CN100361570C - 一种鲜切花百合的高效离体繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及鲜切花百合的高效离体繁殖方法——两步外植体法，将优质的东方杂交百合和麝香百合，于4℃暗藏使其脱春化，选择中等大小(50克)的鳞茎为初始外植体，通过直接分化的途径扩繁出芽。以该芽丛为次级外植体，进行增殖及壮苗培养、催根培养、试管苗驯化及移栽等步骤。不仅解决了以鳞茎直接作为种球存在的繁殖系数低且易发生种球退化问题，而且解决了以鳞茎为唯一外植体进行组织培养存在的污染率高、增殖率低、繁殖速度慢和移栽成活率低的关键问题，为鲜切花百合的生产提供培育优质种苗的技术途径，同时亦为鲜切花百合的大规模生产开发起到积极的推动作用，这具有十分重要的社会和经济效益。

Description

一种鲜切花百合的高效离体繁殖方法

[技术领域]

本发明涉及鲜切花百合鳞片、叶、短缩茎离体快速繁殖优良种苗的方法。

[背景技术]

百合(Lilium spp.)是多年生球根花卉，花朵硕大，色彩丰富，花姿优美，既能作切花、盆花，又能在园林绿地中应用。随着百合在国内外鲜切花市场中的走俏，百合花生产和消费逐年增加，百合切花在荷兰的排名已上升为第五位，取得球根花卉之王的称号(陆美莲，许新萍，生物技术在百合上的应用，仲恺农业技术学院学报，15(4)：69～76，2002)。百合花不仅具有观赏价值还具有祛咳生津、补脾益气、清心安神的药用价值，民间常用于做“百合稀粥”、“百合莲子羹”，其味鲜美可口(阮少宁，杨华，梁一池，刘荣忠，香水百合组织培养的试验研究，福建林学院学报2001，21(2)：142～145)。中国是百合属植物的自然分布中心，全世界百合属植物约有94个种，起源于我国的有47个种、18个变种，占世界百合属植物的一半，其中36个种、15个变种为我国特有种。我国百合不仅种类多，而且生态习性各异，分布广泛。但目前我国的百合育种工作十分落后，现有的百合种质资源不仅没有得到充分利用，而且破坏、流失现象十分严重，与百合故乡的地位很不相称(张云，原雅玲，刘青林，百合的品种改良与生物技术研究进展，北京林业大学学报，23(6)：56-59，2001)。由于观赏百合商品种球繁殖率低，病毒侵染退化，造成种球生产难于满足切花生产需要。近几年，我国百合切花生产的种球主要靠进口，价格昂贵。

自Robb离体培养百合鳞茎成功以来，生物技术在百合上的应用已取得显著的进展(赵祥云，王树栋，陈新露，等.百合[M].北京：中国农业出版社，1999)。国内外许多科学家以百合不同品种的鳞片、叶、茎、花药、花丝、花被、花托等器官为外植体进行了扩繁研究，众多研究结果表明：百合鳞片是最佳的扩繁外植体(Takayama and Misawa，1980；Takayama and Misawa，1983；Niimi，1986；Gerrits and De Klerk，1992；Priyadarshi and Sen，1992；Wickremesinhe et al.，1994 and Tanimoto and Matsubara，1995；Watad A.A.etal.，1998；Long et al.，2004；Zhang et al.，2004)。目前主要采用鳞茎组织培养技术进行百合脱毒和扩繁，促进了百合商品种球的生产。(谢航，白伟，刘云，刘巍，百合组织培养及快繁技术，农业与技术，18(5)：33-34，1998)。

