CN101347099B - 落羽杉离体快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了落羽杉(Taxodium.distichum)的离体快速繁殖方法，属于植物组织培养领域。本发明方法包括以下步骤：(1)落羽杉种子消毒后取其成熟胚作为外植体，(2)不定芽的诱导培养，(3)不定芽的伸长培养，(4)不定芽的增殖培养，(5)壮苗的培养，(6)不定根的诱导培养，(7)形成再生植株，(8)炼苗移栽；其中，每个培养阶段所采用的基本培养基都是SH培养基，各个培养阶段所添加的生长调节剂，皆是采用正交设计实验后选择的最适宜的用量及配比。本发明方法所培育的落羽杉试管苗生长健壮，繁殖系数高，诱导生根率达到80％，移栽成活率达到90％左右，可进行规模化、工业化生产。

Description

落羽杉离体快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及一种植物的组织培养方法，尤其涉及落羽杉(Taxodium distichum)成熟胚离体快速繁殖方法，属于植物组织培养领域。

背景技术

落羽杉属(Taxodium Rich.)有三个树种，即：落羽杉、池杉和墨西哥落羽杉；其中，落羽杉(Taxodium distichum)是古老的“孑遗植物”，在晚侏罗世至早白垩纪就已繁盛，第四纪冰川以后在欧亚大陆全部灭绝，仅在北美洲和拉丁美洲部分地区保留并繁衍至今。

从树木形态、生物学特性看，落羽杉是高大乔木，冠形雄伟秀丽，枝叶繁茂，落叶期迟，常年景观优美，很适合作景观绿化之用。同时落羽杉主干明显，从基部到顶部不分叉，圆满通直，出材率高，材质优良，在美国有“永不腐朽之木”的称号，为优质的用材造林树种。落羽杉原分布区在美国东部至东南部，范围跨度大，气候从亚热带至温带，且长期处于沼泽地带，根系发达，在低、湿地带干基部形成不规则板根状，6～8龄时即会在根部向上长出“根膝”，有呼吸、通气、固着和贮藏养分等作用，具有很强的耐低温、耐水淹、耐干旱、耐瘠薄能力，同时具有很强的抗污染和抗病虫害的能力。

落羽杉属树种因其适应性强，生长快，树形美，材质优良，病虫害少，可在我国(北纬40°)以南广大地区作生态环境建设、用材绿化造林，江湖滩地，江河上、中游水源涵养等均可采用。目前，对于落羽杉的引种较少，对其种源变异、优良种源及无性系的选育等，尚未见报道(汪企明等，落羽杉属种源研究：种子和苗期变异.江苏林业科技，1993，(1)，1-4，3)。

植物组织培养技术是利用细胞的全能性，采取植物体上的细胞团或一块组织，通过人为条件的控制，使这些组织形成千百万植株，并且保存了母本的全部优良性状，且遗传性状稳定。这种方法可在短期内形成大量优良试管苗，进行规模化、工厂化生产。

许秀玉等公开了一种墨西哥落羽杉离体培养及再生体系的建立方法，该方法以墨西哥落羽杉的幼苗为外植体，依次经过不定芽的诱导、伸长、增殖培养，壮苗的培养，不定根的诱导培养，再生植株形成和炼苗移栽等步骤，该方法的生根率可达78％，但移栽成活率比较低，约20％左右(许秀玉等，墨西哥落羽杉离体培养及再生体系的建立.林业科学，2007年10月，第43卷第10期)。

迄今为止，有关落羽杉的离体快速繁殖方法尚未见报道。建立一种落羽杉的离体快速繁殖方法对于优良种源快速选育、遗传改良以及工厂化生产优质的无菌苗等方面均具有重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种落羽杉的离体快速繁殖方法，该方法可以在短期内形成大量优良落羽杉试管苗，可进行规模化、工厂化生产。

本发明的技术方案是通过以下技术方案来实现的：

一种落羽杉的离体快速繁殖方法，包括以下步骤：

(1)、将落羽杉的种子消毒后取其成熟胚作为外植体；

(2)、将成熟胚接种到不定芽诱导培养基上进行诱导培养；

(3)、将已分化出不定芽的胚外植体完整地继代于不定芽伸长培养基上进行培养，诱导不定芽伸长；

(4)、将步骤(3)所培养的不定芽单个切下后转入不定芽增殖培养基上进行不定芽增殖培养；

(5)、将具有明显主茎的小芽苗转移至壮苗培养基中进行壮苗培养；

(6)、将经过壮苗培养的芽苗转至不定根诱导培养基上诱导培养不定根的发生；

(7)、将形成不定根后的芽苗转至再生植株培养基上进行再生培养；

(8)、炼苗移栽，即得。

其中，上述离体快速繁殖方法中，步骤(2)中所述的不定芽诱导培养基为：SH基本培养基+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升，pH值为5.8；

