培养的时间为6～8d；所述光照静置培养的时间为6～8d。
8.根据权利要求6或7所述的离体筛选方法，其特征在于，所述愈伤组织培养在静置培养阶段后还包括梯度耐盐培养；所述梯度耐盐培养为每12～14d向所述胚性愈伤组织诱导培养基添加中NaCl。
9.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，步骤3)中所述的NaCl胁迫不定芽诱导培养基为包括0.2～0.4mg/L的6-BA，1.0～2.0mg/L的2,4-D，4.5～5.5g/L的NaCl，28～32g/L的蔗糖和4.5～5.0g/L琼脂的MS培养基；所述NaCl胁迫不定芽诱导培养基的pH值为5.5～6.0。
10.根据权利要求1所述的离体筛选方法，其特征在于，步骤5)中所述的EMS诱变处理用EMS诱变液的浓度为3.5～4.5mg/L，所述EMS诱变处理的时间为8～10h；所述EMS诱变处理的转速为8～12rpm。
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