但百合组织培养中也存在以下问题：(1)商业化生产中的不利因素。迄今为止，百合的生产种植仍以传统的种球繁殖方式或以分植小鳞茎法繁殖，这样不仅繁殖系数低，而且病害侵染严重，因此有人采用鳞片叶直接种植的方式进行繁殖，这样虽然理论上能提高繁殖系数，但实际上单鳞片在土中很容易滋生病虫害并引起腐烂而亡。传统杂交育种方法常存在受精前后障碍，影响育种效率，利用柱头切割技术和胚胎拯救技术可克服百合受精前后障碍，但由于其技术难度过大、育种年限长而无法大规模推广应用。因此，需要通过组织培养进行无性系的快速繁殖。(2)污染严重。由于百合鳞茎裸露无皮，直接从田间采回的百合鳞茎，经消毒后污染率高达85％以上，因此大多数的百合快繁均以失败告终。污染问题成了百合快繁中的一大障碍。(3)繁殖系数低。国内百合的组织培养快速繁殖研究虽然早已受到重视，例如早有黄敏玲、井忠平、马惠等关于百合组织培养的报道(黄敏玲，陈杨春.库克点百合的组织培养[J].植物生理学通讯，1988(5)：49；井忠平，李惠芝，潘景丽.麝香百合叶片培养[J].植物杂志，1989(5)：8；马惠，郭扶兴.百合叶片愈伤组织的诱导和植株再生[J].植物生理学通讯，1992，28(4)：284.)，但这些研究都未涉及到提高百合繁殖系数的问题。此后虽有人研究该问题，但系数都很低。例如黄惠英研究东方百合的离体培养，繁殖系数为4.95；王凤兰等以鳞茎为外植体研究亚洲百合的快繁技术，繁殖系数仅为4.4；张君等研究麝香百合的离体培养，繁殖系数仅为2.0；阮少宁等研究香水百合的繁殖系数为6.8；杭玲等研究龙牙百合的离体快速繁殖，用鳞片连续培养8-10次时，繁殖系数才达到512-1000。(4)繁殖时间过长。Han et al.认为东方杂交百合和麝香百合从鳞茎到新植株开花需18个月以上(Han BH，Yae BW，Yu H J and Peak K Y.Improvement of in vitro micropropagation of Lilium oriental hybrid‘Casablanca’by theformation of shoots with abnormally swollen basal plates.Scientia Horticulture，30 January2005，Volume 103，Issue 3，351-359；Han BH，Yu H J，Yae B W and Peak K Y.In vitromicropropagation of Lilium longifiorum‘Georgia’by shoot formation as influenced by additionofliquid medium.Scientia Horticulture，2004，Volume 103，Issue 1，39-49)。这期间主要是成熟苗在移栽前的低温处理时间过长，并且由于低温处理，很容易导致采后叶片枯黄变褐、花蕾败育、少花且开花期缩短等一系列不良现象。为了解决这一问题，国外的Ranwala A.P和Miller W.B采用在低温处理的培养基中加GA₄₊₇和BA的措施，(Ranwala A.P and Miller W.B，2005.Effects of cold storage onpostharvest leaf and flower quality of potted Oriental-Asiatia-and LA-hybrid Lily cultivars.Scientia Horticulture.)虽然能缓解以上症状，但对整个生长期的缩短没有多大的影响。国内阮少宁等采用在香水百合小鳞茎复壮培养基中添加一定量的BA和GA，可打破休眠，使开花期提前，但没有具体生长期的统计资料。(5)组培苗的移栽成活率低。组培苗移栽是营养由异养型向自养型的转变，因此对外界环境条件非常敏感。国内众多的科研工作者以沙砂、蛭石、泥炭、园土、椰糠等材料为基质进行不同的配比来对组培苗进行驯化栽培，但成活率还是不够理想。

综上所述，百合快繁尽管在国内外做了许多工作，但都不系统，而且还存在许多技术难题亟待解决。因此系统地研究鲜切花百合组培快繁既可保持优良品种(花色、花形美丽，花香浓郁，株型别致，抗逆性强，瓶插寿命长)的遗传稳定性，为其种质的保存提供了一条有效途径，也方便了国际间种质交流；同时以麝香百合和东方百合的鳞片为初始外植体，寻找其最适宜的培养基配方，探索提高繁殖系数的方法，为麝香百合和东方百合组培苗进入工厂化生产提供依据，这对鲜切花百合的商业化生产具有重要的推动作用，具有重要的经济和社会效益。

[发明内容]