步骤(3)中所述的不定芽伸长培养基为：大量元素减半的1/2SH基本培养基+6-苄氨基嘌呤(6-BA)5-6毫克/升+吲哚丁酸(IBA)5-6毫克/升+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升，其pH值为为5.8；

步骤(4)中所述的不定芽增殖培养基为：SH基本培养基+6-BA10-20毫克/升+IBA2-5毫克/升+萘乙酸(NAA)2-5毫克/升+蔗糖30克/升+琼脂3.25-6.5克/升，该培养基为半固态，其pH值为5.8；所述的不定芽增殖培养基优选为：SH基本培养基+6-BA10毫克/升+IBA2毫克/升+NAA2毫克/升+蔗糖30克/升+琼脂3.25克/升，该培养基为半固态，其pH值为5.8；

步骤(5)中所述的壮苗培养基为：SH基本培养基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升，pH值为5.8；所述的壮苗培养基优选为：SH基本培养基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升+硝酸银8.0毫克/升，pH值为5.8；

步骤(6)中所述不定根诱导培养基为：大量元素减半的1/2SH基本培养基+IBA20-25毫克/升+活性炭1克/升+蔗糖20克/升+琼脂6.5克/升，pH值为5.8；

步骤(7)中所述再生植株培养基为：SH基本培养基+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升，pH值为5.8。

为了达到更好的技术效果，在将成熟胚接种到不定芽的诱导培养基上进行诱导培养之前，可将成熟胚按照以下方法进行预处理，即：将成熟胚在附加生长调节剂6-BA8-10毫克/升的SH液体培养基浸泡处理成熟胚8-36小时，优选为24小时；由于胚在萌发初期对营养的吸收是由子叶进行的，而在固体培养基上只有少数子叶接触到培养基。与直接将成熟胚接种于附加生长调节剂的固体培养基中相比，本发明通过用附加生长调节剂6-BA的SH液体培养基浸泡处理成熟胚有利于胚吸收培养基中的营养物质及生长调节剂，更有利于外植体诱导出更多的不定芽。

作为一种更优选的技术方案，步骤(1)中将落羽杉的种子进行消毒之前先将其在0-4℃低温条件下保存一周，然后再按照以下方法进行消毒处理：用纱布包裹种子在自来水中冲洗1-3天，然后在无菌烧杯中用70％酒精浸泡，无菌蒸馏水冲洗2-3次后用0.1％升汞(HgCl₂)表面灭菌，最后用无菌水冲洗6-8次；更优选的：用70％酒精浸泡种子1分钟，用0.1％升汞表面灭菌的时间为10分钟。

步骤(2)和步骤(6)中所述的不定芽诱导和不定根诱导的培养优选在以下条件进行：首先在温度为25℃的黑暗条件下培养一周后再转入光照为2000勒克斯的光照条件下进行诱导培养。

步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)和步骤(7)中所述的不定芽伸长、不定芽增殖、壮苗培养和再生植株培养优选在以下条件进行：培养温度为25℃，光照强度为2000勒克斯(lux)，光照时间为10-14小时/天。

步骤(8)中所述的炼苗移栽优选为：移栽前逐渐打开培养瓶的封口膜在光照培养室内炼苗5-7天，然后将生根的小苗取出，用自来水洗去根部残留的琼脂培养基，移栽于装有蛭石与泥碳土等比例混合的基质的容器内，每周浇一次SH基本培养基。

本发明利用落羽杉成熟胚为外植体进行离体快速繁殖，每个培养阶段所采用的基本培养基都是SH基本培养基，由于SH培养基降低了NH₄ ⁺的浓度，大大提高了氨基酸和维生素的用量，与常用的MS基本培养基相比，采用SH基本培养基更有利于落羽杉的生长。

