CN103109747B

CN103109747B - 一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法

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Publication number: CN103109747B
Application number: CN201310074452.XA
Authority: CN
Inventors: 朱俊义; 顾地周; 顾川岳; 姜云天; 杨丽娟; 梁宇
Original assignee: Tonghua Normal University
Current assignee: Tonghua Normal University
Priority date: 2013-03-10
Filing date: 2013-03-10
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2033-03-10
Also published as: CN103109747A

Abstract

本发明涉及一种植物繁殖技术，即一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法。其步骤如下：（1）取金钱松苗主干上的新发嫩茎茎段作为外植体；（2）接种到基本培养基＋吲哚乙酸0.02～0.04mg·L^-1＋萘乙酸0.03～0.06mg·L^-1＋6-苄氨基嘌呤0.10～0.12mg·L^-1＋赤霉素2.70～2.80mg·L^-1中进行金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长培养；（3）金钱松植株的快速繁殖、炼苗和移栽。采用金钱松野生实生苗主干上的嫩茎尖为材料，在试管内诱导茎段生根同时腋芽萌发生长，以达到茎节增殖的一步快繁目标，为人工规模化繁殖和栽培金钱松提供优质种苗。成苗率达96.6%；成活率可达到93.8%以上。

Description

一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法

技术领域　

本发明涉及一种植物繁殖技术，即一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法。

背景技术

在现有技术中，金钱松Pseudolarix amabilis (Nelson) Rehd.为松科金钱松属落叶乔木。金钱松是我国珍贵的特产树种，与南洋杉、雪松、金松和北美红杉合称为世界五大公园树种，也是全世界唯一的一种。本种分布于江苏南部、安徽南部、浙江西部、江西北部、福建北部、四川东部、湖南和湖北等地。多生长于低海拔山区或丘陵地带，适宜温凉湿润气候。金钱松是著名的古老残遗植物，被《中国珍稀濒危保护植物名录（第一册）》定为稀有种，国家二级重点保护植物。被《国家重点保护野生植物名录（第一批）》定为国家二级重点保护植物。最早的化石发现于西伯利亚东部与西部的晚白垩世地层中，古新世至上新世在斯匹次卑尔根群岛、欧洲、亚洲中部、美国西部、中国东北部及日本亦有发现。由于气候的变迁，尤其是更新世的大冰期的来临，使各地的金钱松灭绝。只在我国长江中下游少数地区幸存下来，繁衍至今。因分布零星，个体稀少，结实有明显的间歇性，种子萌发率极低。

金钱松木材可供建筑、桥梁、船舶和家具等用；种子可榨油；根皮药用，含二萜类、二萜葡萄糖甙、酚类、鞣质及色素等重要化学成分，具有抗菌消炎、止血等功效，可治顽癣、食积和抑制肝癌细胞活性等症；林业部门已把金钱松列为分布区中山、丘陵的重要造林及园林绿化树种，许多城市和植物园已引种栽培。

金钱松通常以种子或插条扦插繁殖为主，但其种子萌发极低；插条扦插繁殖不仅生根率和移栽成活率极低，而且导致野生资源受到灭绝性威胁。因此，大规模人工栽培、开发和利用受到极大限制。

发明内容

本发明的目的是针对上述不足而提供一种在试管内诱导茎段生根同时腋芽萌发生长，以达到茎节增殖的一步快繁目标，解决了种子繁殖困难和扦插繁殖生根率和移栽成活率低及野生资源受灭绝性威胁等问题的基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法。

本发明的技术解决方案是：一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其步骤如下：

（1）取金钱松苗主干上的新发嫩茎处理后茎段作为外植体备用；

（2）接种到基本培养基＋吲哚乙酸0.02～0.04 mg·L^-1＋萘乙酸0.03～0.06 mg·L^-1＋6-苄氨基嘌呤0.10～0.12 mg·L^-1＋赤霉素2.70～2.80 mg·L^-1中进行金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长培养；基本培养基成分和含量为：110.0 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，660.0 mg·L^-1KNO₃，38.0 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，42.0 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，85.0 mg·L^-1KH₂PO₄；2.7 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，2.4 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.35 mg·L^-1KI，1.2 mg·L^-1H₃BO₃；4.6 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.3 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；0.8 mg·L^-1盐酸硫胺素(VB₁)，0.3 mg·L^-1烟酸，0.3 mg·L^-1盐酸吡哆醇(VB₆)，1.50 mg·L^-1甘氨酸，15.0 g·L^-1肌醇。优选基本培养基＋吲哚乙酸0.04 mg·L^-1＋萘乙酸0.03 mg·L^-1＋6-苄氨基嘌呤0.12 mg·L^-1＋赤霉素2.80 mg·L^-1。

