CN102919124A - 一种龙竹组培苗工业化生产快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种龙竹组培苗工业化生产快繁方法，以龙竹当年生枝条为外殖体，消毒后先用芽诱导培养基进行诱导培养得到侧芽，将其切下用增殖培养基进行增殖培养得到大量无性系植株，并进行壮苗培养，再将植株转接到生根培养基上进行生根培养，最后得到完整的龙竹无性系植株。然后用组合基质进行龙竹试管苗大棚练苗，最后将成活的竹苗进行大田实地栽培。本发明运用独特的试验方法和改良的培养基，克服了龙竹组培过程中消毒、增殖、生根困难以及试管苗遗传稳定性差的难题，使植物组织培养技术在大型丛生竹试管苗工业化生产领域得到更为广泛的运用，并且取得了技术性的进展，为竹类资源的开发利用提供了良好的基础技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及到龙竹(Dendrocalamus giganteus)组织培养的方法，特别是运用新生枝条作为外植体来诱导丛生芽，之后增殖培养和生根培养的龙竹组培苗工业化生产快繁方法。
背景技术
竹类的组织培养研究起始于1968年Alex-ander和Rao关于竹子合体胚的立体培养。从1982年Mehatas等首次报道印度莿竹(Bambus arundinacea)通过胚性愈伤组织获得再生植株开始，到2006年辉朝茂等报道通过胚性愈伤组织获得珍惜竹种巨龙竹(Dendrocalamus sinicus)的再生植株为止，已有数十种竹类可以通过组织培养获短时间得完整试管苗植株。但是，竹类的组织培养技术由于所涉及的诱导芽、增殖培养和生根几个环节相比其他禾本科植物较困难，并且因竹种的不同而差异性较大，这使得竹类的组织培养技术还没有广泛的运用于实际生产。
龙竹(Dendrocalamus giganteus)，又称苦龙竹、大竹，为大型丛生竹，竿高约20-30m，径粗20-30cm。是云南省适应栽培区域最广，用途最多，经济价值最高的竹种之一。基于龙竹在云南省的广泛栽培与应用，与其它竹种相比，人们对其进行了更为详细、全面的研究，特别是对竹材性能和组织结构特性方面的深入了解为利用龙竹资源优势，弥补其存在的缺点提供了丰富的资料。竹类植物由于生长繁殖快、再生能力强、成材时间短而具有优于其它林木的天然优势，也正因如此，在长久的栽培过程中，诸如龙竹等经济竹种的苗木培育和丰产经营技术得到了较快的发展和推广。传统的龙竹育苗方式主要有埋节、竹苗分株与枝条扦插等，但远远达不到工业化生产规模的要求。伴随着组织培养技术的不断成熟，参考相关竹类资源组织培养的成功经验，总结龙竹组织培养中存在的问题，在龙竹组织培养上的突破是实现龙竹的工业化大规模生产，推进其进一步开发利用的有效途径。
发明内容
针对龙竹工业化组织培养面临的外殖体灭菌消毒极其困难，诱导丛生芽成功率低，增殖培养不稳定，生根困难等一系列难题，本发明要解决以下几方面难题，使得龙竹组培苗工业化生产能够顺利进行。
1) 外殖体灭菌消毒：根据不同生长状况的龙竹外殖体，配制相应的消毒液，采用发明的材料预处理方法，运用改进的消毒操作流程，使得外殖体消毒更为彻底，在很大程度上降低了污染率。
2) 丛生芽诱导：采用发明的腋芽预处理方法和改进的芽诱导培养基，将有效的提高丛生芽诱导成功率。
3) 增殖培养：鉴于龙竹的组织培养与其他竹种存在差异，设计出独特的最为合理的龙竹增殖培养基，使其丛生苗增殖效果好且保持良好的遗传性状。
4) 诱导生根：同样因为龙竹的组织培养与其他竹种存在差异，需要设计出独特的最为合理的龙竹生根培养基，使得增殖苗能够生根，并使生根率和生根效率达到最佳效果。
5) 练苗和大田栽培：根据龙竹组培苗的实际生长壮况，配制合理的练苗基质，采用适当的培养条件进行练苗培养，提高练苗的成活率。然后将成活的龙竹组培苗进行大田移栽，并进行实地栽培维护，保证成活和生长。
本发明通过如下技术方案实现：
一种龙竹组培苗工业化生产快繁方法，步骤如下：
（1）外殖体的采集和前期处理：采集生长状况良好健康无病虫害的一年生龙竹枝条，进行修剪去除次生枝叶，放置在4～8℃冰箱保存1～2天；然后按每个竹节一段将其削成小段，再削除竹节上的秆箨，并用纱布擦除枝秆表面的污垢，最后用无菌水洗净；
（2）将洗好的龙竹枝条段在无菌条件下进行三次消毒处理：首先用浓度75%的乙醇擦洗后用无菌水冲洗干净；然后将龙竹枝条段投放到消毒瓶中浓度0.1～1%的升汞水溶液中进行第二次消毒10～20min；再将龙竹枝条段投入浓度1.5～5%的次氯酸钠水溶液中进行第三次消毒；最后用无菌水冲洗3～5次；