本发明中涉及的所有培养基中生长调节剂，皆是在各阶段采用正交设计实验后选择的最适宜的用量及配比，重复验证性实验结果一致。

在不定芽增殖阶段，本发明将不定芽转入SH半固体培养基，置于70rpm的普通摇床中振荡培养，可以使不定芽增殖系数扩大10倍，同样是因为液体、固体混合培养基增大了与外植体的接触面积，更有利于不定芽吸收培养基中的营养物质及生长调节剂，同时有利于培养瓶与外界环境的通气状况。

采用植物组织培养的方法繁殖落羽杉，不仅可以节约大量外汇，而且不受外界条件的限制，四季皆可进行，节约育苗占地，降低生产成本。采用本发明培育的落羽杉试管苗生长健壮，繁殖系数高，诱导生根率达到80％，移栽成活率高(达到90％左右)，是工厂化大规模生产落羽杉幼苗的简便、快捷的技术体系。

附图说明

图1落羽杉不定芽的分化与伸长。

图2落羽杉不定芽的增殖。

图3落羽杉在附加活性炭的培养基的培养。

图4落羽杉不定根的诱导。

图5落羽杉再生植株的形成。

图6落羽杉试管苗的主根外观。

图7移栽后的落羽杉。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一、试验材料

1、成熟落羽杉种子来自于美国路易斯安娜州。

2、培养基的配制：

(1)、“SH基本培养基“的组成或配制方法；

表1 SH培养基(Schenk and Hildebrandt，1972)

 

SH I大量元素母液成分	含量/mg·L<sup>-1</sup>	SH II微量元素母液成分	含量/mg·L<sup>-1</sup>	SH III铁盐母液成分	含量/mg·L<sup>-1</sup>	SHIV有机化合物母液成分	含量/mg·L<sup>-1</sup>
								KNO<sub>3</sub>	2500	H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>	5.0	FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	15.0	肌醇	1000
NH<sub>4</sub>H<sub>2</sub>PO4	300	ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	1.0	Na<sub>2</sub>EDTA·H<sub>2</sub>O	20.0	盐酸硫胺素	5.0
								CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O	200	MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	10.0			烟酸	5.0
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O	400	Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O	0.1			烟酸吡哆醇	0.5
										KI	1.0
		CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O	0.2
										CoCl<sub>2</sub>	0.1

上述SH培养基母液配好后，储存于4℃冰箱待用。根据配置培养基的数量，称量所需琼脂和蔗糖，将其倒入欲配培养基体积3/4的无菌水中，顺序加入所需的大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液和有机成分母液，每加入一种都充分搅拌，最后加水定容至培养基最终体积，用pH计测试培养基酸碱度，用0.1mol·L^-1的KOH或0.1mol·L^-1的HCl将pH值调整至5.8。

(2)、成熟胚预处理液体培养基：SH基本培养基添加6BA8-10mg·L^-1，蔗糖20g·L^-1，不添加琼脂，调节pH值为5.8，培养基在121℃下灭菌15min。

(3)、不定芽诱导培养基：SH基本培养基添加蔗糖至30克/升、添加琼脂至6.5克/升，调节pH值为5.8；在121℃下灭菌15min。

(4)、不定芽伸长培养基：大量元素减半的1/2SH基本培养基中添加6-BA至56毫克/升、添加IBA至5-6毫克/升、添加蔗糖至30克/升、添加琼脂至6.5毫克/升，调pH值为5.8；在121℃下灭菌15min。

(5)、不定芽增殖培养基：SH基本培养基添加6-BA至10毫克/升、添加IBA至2毫克/升、添加NAA至2毫克/升、添加蔗糖至30克/升、添加琼脂至3.25克/升，该培养基为半固态，调pH值为5.8；在121℃下灭菌15min。

(6)、壮苗培养基：SH基本培养基，添加活性炭至1克/升，添加蔗糖至30克/升、添加琼脂至6.5克/升，调pH值为5.8；在121℃下灭菌15min。

(7)、不定根诱导培养基：大量元素减半的1/2SH固体培养基，添加IBA至20-25毫克/升、添加活性炭至1克/升，添加蔗糖至20克/升、添加琼脂至6.5克/升，调pH值为5.8；在121℃下灭菌15min。

(8)、再生植株培养基：SH基本培养基添加蔗糖至30克/升、添加琼脂至6.5克/升，调pH值为5.8；在121℃下灭菌15min。

3.培养条件

培养条件采用人工光照，封闭式培养室，光照强度为2000Lux，光照时间10-14h·d^-1，温度(25±2)℃。

其中，不定芽的诱导和不定根的诱导是在25℃的黑暗条件下培养一周后再转入光照强度为2000Lux的条件下进行诱导培养；不定芽的伸长培养、不定芽的增殖培养、壮苗培养和再生植株培养均在以下条件下培养：温度为25℃、光照强度为2000Lux，光照时间10-14h·d^-1。