（3）金钱松植株的快速繁殖、炼苗和移栽。

步骤（1）中的处理是指摘去针叶及短小叶柄，用70%乙醇涮洗60 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成1.0 cm的茎段。

步骤（3）中的快速繁殖是指按每瓶接种10个茎段，35天为1个周期，每个茎段在1个培养周期内平均可切割成4～5段，每年有多个周期进行扩繁，满足金钱松工厂化育苗和规模化栽培的需要。

步骤（3）中的炼苗和移栽是指当种苗扩繁到一定数量后，选取2.00 cm以上的小植株进行炼苗移栽，小植株成活率可达到93.8%以上。

本发明的优点是：1、本发明利用植物组织培养技术，采用金钱松野生实生苗主干上的嫩茎尖为材料，在试管内诱导茎段生根同时腋芽萌发生长，以达到茎节增殖的一步快繁目标，解决了种子繁殖困难和扦插繁殖生根率和移栽成活率低及野生资源受灭绝性威胁等问题。2、本发明为进一步人工规模化繁殖和栽培金钱松提供优质种苗。3、成苗率达96.6%；金钱松小植株的炼苗和移栽成活率可达到93.8%以上。

下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。

具体实施方式

一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法：

1 材料与方法

1.1 材料及处理

5月上旬，取金钱松2年生苗主干上的新发嫩茎（2.5～3.5 cm），摘去针叶及短小叶柄，用70%乙醇（体积分数）涮洗60 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成1.0 cm的茎段作为外植体备用。

1.2 金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长、植株快速和炼苗栽培

基本培养基成分和含量：110.0 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，660.0 mg·L^-1KNO₃，38.0 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，42.0 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，85.0 mg·L^-1KH₂PO₄；2.7 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，2.4 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.35 mg·L^-1KI，1.2 mg·L^-1H₃BO₃；4.6 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.3 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；0.8 mg·L^-1盐酸硫胺素(VB₁)，0.3 mg·L^-1烟酸，0.3 mg·L^-1盐酸吡哆醇(VB₆)，1.50 mg·L^-1甘氨酸，15.0 g·L^-1肌醇；基本培养基中附加吲哚乙酸IAA(0.07～0.12 mg·L^-1)、萘乙酸NAA(0.04～0.09 mg·L^-1)、6-苄氨基嘌呤6-BA(0.02～0.07 mg·L^-1)和赤霉素GA₃(1.50～2.60 mg·L^-1)，琼脂条8.5 g·L^-1，添加食用白糖10.0 g·L^-1，调节pH值至5.7，嫩茎段在光照周期7 h·d^-1、光照强度800 lx和温度(24±2) ℃条件下培养。为提高金钱松嫩茎段生根和腋芽萌发生长的速度及生根率，通过均匀设计法设计实验，选用U₁₂(12⁴)均匀表，每个处理接种10个嫩茎段，重复3次，筛选确定影响金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长的吲哚乙酸、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤和赤霉素最佳浓度配比。茎段培养35 d统计生根率和长度，以均出现茎段生根和腋芽萌发生长的苗为准。生根率=(生根的茎段数/接种的茎段总数)×100%，生长率=(苗总长度-1.0)/1.0×100%。

茎段生根后腋芽萌发生长至2.50 cm时，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留0.50剪下苗干，并将苗干切割成0.5 cm 的茎段，再次将小茎段转接到茎段生根同时腋芽萌发生长培养基中，计算出每个茎段生根同时腋芽萌发生长的增殖倍数和周期。

当种苗扩繁到需要数量后，且小植株长至2.00 cm时，将小植株从培养瓶中取出，放在杀毒矾溶液（浓度为5 mg·L^-1）中洗净根上的琼脂，将小植株栽植到经杀毒矾（200倍液）消毒过的腐熟草炭土、腐烂松针和珍珠岩 (3: 2: 1)的基质中，覆盖塑料薄膜（透性好）进行保温保湿，温度控制在(20±2) ℃，保持相对湿度在70%，自然光照10 h·d^-1，温度升高时，适当通风换气。