（3）腋芽的诱导：将经过消毒的龙竹枝条段插入芽诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为25℃，先暗培养3～5天，然后再进行光照培养，光照强度为1000～1200Lx；所述的诱导培养基为1/2MS，其中含有6-BA 5.0～10.0mg/L、2，4-D 2.0～5.0mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（4）丛生芽诱导培养：将龙竹枝条段在诱导培养阶段诱导出来的侧芽切割下，接种到丛生芽诱导培养基中进行光照培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养20～25天，从而诱导培养出大量的丛生芽；所述的丛生芽诱导培养基为3/4MS，其中含有6-BA 2.5～5.5mg/L、KT1.0～2.0mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（5）继代增殖培养：上一步骤丛生芽诱导培养所形成的丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于增殖培养基上进行继代增殖培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养20～25天；使得龙竹丛生芽既有整体数量的增加，也有个体生物量的增长；继代增殖培养基为MS，其中6-BA 2.0～4.0mg/L、KT0.5～1.5mg/L、 NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（6）壮苗增殖培养：将继代增殖培养的丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于壮苗增殖培养基上进行壮苗培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养10～15天，使得继代增殖培养出的丛生苗长得更加茁壮；壮苗增殖培养基为MS，其中6-BA 0.5～1.5.0mg/L、KT1.0～1.5mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（7）诱导生根培养：把壮苗增殖培养的丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于诱导生根培养基上进行生根培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养15～20天生根率为90%，培养25～35天生根率为95%，所述的诱导生根培养基为1/2MS，其中含有6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 1.5～5.0mg/L、IAA 1.5～3.0 mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（8）练苗和大田栽培：把生根苗放置到室温下3～5天，洗净培养基，然后用1000倍稀释的多菌灵水溶液浸泡5～10min，再移栽到按质量比例为30%腐殖土、20%河沙和50%泥土的基质中，用遮光度为50～70%的遮阴网控光以保持土壤湿润，温度控制在23～28℃，待小竹苗长至15～20cm高时，移到苗圃中进行大田实地栽培。
作为本发明的优选方案：
步骤（2）中进行第二次消毒及第三次消毒过程中要不断摇晃消毒瓶，使消毒液能够很好的分散杀菌。
本发明以龙竹当年生枝条为外殖体，消毒后先用芽诱导培养基进行诱导培养得到无菌侧芽，将其切下用增殖培养基进行增殖培养得到大量无性系植株，并进行壮苗培养，再将植株转接到生根培养基上进行生根培养，最后得到完整的龙竹无性系植株。然后用组合基质进行龙竹试管苗大棚练苗，最后将成活的苗进行大田实地栽培。此发明运用独特的试验方法和改良的培养基，克服了龙竹组培过程中消毒、增殖、生根困难以及试管苗遗传稳定性差的难题，使植物组织培养技术在大型丛生竹试管苗工业化生产领域得到更为广泛的运用，并且取得了技术性的进展，为竹类资源的开发利用提供了良好的基础技术支撑。
具体实施方式
实施例1
（1）外殖体的采集和前期处理：采集生长状况良好健康无病虫害的一年生龙竹枝条，进行修剪去除次生枝叶，放置在4～8℃冰箱保存1～2天；然后按每个竹节一段将其削成小段，再削除竹节上的秆箨，并用纱布擦除枝秆表面的污垢，最后用无菌水洗净；
（2）将洗好的龙竹枝条段在无菌条件下进行三次消毒处理：首先用浓度75%的乙醇擦洗后用无菌水冲洗干净；然后将龙竹枝条段投放到消毒瓶中浓度0.1～1%的升汞水溶液中进行第二次消毒10～20min，在此过程中要不断摇晃消毒瓶，使得消毒液能够很好的分散杀菌。再将龙竹枝条段投入浓度1.5～5%的次氯酸钠水溶液中进行第三次消毒，同样要摇晃瓶子；最后用无菌水冲洗3～5次。