为了解决现有技术中存在的实际且迫切需要解决的问题，本发明的目的是提供一种两步外植体法直接快速扩繁优质鲜切花百合的组织培养方法。

本发明技术方案：一种鲜切花百合的高效离体繁殖方法，包括两步外植体法，外植体的预处理、消毒、培养、组培苗的驯化及移栽等步骤：

两步外植体法：以优质的鳞茎为初始外植体，以从优质鳞茎上长出的芽为次级外植体。

外植体的预处理：取优质的百合鳞茎于4℃暗藏40-60天使其脱春化；

消毒：流线型自来水冲洗12小时，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不断搅动处理15分钟。

培养：培养阶段包括初始外植体诱导出芽、次级外植体增殖及壮苗培养、催根培养、试管苗驯化及移栽等步骤。

初始外植体诱芽培养：将初始外植体即鳞片叶切割成1cm见方的小块，每片视其大小切割成3-5小块，接种于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培养16小时，强度为15001x，连续培养时间30-50天，产生从生芽；

次级外植体增殖及壮苗培养：从初始外植体上诱导的从生芽为次级外植体，将其叶、小鳞茎和短缩茎分别切割成2mm(宽)×10mm(长)、4-5mm(宽)×7-8mm(长)和8-10mm(直径)×2mm(高)的小段，每个芽可以切割成15-18小片。然后接种于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培养16小时，强度为15001x，连续培养40天产生从生芽。

催根培养：经壮苗培养后，繁殖芽接种于1/2MS+IBA0.25mg/L+GA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.8，22-24℃，每日光照培养12小时，强度为15001x。连续培养30天则诱导出较高质量的根系，成为生根苗。

试管苗驯化及移栽：生根苗经2-3天的自然光炼苗后，移栽于灭菌的基质(砂∶园土∶椰糠＝1∶1∶1)中，20-22℃，每日光照培养12小时，强度为15001x，20天后，移栽入大田。

结果分析：

1、外植体消毒的成功率：经过预处理的外植体，用流线型自来水冲洗12小时，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不断搅动处理15分钟，其成功率达50％以上，这说明这种消毒处理对百合鳞茎表面泥砂、细菌及其真菌孢子去除均有一定的作用，采用这一消毒技术获得的良好效果是已见报道的技术方法所不能达到的。

2、高繁殖系数：采用两步外植体法是提高繁殖系数的最好方法。一个中等大小(重50 mg)的百合鳞茎有10-15片鳞片叶，每片鳞片可以切成3-5个1cm见方的小块，每小块可以诱导30个不定芽，以此芽为次级外植体，每个芽可以分割成15-18个小片，平均每小片又能诱发4个生长健壮的不定芽，考虑到消毒处理时50％的成功率，因此一个中等大小的鳞茎通过两步外植体法1代就可以扩增出27,000个独立完整的带小鳞茎的新植株，这一结果是国内外已见报导的技术方法所不能达到的(表1、2)。

3、高繁殖速度：以经过预处理的百合鳞茎为初始外植体，在50天甚至更早就可以诱导出次级外植体，次级外植体在同样的培养基上40天就可以诱导出丛生芽。将芽切下置于生根培养基中只需30天即可诱导生根，生根苗不需经过低温处理直接移栽于灭菌的基质中，20天后移入大田正规生长，4个月后即可开花，因此从鳞茎到新植株开花只需8个月左右，这么快的繁殖速度是国内外都未见报导的。

4、高移栽成活率：正常化生长的小苗在移入大田前进行20天左右的驯化培养是必需的。根据本实验室对不同培养基质的配比试验，又考虑到大规模生产的成本，发现在砂∶园土∶椰糠＝1∶1∶1的基质中生长的小苗成活率高达99％，这也是国内外现有技术所不能达到的。

本研究已对麝香百合和东方杂交百合的鳞茎预处理、消毒、初始外植体的诱芽培养、次级外植体的诱芽培养，催根及驯化移栽等环节作了系统的研究，找到了一条适合鲜切花百合快繁的可行途径，若投入一定的人力、物力，以此技术体系为依托进行鲜切花种苗的商业化生产是可行的，此项技术的突破大大改进了国内在鲜切花百合快繁技术上的不足；通过本技术体系目前已获得了麝香百合、东方杂交百合两个无性系，并已移栽至大田进行示范种植，示范面积为1亩。