2 结果与分析

2.1 吲哚乙酸、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤和赤霉素对金钱松茎段生根的影响

数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=109－302X ₁－351X ₂＋416X ₃，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9894，剩余标准差S＝1.6800，检验值F _t＝123.4﹥临界值F _(0.05,3,8)＝4.066，回归方程具有显著性，吲哚乙酸、萘乙酸和6-苄氨基嘌呤对茎段的生根影响具有显著性，赤霉素对茎段的生根影响不显著。通过计算吲哚乙酸、萘乙酸和6-苄氨基嘌呤对生根的贡献值和贡献率可知，U ₁＝253，U ₁/U＝24.2%；U ₂＝341，U ₂/U＝32.6%；U ₃＝604，U ₃/U＝57.8%，说明3个因素对金钱松茎段生根的贡献顺序为：6-苄氨基嘌呤>萘乙酸>吲哚乙酸，因6-苄氨基嘌呤与生根率呈正相关，而吲哚乙酸和萘乙酸与生根率呈负相关。由此推测，6-苄氨基嘌呤质量浓度高于0.07 mg·L^-1，吲哚乙酸和萘乙酸质量浓度分别低于0.07 mg·L^-1和0.04 mg·L^-1可能有更高的生根率。为验证此推测，又以6-苄氨基嘌呤为0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14和0.15 mg·L^-1，吲哚乙酸质量浓度为0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01 mg·L^-1，萘乙酸质量浓度为0.04、0.03、0.02和0.01 mg·L^-1开展9个水平的补充试验，重复3次。结果发现，吲哚乙酸质量浓度为(0.02～0.05 mg·L^-1)、萘乙酸质量浓度为(0.03～0.06 mg·L^-1)和6-苄氨基嘌呤质量浓度为(0.09～0.12 mg·L^-1)时，金钱松嫩茎段生根率最高，平均生根率达99.7%以上。均高于表1所列12个处理的生根率。

表1 影响金钱松嫩茎段生根和腋芽生长因素的U₁₂(12⁴)试验设计与结果

2.2 吲哚乙酸、萘乙酸、6-苄氨基嘌呤和赤霉素对金钱松腋芽萌发生长的影响

数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=－198－252X ₁-＋2170X ₃＋96.9X ₄，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.8709，剩余标准差S＝5.4100，检验值F _t＝8.377﹥临界值F _(0.05,3,8)＝4.066，回归方程显著。吲哚乙酸、6-苄氨基嘌呤和赤霉素均对金钱松嫩茎段腋芽萌发生长的影响具有显著性，萘乙酸对茎段腋芽萌发生长影响不显著。同理，计算吲哚乙酸、6-苄氨基嘌呤和赤霉素对茎段腋芽萌发生长的贡献值和贡献率可知，U ₁＝220，U ₁/U＝30.0%；U ₃＝341，U ₃/U＝46.5%；U ₄＝279，U ₄/U＝38.0%，说明3个因素对金钱松茎段腋芽萌发生长的贡献顺序为：6-苄氨基嘌呤>赤霉素>吲哚乙酸，又因6-苄氨基嘌呤和赤霉素与茎段腋芽萌发生长呈正相关，而吲哚乙酸与茎段腋芽萌发生长呈负相关。推测吲哚乙酸的质量浓度分别低于0.07 mg·L^-1，6-苄氨基嘌呤和赤霉素的质量浓度分别高于0.07 mg·L^-1和2.60 mg·L^-1时，茎段腋芽萌发生长率可能更高。为验证此可能性，又以吲哚乙酸质量浓度为0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02和0.01 mg·L^-1，6-苄氨基嘌呤为0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14和0.15 mg·L^-1，赤霉素为2.60、2.70、2.80、2.90和3.00 mg·L^-1开展9个水平的验证试验，重复3次取平均值。结果发现，经过35 d的培养，吲哚乙酸质量浓度在0.02～0.04 mg·L^-1、6-苄氨基嘌呤质量浓度在0.10～0.13 mg·L^-1和赤霉素质量浓度在2.70～2.80 mg·L^-1时，金钱松茎段腋芽萌发生长最好，腋芽萌发后的平均生长率为182.5%，比表1所列12个处理的生长率均大。

