CN103039365B - 一种东北红豆杉试管内一步成苗方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种植物种植技术，即东北红豆杉试管内一步成苗方法。其步骤如下：（1）取东北红豆杉野生实生苗主干上的新发主茎，切割成段作为外植体备用；（2）茎段生根同时腋芽萌发生长培养基成分和含量：培养基＋吲哚乙酸IAA(0.03～0.04mg·L-1)＋萘乙酸NAA(0.02～0.03mg·L-1)＋激动素KT(0.11～0.12mg·L-1)＋赤霉素GA3(2.60～2.80mg·L-1)；添加琼脂粉8.0g·L-1，添加蔗糖20.0g·L-1，调节pH值至5.6，嫩茎段在光照周期6h·d-1、光照强度700lx和温度20±2℃条件下培养。本发明为进一步人工规模化繁殖和栽培东北红豆杉提供优质种苗。炼苗移栽成活率可达到95.2%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物种植技术，即东北红豆杉试管内一步成苗方法。
背景技术
在现有技术中，东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb. et Zucc.)又称紫杉、赤板松，红豆杉科红豆杉属常绿乔木，该种在长白山区数量稀少，分布区域十分狭窄，仅在吉林省石湖自然保护区内有较大的种群面积，其他区域仅有零星分布。被《国家重点保护野生植物名录（第一批）》定为国家一级重点保护植物。被《中国物种红色名录》定为易危种（VU）。在《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》一文中被定为省级一类重点保护植物。东北红豆杉不仅是材用植物，也是重要的药用植物，其茎、枝、叶和根可入药，主要成分含紫杉醇、紫杉碱、双萜类化合物。有抗癌功能，并有抑制糖尿病及治疗心脏病的效用。此外种子还可以榨油等。也可作东北及华北地区的绿化及造林树种。
东北红豆杉通常以插条扦插或种子繁殖为主，但其果实成熟后，种子中的种胚处于心形胚后期或子叶胚初期阶段，种子播种后当年不萌发，加之种皮坚硬，种胚成熟后很难破壳发芽，2～3年后仅极少数萌发；所以，插条扦插繁殖不仅生根率和移栽成活率极低，而且导致野生资源受到灭绝性威胁。因此，大规模人工栽培、开发和利用受到极大限制。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足而提供一种东北红豆杉试管内高效、一步成苗的东北红豆杉试管内一步成苗方法。
本发明的技术解决方案是：一种东北红豆杉试管内一步成苗方法，其步骤如下：
（1）取东北红豆杉野生实生苗主干上的新发主茎，切割成段作为外植体备用；
（2）茎段生根同时腋芽萌发生长培养基成分和含量：培养基＋吲哚乙酸IAA(0.03～0.04 mg·L-1)＋萘乙酸NAA(0.02～0.03 mg·L-1)＋激动素KT(0.11～0.12 mg·L-1)＋赤霉素GA3(2.60～2.80 mg·L-1)；培养基：110.0 mg·L-1(NH4)2SO4，560.0 mg·L-1KNO3，40.5 mg·L-1CaCl2·2H2O，1.20 mg·L-1MgSO4·7H2O，95.0 mg·L-1KH2PO4，1.00 mg·L-1ZnSO4·7H2O，0.2 mg·L-1KI，0.4 mg·L-1H3BO3；4.64 mg·L-1FeSO4·7H2O，6.22 mg·L-1Na2·EDTA·2H2O；3.70 mg·L-1MnSO4·4H2O；0.3 mg·L-1烟酸，0.5 mg·L-1盐酸吡哆醇(VB6)，1.50 mg·L-1甘氨酸；添加琼脂粉8.0 g·L-1，添加蔗糖20.0 g·L-1，调节pH值至5.6，嫩茎段在光照周期6 h·d-1、光照强度700 lx和温度20±2℃条件下培养。
