CN101578960B - 一种减少八仙花组培苗气生根的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养技术领域，具体公开了一种减少八仙花气生根方法，解决了八仙花组培过程中气生根的问题，可提高八仙花组培苗的移栽成活率。本发明通过以下步骤实现：以八仙花组培苗为实验材料，接种于珍珠岩(40-60ml)+25-35ml液体生根培养基(1/2B5+NAA或IBA0.1-1.0mg/L+糖10g/L pH4-7)，30天后组培苗无气生根形成，培养瓶内生根率达100％，移栽成活率可达100％。本发明不仅提高移栽成活率和简化移栽操作程序，而且用珍珠岩代替琼脂，可循环利用，节约了组培成本。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种减少八仙花组培苗气生根的方法，以解决八仙花组培苗生根过程中产生气生根的问题，提高八仙花的再生植株的移栽成活率。
背景技术
八仙花(Hydrangea macrophylla)绣球花科，八仙花属，落叶灌木，高1-2m，花色艳丽，花朵硕大，花期长，观赏价值高，是重要的园林和室内盆花植物之一。近年来，随着微型盆栽如‘雪王后’(H.m.‘SnowQueen’)、‘红色新娘’(H.m.‘Blushing Bride’)等名优新品种的培育成功，微型八仙花在国内外市场越来越受到欢迎，其种苗供不应求。组织培养技术在苗木快繁中显得越来越重要。与很多其他花卉一样，在八仙花组培快繁过程中，通过增加继代次数、应用细胞分裂素是提高繁殖系数常用的方法。但在提高增殖率的同时也很容易生成气生根，即在培养基表面以上的茎的部位形成的根(如马铃薯)。气生根的形成容易造成八仙花试管苗老化，主要表现为组培苗生长较弱，茎基根系少，生长差，试管苗的存活率低，导致移栽成活率不高，给生产推广应用上带来很大影响。
前人有关八仙花的组培的报道主要集中在中国栽培的普通八仙花原种(Hydrangea macrophylla)上。江弈凤(1996)、邱运亮(2005)、任叔辉(2006)、雷亚灵(2008)等主要从八仙花快繁培养基和激素种类和浓度方面做了研究，尚未涉及有关气生根的问题。由于八仙花品种来源不同，基因型的差异表现在快繁、增殖、生根培养等过程中产生气根的差异性也不同。一般八仙花组培苗用胶化剂琼脂蔗糖作为支撑物质，增殖后培养瓶内生根至瓶外，严重影响八仙花再生植株的移栽成活率。该问题到目前为止是八仙花离体繁殖的难题尚未解决。申请人分析，造成八仙花组培苗气生根问题主要有以下几个原因：(1)品种的特异性，矮花盆栽八仙花品种中均有一定得气生根的现象形成，个别品种特别严重。(2)培养瓶内透气性差及其凝胶中水分较多，瓶内湿度较大，容易诱导八仙花形成气生根。(3)继代次数对气生根的形成也有一定得影响。组培苗经过多次继代，气生根增加，生长较弱。(4)组培苗在高浓度的激素条件下，容易产生气生根。在申请人所供试的10个八仙花微型品种中，随着激素浓度和继代次数的增加，繁殖系数增加，气根数量相应增加但程度不同。为了满足八仙花增殖率的需要，八仙花茎段在B5基本培养基+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1.0mg/L+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+琼脂7g/L的快繁增殖培养中，增殖率高，植株的生长速度较快，并生长健壮，但同时又导致气生根的形成。
现有文献对八仙花离体生根的报道主要限于在生根培养基的筛选，但是有关植物组织培养特别是八仙花的快繁殖过程中外植体的生根是直接受到前处理(培养步骤和培养基)的影响，现有专利或非专利文献都没有涉及。
发明内容
本发明的目的是提供一种减少八仙花组培苗气生根的方法，以解决八仙花组培苗生根过程中产生气生根的难题，提高八仙花的再生植株的移栽成活率。
本发明对八仙花组织培养中的关键步骤生根移栽做了试验对比研究，利用珍珠岩作为支持体代替琼脂，结合生根培养基的设计，解决了八仙花气生根的问题，从而提高了茎基生根率和移栽成活效果。