（3）腋芽的诱导：将经过消毒的龙竹枝条段插入芽诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为25℃，先暗培养3～5天，然后再进行光照培养，光照强度为1000～1200Lx；所述的诱导培养基为1/2MS，其中含有6-BA 5.0～10.0mg/L、2，4-D 2.0～5.0mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（4）丛生芽诱导培养：将龙竹枝条段在诱导培养阶段诱导出来的侧芽切割下，接种到丛生芽诱导培养基中进行光照培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养20～25天，从而诱导培养出大量的丛生芽；所述的丛生芽诱导培养基为3/4MS，其中含有6-BA 2.5～5.5mg/L、KT1.0～2.0mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（5）继代增殖培养：按照实际需求，所形成的丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于增殖培养基上进行继代增殖培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养20～25天；使得龙竹丛生芽既有整体数量的增加，也有个体生物量的增长；继代增殖培养基为MS，其中6-BA 2.0～4.0mg/L、KT0.5～1.5mg/L、 NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（6）壮苗增殖培养：将继代增殖培养的丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于壮苗增殖培养基上进行壮苗培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养10～15天，使得继代增殖培养出的丛生苗长得更加茁壮；壮苗增殖培养基为MS，其中6-BA 0.5～1.5.0mg/L、KT1.0～1.5mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（7）诱导生根培养：把壮苗增殖培养的丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于诱导生根培养基上进行生根培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养15～20天生根率为90%，所述的诱导生根培养基为1/2MS，其中含有6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 1.5～5.0mg/L、IAA 1.5～3.0 mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（8）练苗和大田栽培：把生根苗放置到室温下3～5天，洗净培养基，然后用1000倍稀释的多菌灵水溶液浸泡5～10min，再移栽到按质量比例为30%腐殖土、20%河沙和50%泥土的基质中，用遮光度为50～70%的遮阴网控光以保持土壤湿润，温度控制在23～28℃，待小竹苗长至15～20cm高时，移到苗圃中进行大田实地栽培。
实施例2
（1）外殖体的采集和前期处理：采集生长状况良好健康无病虫害的一年生龙竹枝条，进行修剪去除次生枝叶，放置在4～8℃冰箱保存1～2天；然后按每个竹节一段将其削成小段，再削除竹节上的秆箨，并用纱布擦除枝秆表面的污垢，最后用无菌水洗净；
（2）将洗好的龙竹枝条段在无菌条件下进行三次消毒处理：首先用浓度75%的乙醇擦洗后用无菌水冲洗干净；然后将龙竹枝条段投放到消毒瓶中浓度0.1～1%的升汞水溶液中进行第二次消毒10～20min，在此过程中要不断摇晃消毒瓶，使得消毒液能够很好的分散杀菌。再将龙竹枝条段投入浓度1.5～5%的次氯酸钠水溶液中进行第三次消毒，同样要摇晃瓶子；最后用无菌水冲洗3～5次。
（3）腋芽的诱导：将经过消毒的龙竹枝条段插入芽诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为25℃，先暗培养3～5天，然后再进行光照培养，光照强度为1000～1200Lx；所述的诱导培养基为1/2MS，其中含有6-BA 5.0～10.0mg/L、2，4-D 2.0～5.0mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（4）丛生芽诱导培养：将龙竹枝条段在诱导培养阶段诱导出来的侧芽切割下，接种到丛生芽诱导培养基中进行光照培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养20～25天，从而诱导培养出大量的丛生芽；所述的丛生芽诱导培养基为3/4MS，其中含有6-BA 2.5～5.5mg/L、KT1.0～2.0mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（5）诱导生根培养：把丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于诱导生根培养基上进行生根培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养25～35天，生根率为95%，所述的诱导生根培养基为1/2MS，其中含有6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 