在步骤（2）之后将种苗植株栽植到腐熟草炭土、腐烂松针和珍珠岩基质中，混合比例3: 2: 1，温度控制在20±2℃，保持相对湿度在70%，自然光照8 h·d-1。
本发明的优点是：1、本发明利用植物组织培养技术，采用东北红豆杉野生实生苗主干上的新发茎尖为材料，在试管内调控茎段生根同时腋芽萌发生长，以达到茎节增殖的一步快繁目标，解决了种子繁殖困难和扦插繁殖生根率低、移栽成活率及野生资源受灭绝性威胁等问题。本发明为进一步人工规模化繁殖和栽培东北红豆杉提供优质种苗。2、当种苗扩繁到一定数量后，进行炼苗移栽，小植株成活率可达到95.2%以上。
下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。
具体实施方式
1 材料与方法
1.1 材料及处理
7月上旬，采取东北红豆杉野生实生苗主干上的新发主茎（2.0～3.0 cm），并将主茎剪成段(长度为0.5 cm)后，摘去嫩针叶及短小叶柄，用70%乙醇（体积分数）涮洗40 s，移至饱和次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠毒伤的组织后切割成段作为外植体备用。
1.2 东北红豆杉茎段生根同时腋芽萌发生长、植株快速再生体系建立和栽培
培养基成分和含量：110.0 mg·L-1(NH4)2SO4，560.0 mg·L-1KNO3，40.5 mg·L-1CaCl2·2H2O，1.20 mg·L-1MgSO4·7H2O，95.0 mg·L-1KH2PO4，1.00 mg·L-1ZnSO4·7H2O，0.2 mg·L-1KI，0.4 mg·L-1H3BO3；4.64 mg·L-1FeSO4·7H2O，6.22 mg·L-1Na2·EDTA·2H2O；3.70 mg·L-1MnSO4·4H2O；0.3 mg·L-1烟酸，0.5 mg·L-1盐酸吡哆醇(VB6)，1.50 mg·L-1甘氨酸。培养基中附加吲哚乙酸IAA(0.07～0.12 mg·L-1)、萘乙酸NAA(0.05～0.10 mg·L-1)、激动素KT(0.03～0.08 mg·L-1)和赤霉素GA3(1.30～2.40 mg·L-1)，琼脂粉8.0 g·L-1，添加蔗糖20.0 g·L-1，调节pH值至5.6，嫩茎段在光照周期6 h·d-1、光照强度700 lx和温度(20±2) ℃条件下培养。为提高东北红豆杉嫩茎段生根的速度及生根率和腋芽萌发生长速度，通过均匀设计法设计实验，选用U12(124)均匀表，每个处理接种10个嫩茎段，重复3次，筛选确定影响东北红豆杉茎段生根同时腋芽萌发生长的吲哚乙酸、萘乙酸、激动素和赤霉素最佳浓度配比。茎段培养45 d统计生根率和长度，以均出现茎段生根和腋芽萌发生长的苗为准。生根率=(生根的茎段数/接种的茎段总数)×100%，生长率=(苗总长度-0.5)/苗总长度×100%，茎段腋芽长度为1个培养周期过程中，茎段腋芽萌发生长后的腋芽长度（不包括原茎段长度）。
茎段生根后腋芽萌发生长至2.00 cm，腋芽发出10～12片针叶时，在无菌条件下打开培养瓶，将茎段留2叶剪下苗干，并将苗干切割成1～2叶1段（0.5 cm左右），再次将小茎段转接到茎段生根同时腋芽萌发生长培养基中，计算出每个茎段生根同时腋芽萌发生长的每瓶增殖倍数和周期。
当种苗扩繁到需要数量后，且小植株长至1.50 cm时，将小植株从培养瓶中取出，放在杀毒矾溶液（浓度为2 mg·L-1）中洗净根上的琼脂，将小植株栽植到经杀毒矾（100倍液）消毒过的腐熟草炭土、腐烂松针和珍珠岩 (3: 2: 1)的基质中，覆盖塑料薄膜（透性好）进行保温保湿，温度控制在(20±2) ℃，保持相对湿度在70%，自然光照8 h·d-1，温度升高时，适当通风换气。
2 结果与分析
2.1 吲哚乙酸、萘乙酸、激动素和赤霉素对东北红豆杉茎段生根的影响