二、试验方法

将落羽杉成熟种子置于4℃冰箱低温保存一周，接种前用纱布包裹种子在自来水中冲洗2天，然后在无菌烧杯中用70％酒精浸泡种子1min，无菌蒸馏水冲洗23次，再用0.1％升汞(HgCl₂)表面灭菌10min，期间轻轻摇动烧杯使其充分接触，无菌水冲洗6-8次。将处理好的种子放在无菌干燥的滤纸上吸取表面水分。在超净工作台用解剖刀小心剥除坚硬的外种皮，剥除胚乳并去除胚根部分的成熟胚，备用；

将所剥离的成熟胚浸泡在成熟胚预处理液体培养基中处理24h，然后用灭菌滤纸吸干表面水分；

将预处理后的成熟胚平放于不定芽诱导培养基表面，置于25℃黑暗条件下培养一周再转入光照强度为2000Lux的条件下进行诱导培养；不定芽诱导20天后，胚外植体子叶、子叶基部、胚轴开始有大量不定芽分化；将已分化出不定芽的胚外植体完整地继代于不定芽伸长培养基，培养温度25℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-14h·d^-1；此阶段不定芽在原外植体上伸长，平均一个胚外植体可获得9-12个长势旺盛、颜色嫩绿、具有明显可辨茎段的不定芽(图1)；

待不定芽长至1.0-1.5cm长时，将其逐一单个切下，转入不定芽增殖的半固体培养基中，置于70rpm的普通摇床中处理30d进行不定芽增殖，培养温度25℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-14h·d^-1(图2)；待不定芽增殖出的新芽长至1.0-1.5cm长时，反复进行此步骤操作，逐一单个切下1.0-1.5cm长的不定芽，转入新鲜的SH半固体培养基中振荡培养。平均每30d更换一次新鲜培养基。不定芽转入增殖培养基30d后，每个伸长的小枝叶腋有6-8个新芽产生，同时小枝基部被切割的部分膨大，有20-30个绿色突起。如此反复23个月可将不定芽的繁殖系数扩大到80-100倍。

为防止芽苗的玻璃化，将具有明显主茎的小芽苗转移至壮苗培养基中，培养温度25℃，光照强度2000lux的日光灯照明，光照时间10-14h·d^-1。此阶段芽苗的高生长显著，主茎平均30d生长4-5cm(图3)；

待优质芽苗的主干长至8-10cm左右时，将芽苗转至不定根诱导培养基，置于25℃黑暗条件下培养一周再转入正常光照条件，诱导不定根的发生，诱导生根率达80％(图4)。

不定根形成后将芽苗转至形成再生植株培养基，进行根苗的伸长生长。培养温度25℃，光照强度2000lux(日光灯照明)，光照时间10-14h·d^-1。30d后，发达的主根布满玻璃瓶底部，主根肉质、白色，长达2025cm，苗高生长达12-18cm(图5、图6)；

将生长健壮的再生植株的培养瓶封口膜在光照培养室内于移栽前逐渐打开，炼苗5-7d，然后将植株取出后，用水洗去根部残留的琼脂培养基，移栽于装有蛭石与泥碳土等比例混合的基质的容器内。每周浇一次SH基本培养基。2个月后移栽成活率为90％左右(图7)。

实施例2

除不定芽增殖培养基中所用6-BA至20毫克/升、IBA5毫克/升、添加NAA至5毫克/升，其余均与实施例1相同。

实施例3

除不定芽增殖培养基中所用琼脂为6.5克/升，其余均与实施例1相同。

实施例4

除壮苗培养基中添加防褐剂硝酸银8.0mg/L，其余均与实施例1相同。

试验例1

表2和表3分别给出了实施例1至4中不同培养基对不定芽增殖培养和壮苗培养阶段落羽杉生长的影响数据。

表2 不定芽增殖培养基对落羽杉不定芽增殖培养的影响

表3 壮苗培养基中防褐剂的添加对芽苗的影响

 

实施例	防褐剂活性炭(g/L)	防褐剂硝酸银(mg/L)	褐化率(％)
				实施例1	1	0	32
实施例2	1	0	32
				实施例3	1	0	32
实施例4	1	8	18