1.5～5.0mg/L、IAA 1.5～3.0 mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（6）练苗和大田栽培：把生根苗放置到室温下3～5天，洗净培养基，然后用1000倍稀释的多菌灵水溶液浸泡5～10min，再移栽到按质量比例为30%腐殖土、20%河沙和50%泥土的基质中，用遮光度为50～70%的遮阴网控光以保持土壤湿润，温度控制在23～28℃，待小竹苗长至15～20cm高时，移到苗圃中进行大田实地栽培。
Claims (2)
1.一种龙竹组培苗工业化生产快繁方法，其特征在于步骤如下：
（1）外殖体的采集和前期处理：采集生长状况良好健康无病虫害的一年生龙竹枝条，进行修剪去除次生枝叶，放置在4～8℃冰箱保存1～2天；然后按每个竹节一段将其削成小段，再削除竹节上的秆箨，并用纱布擦除枝秆表面的污垢，最后用无菌水洗净；
（2）将洗好的龙竹枝条段在无菌条件下进行三次消毒处理：首先用浓度75%的乙醇擦洗后用无菌水冲洗干净；然后将龙竹枝条段投放到消毒瓶中浓度0.1～1%的升汞水溶液中进行第二次消毒10～20min；再将龙竹枝条段投入浓度1.5～5%的次氯酸钠水溶液中进行第三次消毒；最后用无菌水冲洗3～5次；
（3）腋芽的诱导：将经过消毒的龙竹枝条段插入芽诱导培养基中进行诱导培养，培养温度为25℃，先暗培养3～5天，然后再进行光照培养，光照强度为1000～1200Lx；所述的诱导培养基为1/2MS，其中含有6-BA 5.0～10.0mg/L、2，4-D 2.0～5.0mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（4）丛生芽诱导培养：将龙竹枝条段在诱导培养阶段诱导出来的侧芽切割下，接种到丛生芽诱导培养基中进行光照培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养20～25天，从而诱导培养出大量的丛生芽；所述的丛生芽诱导培养基为3/4MS，其中含有6-BA 2.5～5.5mg/L、KT1.0～2.0mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（5）继代增殖培养：上一步骤丛生芽诱导培养所形成的丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于增殖培养基上进行继代增殖培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养20～25天；使得龙竹丛生芽既有整体数量的增加，也有个体生物量的增长；继代增殖培养基为MS，其中6-BA 2.0～4.0mg/L、KT0.5～1.5mg/L、 NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（6）壮苗增殖培养：将继代增殖培养的丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于壮苗增殖培养基上进行壮苗培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养10～15天，使得继代增殖培养出的丛生苗长得更加茁壮；壮苗增殖培养基为MS，其中6-BA 0.5～1.5.0mg/L、KT1.0～1.5mg/L、NAA 0.5～1.5mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（7）诱导生根培养：把壮苗增殖培养的丛生芽切割分成带2～3个小芽的小芽丛接种于诱导生根培养基上进行生根培养，光照强度为1000～1200Lx，25℃条件下培养15～20天生根率为90%，培养25～35天生根率为95%，所述的诱导生根培养基为1/2MS，其中含有6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 1.5～5.0mg/L、IAA 1.5～3.0 mg/L、蔗糖10～20mg/L和琼脂3.5～5.0g/L；
（8）练苗和大田栽培：把生根苗放置到室温下3～5天，洗净培养基，然后用1000倍稀释的多菌灵水溶液浸泡5～10min，再移栽到按质量比例为30%腐殖土、20%河沙和50%泥土的基质中，用遮光度为50～70%的遮阴网控光以保持土壤湿润，温度控制在23～28℃，待小竹苗长至15～20cm高时，移到苗圃中进行大田实地栽培。
2.根据权利要求1所述的龙竹组培苗工业化生产快繁方法，其特征在于，步骤（2）中进行第二次消毒及第三次消毒过程中要不断摇晃消毒瓶，使消毒液能够很好的分散杀菌。
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