本发明采用以下技术方案：
申请人发明了一种减少八仙花组培苗气生根的方法，其步骤包括：
A：在培养瓶中加入40-60mL的珍珠岩，然后加入25-35mL液体生根培养基，所述的液体生根培养基成分及配比如下：1/2 B5基本培养基+萘乙酸或吲哚丁酸0.1-1.0mg/L+蔗糖10g/L，调pH至4-7，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，备用；
B：在无菌环境下(例如在超净工作台中)，将苗高为1-2cm具有2片以上叶片的八仙花组培苗(组培苗获得以前的培养步骤和培养基的设计参见实施例部分)的顶芽接种于A步骤制备的生根培养基上，在培养室内养30-50天；
C：从珍珠岩中取出八仙花组培苗，勿需清洗和炼苗，直接将八仙花组培苗移栽到体积比为1∶1的泥炭土∶珍珠岩的基质中；
其中
上述步骤A和B的培养条件是：光照为1500-2000lx，光照时间为16h.d-1，培养温度为23-25℃；
上述步骤C的移栽条件是：遮荫80％，保持相对湿度95％，栽培温度为25℃；
上述步骤A步骤的1/2B5基本培养基成分按mg/L计的成分及配比如下：
硝酸钾 1250.0；
二水氯化钙 75.0；
七水硫酸镁 125.0；
硫酸氨 67.0；
磷酸二氢钠 75.0；
碘化钾 0.375；
硼酸 1.5；
四水硫酸锰 5.0；
七水硫酸锌 1.0；
二水钼酸钠 0.125；
五水硫酸铜 0.0125；
六水氯化钴 0.0125；
七水硫酸亚铁 13.9；
乙二胺四乙酸二钠 18.7；
肌醇 50.0；
烟酸 0.5；
盐酸吡哆醇 0.5；
盐酸硫胺素 5.0。
上述B5培养基参照报道的培养基配方制备(参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版)。
本发明有益的效果是：
1、由于利用珍珠岩作为基质，加入一定比例的液体生根培养基，可有效调节培养瓶中的湿度，从而抑制了气生根的形成，有利于在培养基里面形成正常根系。
2、珍珠岩形成了疏松的、黑暗的环境，有利于诱导八仙花组培苗根的形成。明显缩短了八仙花组培苗的生根时间，8天左右就能形成完整的根，本发明的生根率和移栽成活率均为100％。而且在该环境下，八仙花再生植株生长快速健壮。
3、本发明利用珍珠岩作支持体，勿需瓶内炼苗后和清洗根系直接移栽，减少对根系的损伤，简化了移栽程序，提高了移栽成活率。而且珍珠岩价格便宜，可重复循环利用，节约组培成本。
4、本发明的培养基中，申请人将蔗糖含量从30g/L降低至10g/L，从而节约组培成本。
5、本发明方法简便、易行，操作方便，可提高矮化八仙花品种生根及移栽的效果。
附图说明
图1A：培养30天后八仙花组培苗在50mL珍珠岩+25mL液体生根培养基(1/2 B5基本培养基+IBA0.5mg/L蔗糖10g/L，pH5.8)中的生长情况；
图1B：培养30天后八仙花组培苗在琼脂7g/L+1/2 B5基本培养基+IBA 0.5mg/L+蔗糖10g/L，pH5.8的生根培养基中生长情况；
图2A：培养30天后八仙花组培苗在50mL珍珠岩+25mL液体生根培养基(1/2 B5基本培养基+IBA0.5mg/L蔗糖10g/L，pH5.8)中的根系生长情况；
图2B：培养30天后八仙花组培苗在琼脂7g/L+1/2 B5基本培养基+IBA0.5mg/L+蔗糖10g/L，pH5.8的生根培养基中根系生长情况。
图3：八仙花组培苗在珍珠岩支持体上生根和移栽成活情况。
图4：珍珠岩基质中不同液体生根培养基(1/2 B5基本培养基+IBA0.5mg/L+蔗糖10g/，调pH至5.8)用量情况下八仙花组培苗的生根情况，在图4中：
图4A：珍珠岩50mL+液体培养基25mL的液体生根培养基中的八仙花组培苗的生根及防止气生根的情况；图4B：珍珠岩50mL+液体培养基35mL的培养基中八仙花组培苗的生根及防止气生根的情况；图4C：珍珠岩50mL-液体培养基15mL培养基中八仙花组培苗的生根及抑制气生根的情况。
具体实施方案
实施例1