数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=111－275X 1－332X 2＋288X 3，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9795，剩余标准差S＝1.8800，检验值F t ＝63.05﹥临界值F (0.05,3,8)＝4.066，回归方程具有显著性，吲哚乙酸、萘乙酸和激动素对茎段的生根影响具有显著性，赤霉素对茎段的生根影响不显著。通过计算吲哚乙酸、萘乙酸和激动素对生根的贡献值和贡献率可知，U 1＝290，U 1/U＝43.4%；U 2＝305，U 2/U＝45.7%；U 3＝209，U 3/U＝31.4%，但从数值来看，吲哚乙酸、萘乙酸和激动素三者对生根率的贡献差距不大，说明吲哚乙酸、萘乙酸和激动素均在东北红豆杉茎段生根起同等不可缺少的重要作用。因激动素与生根率呈正相关，而吲哚乙酸和萘乙酸与生根率呈负相关。由此推测，激动素质量浓度高于0.08 mg·L-1的，吲哚乙酸和萘乙酸质量浓度分别低于0.07 mg·L-1和0.05 mg·L-1可能有更高的生根率。为验证此推测，又以激动素为0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14和0.15 mg·L-1，吲哚乙酸质量浓度为0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01和0.00 mg·L-1，萘乙酸质量浓度为0.05、0.04、0.03、0.02、0.01和0.00 mg·L-1开展8个水平的补充试验，重复3次。结果发现，吲哚乙酸质量浓度为(0.03～0.06 mg·L-1)、萘乙酸质量浓度为(0.02～0.04 mg·L-1)和激动素质量浓度为(0.10～0.13 mg·L-1)时，东北红豆杉嫩茎段生根率最高，平均生根率达99.3%以上。均高于表1所列12个处理的生根率。
表1 影响东北红豆杉嫩茎段生根和腋芽生长的因素筛选U12(124)试验设计与结果
2.2 吲哚乙酸、萘乙酸、激动素和赤霉素对东北红豆杉腋芽萌发生长的影响
数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=39.7－565X 1-－134X 2＋778X 3＋28.5X 4，显著性水平α＝0.05，复相关系数R＝0.9922，剩余标准差S＝1.6100，检验值F t ＝110.3﹥临界值F (0.05,4,7)＝4.120，回归方程显著。吲哚乙酸、萘乙酸、激动素和赤霉素均对东北红豆杉嫩茎段腋芽萌发生长的影响具有显著性。同理，计算吲哚乙酸、萘乙酸、激动素和赤霉素对茎段腋芽萌发生长的贡献值和贡献率可知，U 1＝872，U 1/U＝78.5%；U 2＝49.7，U 2/U＝4.32%；U 3＝43.9，U 3/U＝3.82%；U 4＝24.1，U 4/U＝2.10%，说明4个因素对东北红豆杉茎段腋芽萌发生长的贡献顺序为：吲哚乙酸>萘乙酸>激动素>赤霉素，虽然吲哚乙酸、萘乙酸、激动素和赤霉素对生长率的贡献差距较大，但4个因素均对生长率影响显著，说明吲哚乙酸、萘乙酸、激动素和赤霉素均在东北红豆杉茎段腋芽萌发生长过程中起同等不可缺少的重要作用。又因激动素和赤霉素与茎段腋芽萌发生长呈正相关，而吲哚乙酸和萘乙酸与茎段腋芽萌发生长呈负相关。推测吲哚乙酸和萘乙酸的质量浓度分别低于0.07 mg·L-1和0.05 mg·L-1，激动素和赤霉素的质量浓度分别高于0.08 mg·L-1和2.40 mg·L-1时，茎段腋芽萌发生长率可能更高。