[具体实施方式]

下面结合实施方式对本发明进行详细说明：

1、材料来源：以从云南引进的优质东方杂交百合鳞茎和中国热带农业科学院园艺所提供的麝香百合鳞茎作为初始外植体。

2、方法：

(1)材料预处理及消毒处理①取优质的百合鳞茎于4℃暗藏40天使其脱春化；②外植体经预处理后用流线型自来水冲洗12小时，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不断搅动处理15分钟。

(2)初始外植体诱芽培养：将初始外植体即鳞片叶切割成1cm见方的小块，每片视其大小切割成4小块，接种于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8，24℃，每日光照培养16小时，强度为15001x，连续培养时间50天，产生从生芽；

(3)次级外植体增殖及壮苗培养：从初始外植体上诱导的从生芽为次级外植体，将其叶、小鳞茎和短缩茎分别切割成2mm(宽)×10mm(长)、4mm(宽)×7mm(长)和8mm(直径)×2mm(高)的小段，每个芽可以切割成15小片。然后接种于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.8，24℃，每日光照培养16小时，强度为15001x，连续培养40天产生从生芽。

(4)催根培养：经壮苗培养后，繁殖芽接种于1/2MS+IBA0.25mg/L+GA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.8，22℃，每日光照培养12小时，强度为15001x。连续培养30天则诱导出较高质量的根系，成为生根苗。

(5)试管苗驯化及移栽：生根苗经2天的自然光炼苗后，移栽于灭菌的基质(砂∶园土∶椰糠＝1∶1∶1)中，20℃，每日光照培养12小时，强度为15001x，20天后，移栽入大田正规生长，4个月后开花。

表1.培养50天后不同的BA浓度对百合鳞片诱芽的影响

BA浓度(mg/L)	芽数/每块鳞片	芽鲜重(mg)/每块鳞片
			0.51.01.21.51.82.0	4.50030.02524.02524.42523.6007.765	400.0006000.0004800.2504856.7504772.5001126.000

表2不同的次级外植体类型在MS加1.0mg/L BA和0.1mg/L NAA培养基上培养40天后不同的出芽效果

次级外植体类型	芽数/片	芽鲜重/片
			叶小鳞茎短缩茎	0.752.958.675	106.25427.51783.75

Claims (5)

1.一种鲜切花百合的离体繁殖方法，即两步外植体法，包括外植体的预处理、消毒、培养步骤，其特征在于：

外植体的预处理：取优质的百合鳞茎于4℃暗藏使其脱春化；

消毒：用流线型自来水冲洗过夜，先后用70％酒精、0.15％升汞消毒；

培养：

初始外植体诱导出芽：将初始外植体接种于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8；培养条件为22-26℃，每日光照培养16小时，强度为1500lx；所述初始外植体为优质的百合鳞茎上的鳞片切块；

次级外植体增殖及壮苗培养：从初始外植体上诱导的芽为次级外植体，接种于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH＝5.8；培养条件为22-26℃，每日光照培养16小时，强度为1500lx；次级外植体经继代培养后，接种于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.8；培养条件为22-26℃，每日光照培养16小时，强度为2000lx；

催根培养：繁殖芽经壮苗培养后，接种于1/2MS+IBA0.25mg/L+GA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH＝5.8；培养条件为22-24℃，每日光照培养12小时，强度为1500lx；

试管苗驯化及移栽：生根苗经2-3天的自然光炼苗后，移栽于灭菌的基质中，培养条件为20-22℃，每日光照培养12小时，强度为1500lx，20天后，移栽入大田；所述的基质为砂∶园土∶椰糠＝1∶1∶1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在预处理时4℃暗藏天数为40-60天。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，初始外植体经预处理后用流线型自来水冲洗12小时，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不断搅动处理15分钟。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将初始外植体切割成1cm见方的小块，每片视其大小切割成3-5小块。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将次级外植体叶、小鳞茎和短缩茎分别切割成宽长为2mm×10mm、宽长为4-5mm×7-8mm和直径、高度为8-10mm×2mm的小段，每个长4cm的芽可以切割成15-18小片。