A：在培养瓶中加入50mL的珍珠岩，然后加入25mL的液体生根培养基(1/2 B5基本培养基+吲哚丁酸(IBA)0.2、0.5、1.0mg/L+蔗糖10g/L1，调pH至5.8)，在121℃高压蒸汽灭菌20min，备用；
B：在无菌条件下，将八仙花组培苗的顶芽(苗高1-2cm，具有2片以上叶片)，接入配好的生根培养基内，在培养室内培养30-50天(见图1A，图2)。
C：从珍珠岩中取出八仙花组培苗，不需要清洗和炼苗，直接将组培苗移栽到为泥炭土∶珍珠岩体积比为1∶1的基质中；
上述步骤A、B的培养条件分别是：光照为1500-2000lx，光照时间16h.d-1，培养温度为23-25℃；
上述步骤C的移栽和栽培条件分别是：盆栽场用遮阳网遮荫80％，保持相对湿度95％，气温为10-25℃。
在本实施例中，八仙花在B步骤的前处理(培养)的基础培养如下：
实验材料购自武汉花卉开发中心的八仙花‘雪球’品种(Hydrangea.macrophylla‘Kuhnert’)，取其幼嫩茎段，先在1％洗衣粉漂洗10min，再在自来水中冲洗30min，然后在无菌超净工作台上用75％酒精消毒30s后，用0.1％的升汞消毒8min，最后用无菌水冲洗3-5次，将八仙花茎段切割成1-2cm的带芽茎段接种于诱导培养基上，所述的诱导培养基成分及配比如下：(1)B5基本培养基+6-BA 0.5mg/L+NAA0.01mg/L+蔗糖3％，调pH至5.8，在121℃高压蒸汽灭菌20min。培养条件是：光照为1500-2000lx，光照时间16h.d-1，培养温度为23-25℃，经过30天的培养，腋芽诱导率达100％。以八仙花离体萌发的1.5cm腋芽茎段作为外植体接种于增殖培养基上，所述增殖培养基的成分及配比为B5基本培养基+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L，培养室光照为1500-2000lx，光照时间为16h.d-1，培养温度为23-25℃，培养30d，带腋芽的八仙花离体茎段不经愈伤过程直接形成不定芽，其增殖系数可达10.6。然后取1-2cm再生苗顶芽，在无菌条件下转入本发明制备的生根培养基(参见本实施例的步骤B)上，继续完成八仙花组培苗的生根和防止气生根的形成。
表1珍珠岩生根培养基中不同浓度IBA对八仙花再生苗气生根形成的影响
| 处理编号及IBA水平 | 气生根率％ | 基部生根率(％) | 平均根数(个) | 平均根长(cm) | 平均苗高(cm) | 移栽成活率(％) | 再生苗生长状况 |
| 1号(IBA 0.2mg/L) | 0.00 | 100.00 | 7.37 | 1.47 | 2.25 | 100.00 | 无气生根形成，植株生长较快，基部根细长。 |
| 2号(IBA 0.5mg/L) | 0.00 | 100.00 | 5.88 | 1.06 | 2.13 | 100.00 | 无气生根形成，植株生长健壮健壮，叶片绿色，且基部根细长。 |
| 3号(IBA 1.0mg/L) | 2.25 | 100.00 | 4.13 | 0.85 | 1.73 | 100.00 | 少量气生根形成，叶片小而呈黄，且基部根粗短。 |
实施例2
培养室内盆栽场培养程序、培养条件和栽培管理同实施例1。
具体步骤是：
A：在培养瓶中加入50mL生根培养基(1/2 B5基本培养基+IBA分别设0.2、0.5、1.0mg/L三种配比+蔗糖10g/L+琼脂7g/L，调pH至5.8)，在121℃高压蒸汽灭菌20min；
B：将八仙花组培苗的顶芽(苗高1-2cm，带2片以上叶片)，在超净工作台无菌条件下接入步骤A的生根培养基内，在培养室培养30-50天；
C：将八仙花组培苗从步骤B的加有琼脂的生根培养基中取出，洗净根部的培养基，直接将八仙花组培苗移栽到泥炭土∶珍珠岩体积比为1∶1的基质中，移栽成活率可达50％左右。
上述步骤A、B的培养条件分别是：光照为1500-2000lx，光照时间为16h.d-1，培养温度为23-25℃；
上述步骤C的移栽和栽培条件分别是：盆栽场用遮阳网遮荫80％，保持相对湿度95％，气温为10-25℃。
表2琼脂生根培养基中不同浓度IBA对八仙花再生苗气生根的影响
实施例3