为验证此可能性，又以吲哚乙酸质量浓度为0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01和0.00 mg·L-1，萘乙酸质量浓度为0.05、0.04、0.03、0.02、0.01和0.00 mg·L-1，激动素为0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14和0.15 mg·L-1，赤霉素为2.40、2.50、2.60、2.70、2.80、2.90和3.00 mg·L-1开展12个水平的验证试验，重复3次取平均值。结果发现，经过45 d的培养，吲哚乙酸质量浓度在0.02～0.04 mg·L-1、萘乙酸质量浓度在0.01～0.03 mg·L-1、激动素质量浓度在0.11～0.12 mg·L-1和赤霉素质量浓度在2.60～2.80 mg·L-1范围内时，东北红豆杉茎段腋芽萌发生长更好，腋芽萌发后的平均生长率为126.6%，比表1所列12个处理的生长率均大。
由以上实验结果可知，由于影响东北红豆杉嫩茎段生根的因素和含量范围是培养基、吲哚乙酸质量浓度为0.03～0.06 mg·L-1、萘乙酸质量浓度为0.02～0.04 mg·L-1和激动素质量浓度为0.10～0.13 mg·L-1，而茎段腋芽萌发生长的主要影响因素和含量范围为培养基、吲哚乙酸质量浓度在0.02～0.04 mg·L-1、萘乙酸质量浓度在0.01～0.03 mg·L-1、激动素质量浓度在0.11～0.12 mg·L-1和赤霉素质量浓度在2.60～2.80 mg·L-1。
因此，可以确定东北红豆杉茎段生根同时腋芽萌发生长的培养基为：培养基＋吲哚乙酸IAA(0.03～0.04 mg·L-1)＋萘乙酸NAA(0.02～0.03 mg·L-1)＋激动素KT(0.11～0.12 mg·L-1)＋赤霉素GA3(2.60～2.80 mg·L-1)。
2.3 东北红豆杉植株快速再生体系建立
按1.2方法，按每瓶接种10个茎段，45天为1个周期，每个茎段在1个培养周期内平均可切割成8～10段计算，每年有n个周期（东北红豆杉每年8个周期）进行扩繁，年生产东北红豆杉种苗数为：∑年产试管苗=10×(8～10)n株，可见本发明可以满足东北红豆杉工厂化育苗和规模化栽培的需要。
2.4 东北红豆杉小植株的炼苗和移栽
根据1.2中的方法，当种苗扩繁到一定数量后，选取1.50 cm以上的小植株进行炼苗移栽，经统计计算，小植株成活率可达到95.2%以上。
Claims (2)
1. 一种东北红豆杉试管内一步成苗方法，其特征在于步骤如下：
（1）取东北红豆杉野生实生苗主干上的新发主茎，切割成段作为外植体备用；
（2）茎段生根同时腋芽萌发生长培养基成分和含量：基本培养基＋吲哚乙酸IAA 0.03～0.04 mg·L-1＋萘乙酸NAA 0.02～0.03 mg·L-1＋激动素KT 0.11～0.12 mg·L-1＋赤霉素GA3 2.60～2.80 mg·L-1；基本培养基：110.0 mg·L-1(NH4)2SO4，560.0 mg·L-1KNO3，40.5 mg·L-1CaCl2·2H2O，1.20 mg·L-1MgSO4·7H2O，95.0 mg·L-1KH2PO4，1.00 mg·L-1ZnSO4·7H2O，0.2 mg·L-1KI，0.4 mg·L-1H3BO3；4.64 mg·L-1FeSO4·7H2O，6.22 mg·L-1Na2·EDTA·2H2O；3.70 mg·L-1MnSO4·4H2O；0.3 mg·L-1烟酸，0.5 mg·L-1盐酸吡哆醇(VB6)，1.50 mg·L-1甘氨酸；添加琼脂粉8.0 g·L-1，添加蔗糖20.0 g·L-1，调节pH值至5.6，嫩茎段在光照周期6 h·d-1、光照强度700 lx和温度20±2℃条件下培养。
2.按照权利要求1所述的东北红豆杉试管内一步成苗方法，其特征在于在步骤（2）之后将种苗植株栽植到腐熟草炭土、腐烂松针和珍珠岩基质中，混合比例3: 2: 1，温度控制在20±2℃，保持相对湿度在70%，自然光照8 h·d-1。
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