由以上实验结果可知，由于影响金钱松嫩茎段生根的因素和浓度范围是基本培养基、吲哚乙酸质量浓度为0.02～0.05 mg·L^-1、萘乙酸质量浓度为0.03～0.06 mg·L^-1和6-苄氨基嘌呤质量浓度为0.09～0.12 mg·L^-1；而茎段腋芽萌发生长的主要影响因素和浓度范围为基本培养基、吲哚乙酸质量浓度在0.02～0.04 mg·L^-1、6-苄氨基嘌呤质量浓度在0.10～0.13 mg·L^-1和赤霉素质量浓度在2.70～2.80 mg·L^-1。

因此， 5月上旬，取金钱松2年生苗主干上的新发嫩茎（2.5～3.5 cm），摘去针叶及短小叶柄，用70%乙醇（体积分数）涮洗60 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成1.0 cm的茎段接种到基本培养基＋吲哚乙酸IAA(0.02～0.04 mg·L^-1)＋萘乙酸NAA(0.03～0.06 mg·L^-1)＋6-苄氨基嘌呤6-BA(0.10～0.12 mg·L^-1)＋赤霉素GA₃(2.70～2.80 mg·L^-1)中进行金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长培养，成苗率达96.6%。

2.3 金钱松植株的快速繁殖

按1.2方法，按每瓶接种10个茎段，35天为1个周期，每个茎段在1个培养周期内平均可切割成4～5段计算，每年有n个周期（金钱松每年11个周期）进行扩繁，年生产金钱松种苗数为：∑年产试管苗=[10×(4～5)¹¹×96.6%×93.8%]株，可见本发明可以满足金钱松工厂化育苗和规模化栽培的需要。

2.4 金钱松小植株的炼苗和移栽

根据1.2中的方法，当种苗扩繁到一定数量后，选取2.00 cm以上的小植株进行炼苗移栽，经统计计算，小植株成活率可达到93.8%以上。

Claims

1. 一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其特征在于步骤如下：

（1）取金钱松苗主干上的新发嫩茎处理后茎段作为外植体备用；（2）接种到基本培养基＋吲哚乙酸0.02～0.04 mg·L^-1＋萘乙酸0.03～0.06 mg·L^-1＋6-苄氨基嘌呤0.10～0.12 mg·L^-1＋赤霉素2.70～2.80 mg·L^-1中进行金钱松茎段生根同时腋芽萌发生长培养；琼脂条8.5 g·L^-1，添加食用白糖10.0 g·L^-1，调节pH值至5.7，嫩茎段在光照周期7 h·d^-1、光照强度800 lx和温度24±2℃条件下培养；

基本培养基成分和含量为：110.0 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，660.0 mg·L^-1KNO₃，38.0 mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，42.0 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，85.0 mg·L^-1KH₂PO₄；2.7 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，2.4 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.35 mg·L^-1KI，1.2 mg·L^-1H₃BO₃；4.6 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.3 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；0.8 mg·L^-1盐酸硫胺素(VB₁)，0.3 mg·L^-1烟酸，0.3 mg·L^-1盐酸吡哆醇(VB₆)，1.50 mg·L^-1甘氨酸，15.0 g·L^-1肌醇；

（3）金钱松植株的快速繁殖、炼苗和移栽；快速繁殖是指按每瓶接种10个茎段，35天为1个周期，每个茎段在1个培养周期内平均可切割成4～5段，每年有多个周期进行扩繁。

2.按照权利要求1所述的一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其特征在于步骤（1）中的处理是指摘去针叶及短小叶柄，用70%乙醇涮洗60 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成1.0 cm的茎段。

3.按照权利要求1所述的一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其特征在于步骤（3）中的炼苗和移栽是指当种苗扩繁到一定数量后，选取2.00 cm以上的小植株进行炼苗移栽，小植株成活率可达到93.8%以上。

4.按照权利要求1所述的一种基于茎节增殖的金钱松快速繁殖方法，其特征在于步骤（2）中基本培养基＋吲哚乙酸0.04 mg·L^-1＋萘乙酸0.03 mg·L^-1＋6-苄氨基嘌呤0.12 mg·L^-1＋赤霉素2.80 mg·L^-1。