培养室内和盆栽场培养程序、培养条件和栽培管理同实施例1。
具体步骤是：
A：在培养瓶中加入50mL左右珍珠岩，然后分别加入0、15mL、25mL、35mL液体生根培养基(1/2 B5基本培养基+IBA 0.5mg/L+蔗糖10g/L，调pH至5.8)，在121℃高压蒸汽灭菌20min；
B：在超净工作台的无菌环境中，将八仙花组培苗顶芽(苗高1-2cm，2片以上叶片)，接入A步骤配制的生根培养基内，在培养室培养30-50天(见图4A，B，C)。
C：从珍珠岩中取出八仙花组培苗，勿需清洗和炼苗，直接将八仙花组培苗苗移栽到泥炭土∶珍珠岩体积比为1∶1的基质中，移栽成活率可达100％。
上述步骤A、B的培养条件分别是：光照为1500-2000lx，光照时间16h.d-1，培养温度为23-25℃；
上述步骤C的移栽和栽培条件分别是：盆栽场用遮阳网遮荫80％，保持相对湿度95％，气温为10-25℃。
表3珍珠岩基质中不同液体生根培养基用量对八仙花再生苗气生根的影响
| 处理编号与液体培养基用量(mL) | 气生根率(％) | 基部生根率(％) | 平均根数(个) | 平均根长(cm) | 平均苗高(cm) | 移栽成活率(％) | 再生苗生长状况 |
| 1号(0mL) | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 植株死亡 |
| 2号(15mL) | 0.00 | 100.00 | 4.89 | 1.24 | 1.52 | 90.00 | 无气生根产生，但植株生长缓慢，基部根少且短 |
| 3号(25mL) | 0.00 | 100.00 | 6.58 | 1.53 | 2.32 | 100.00 | 无气生根产生，植株健壮，根较长 |
| 4号(35mL) | 8.75 | 100.00 | 5.08 | 1.25 | 1.88 | 100.00 | 有少量气生根，但植株生长较慢，且根粗短 |
实施例4
培养室内和盆栽场培养程序、培养条件和栽培管理同实施例1。
具体步骤是：
A：在培养瓶中加入50mL珍珠岩，然后加入25mL液体生根培养基(1/2 B5基本培养基+NAA 0.2，0.5，1.0mg/L+蔗糖10g/L，调pH至5.8)，在121℃高压蒸汽灭菌20min；
B：在超净工作台的无菌环境中，将八仙花组培苗顶芽(苗高1-2cm，2片以上叶片)，接入A步骤配好的培养基内，在培养室培养30-50天；
C：从珍珠岩中取出八仙花组培苗，勿需清洗和炼苗，直接让苗移栽到泥炭土∶珍珠岩(体积比为1∶1)的基质中，移栽成活率可达100％；
上述步骤A、B的培养条件分别是：光照为1500-2000lx，光照时间16h.d-1，培养温度为23-25℃；
上述步骤C的移栽和栽培条件分别是：盆栽场用遮阳网遮荫80％，保持相对湿度95％，栽培温度为10-25℃。
表4珍珠岩基质中不同浓度NAA对八仙花再生苗的气生根的影响
| 处理编号及NAA水平 | 气生根率(％) | 基部生根率(％) | 平均根数(个) | 平均根长(cm) | 平均苗高(cm) | 移栽成活率(％) | 再生苗植株生长状况 |
| 1号(NAA0.2mg/L) | 0 | 100.00 | 6.33 | 1.13 | 2.0 | 100.00 | 无气生根形成，植株生长较快，基部根健壮 |
| 2号(NAA0.5mg/L) | 0 | 100.00 | 6.5 | 1.23 | 1.825 | 100.00 | 无气生根形成，植株健壮，基部根较长 |
| 3号(NAA1.0mg/L) | 0 | 100.00 | 6.00 | 1.09 | 1.67 | 100.00 | 无气生根形成，但叶片多数发黄 |
实施例5
A：在培养瓶中加入50mL左右珍珠岩，然后加入25mL左右的液体生根培养基(1/2 B5基本培养基+IBA0.5mg/L+蔗糖10g/L，pH3、4、5、6、7、8)，在121℃高压蒸汽下灭菌20min。
B：在无菌环境中，将八仙花组培苗顶芽(苗高1-2cm，2片以上叶片)，在无菌条件下接入配好的生根培养基内，在培养室培养30-50天。