Claims (5)

1.落羽杉Taxodium distichum的离体快速繁殖方法，包括以下步骤：

(1)、落羽杉的种子消毒后取其成熟胚作为外植体；

(2)、将落羽杉的成熟胚在液体培养基中浸泡处理8-36小时后，接种到不定芽诱导培养基上诱导培养不定芽，其中，所述的液体培养基是：SH基本培养基+6-苄氨基嘌呤8-10毫克/升+蔗糖20克/升；所述的不定芽诱导培养基是：SH基本培养基+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升，pH值为5.8；不定芽的诱导培养条件为在25℃黑暗条件下培养7天后再转入光照为2000勒克斯的光照条件下培养；

(3)、将已分化出不定芽的胚外植体完整地继代于不定芽伸长培养基上进行培养，诱导不定芽伸长，其中所述的不定芽伸长培养基是：大量元素减半的1/2SH基本培养基+6-苄氨基嘌呤5-6毫克/升+吲哚丁酸5-6毫克/升+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升，其pH值为5.8；不定芽伸长培养条件为：温度为25℃，光照强度为2000勒克斯，光照时间为10-14小时/天；

(4)、将步骤(3)所培养的不定芽切下后转入到不定芽增殖培养基上进行不定芽增殖培养，其中所述的不定芽增殖培养基是：SH基本培养基+6-苄氨基嘌呤10-20毫克/升+吲哚丁酸2-5毫克/升+萘乙酸2-5毫克/升+蔗糖30克/升+琼脂3.25-6.5克/升，该培养基为半固态，其pH值为5.8；不定芽增殖培养条件为：温度为25℃，光照强度为2000勒克斯，光照时间为10-14小时/天；

(5)、将具有明显主茎的小芽苗转移至壮苗培养基中进行壮苗培养，其中所述的壮苗培养基为：SH基本培养基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升，pH值为5.8；壮苗培养条件为：温度为25℃，光照强度为2000勒克斯，光照时间为10-14小时/天；

(6)、将经过壮苗培养的芽苗转至不定根诱导培养基上诱导培养不定根的发生，其中所述不定根诱导培养基为：大量元素减半的1/2SH基本培养基+吲哚丁酸20-25毫克/升+活性炭1克/升+蔗糖20克/升+琼脂6.5克/升，pH值为5.8；不定根的诱导培养条件为在25℃黑暗条件下培养7天后再转入光照为2000勒克斯的光照条件下培养；

(7)、将形成不定根后的芽苗转至再生植株培养基上进行再生培养，其中所述再生植株培养基为：SH基本培养基+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升，pH值为5.8；再生植株培养条件为：温度为25℃，光照强度为2000勒克斯，光照时间为10-14小时/天；

(8)、炼苗移栽，即得，其中，所述的炼苗移栽为：移栽前打开培养瓶的封口膜在光照培养室内炼苗5-7天，然后将生根的小苗取出，用自来水洗去根部残留的琼脂培养基，移栽于装有基质的容器内，每周浇一次SH基本培养基；所述的基质由蛭石与泥碳土按照1∶1的重量比例组成。

2.按照权利要求1所述的离体快速繁殖方法，其特征在于，步骤(4)中所述的不定芽增殖培养基是：SH基本培养基+6-苄氨基嘌呤10毫克/升+吲哚丁酸2毫克/升+萘乙酸2毫克/升+蔗糖30克/升+琼脂3.25克/升。

3.按照权利要求1所述的离体快速繁殖方法，其特征在于，步骤(5)中所述的壮苗培养基为：SH基本培养基+活性炭1克/升+蔗糖30克/升+琼脂6.5克/升+硝酸银8.0毫克/升。

4.按照权利要求1所述的离体快速繁殖方法，其特征在于：步骤(1)中将落羽杉种子进行消毒之前先将种子在0-4℃低温条件下保存一周，然后再按照以下方法进行消毒处理：用纱布包裹种子在自来水中冲洗1-3天，然后在无菌烧杯中用70％酒精浸泡，无菌蒸馏水冲洗2-3次后用0.1％升汞表面灭菌，最后用无菌水冲洗6-8次。

5.按照权利要求4所述的离体快速繁殖方法，其特征在于：落羽杉种子消毒处理方法中：用70％酒精浸泡落羽杉种子的时间为1分钟，用0.1％升汞表面灭菌的时间为10分钟。

Images