C：然后从珍珠岩中取出八仙花苗，勿需清洗和炼苗，直接让苗移栽到泥炭土∶珍珠岩(体积比1∶1)的基质中，移栽成活率可达100％。
上述步骤A、B的培养条件分别是：光照为1500-2000lx，光照时间16h.d-1，培养温度为23-25℃；
上述步骤C的移栽和栽培条件分别是：盆栽场用遮阳网遮荫80％，保持相对湿度95％，栽培温度为10-25℃。
培养40天后结果如表5所示。
表5珍珠岩基质中不同液体生根培养基pH值对八仙花气生根的影响
| 处理编号及pH值 | 气生根率(％) | 基部生根率(％) | 平均根数(个) | 平均根长(cm) | 平均苗高(cm) | 移栽成活率(％) | 再生苗生长状况 |
| 1号(pH3) | 4.25 | 100.00 | 4.00 | 0.80 | 1.75 | 100.00 | 偶有气生根形成，植株叶片发黄。 |
| 2号(pH4) | 0.00 | 100.00 | 5.25 | 1.05 | 2.33 | 100.00 | 无气生根生根，叶片黄绿色 |
| 3号(pH5) | 0.00 | 100.00 | 5.57 | 1.21 | 2.17 | 100.00 | 无气生根形成，植株健壮，基部根发达 |
| 4号(pH6) | 0.00 | 100.00 | 6.33 | 1.59 | 2.51 | 100.00 | 无气生根形成，叶片绿色，基部根发达 |
| 5号(pH7) | 0.00 | 100.00 | 6.17 | 1.24 | 1.38 | 100.00 | 无气生根形成，且叶片绿色，基部根生长较慢 |
| 6号(pH8) | 0.00 | 100.00 | 5.17 | 0.91 | 1.56 | 100.00 | 无气生根形成，但植株生长较慢，叶黄绿色 |
除上述实施方案外，本发明还有其他实施方案，凡采用同等替换等效变换形成的技术方案，均落在本发明的要求保护范围内。
参考文献
[1]江奕凤.绣球花的组织培养.亚热带植物通讯[J].1998，27(1)：53.
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[6]雷亚灵，等.八仙花茎段组织培养技术研究.西北林学院学报[J].2008，23(4)：101-103.
[7]黄萍，等.GA3、NAA、BA对马铃薯试管苗气生根形成的影响.种子[J].2003(5)：105-107.
Claims (1)
1.一种减少八仙花组培苗气生根的方法，其步骤包括：
A：在培养瓶中加入40-60ml的珍珠岩，然后加入25-35ml液体生根培养基，所述的液体生根培养基成分及配比如下：1/2B5基本培养基+萘乙酸或吲哚丁酸0.1-1.0mg/L+蔗糖10g/L，调pH至4-7，在121℃下高压蒸汽灭菌20min，备用；
B：在无菌环境下，将苗高为1-2cm具有2片以上叶片的八仙花‘雪球’品种(Hydrangea.macrophylla‘Kuhnert’)组培苗的顶芽接种于A步骤制备的生根培养基中，在培养室培养30-50天；
C：从珍珠岩中取出八仙花组培苗，勿需清洗和炼苗，直接将八仙花组培苗移栽到体积比为1∶1的泥炭土：珍珠岩的基质中；
其中
上述步骤A和B的培养条件是：光照为1500-2000lx，光照时间16h.d-1，培养温度为23-25℃；
上述步骤C的移栽条件是：遮荫为80％，保持相对湿度为95％，栽培温度为25℃；
上述步骤A的1/2 B5基本培养基成分按mg/L计的配比如下：
硝酸钾 1250.0；
二水氯化钙 75.0；
七水硫酸镁 125.0；
硫酸氨 67.0；
磷酸二氢钠 75.0；
碘化钾 0.375；
硼酸 1.5；
四水硫酸锰 5.0；
七水硫酸锌 1.0；
二水铝酸钠 0.125；
五水硫酸铜 0.0125；
六水氯化钴 0.0125；
七水硫酸亚铁 13.9；
乙二胺四乙酸二钠 18.7；
肌醇 50.0；
烟酸 0.5；
盐酸吡哆醇 0.5；
盐酸硫胺素 5.0。，
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