CN115918534B

CN115918534B - 黄豆杉种胚快繁体系的建立方法

Info

Publication number: CN115918534B
Application number: CN202211517371.8A
Authority: CN
Inventors: 钱奇霞; 孔思梦; 侯丹; 尹顺利; 殷德程; 姜玉龙; 柳卫斌
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2042-11-30
Also published as: CN115918534A

Abstract

本发明公开了一种黄豆杉种胚快繁体系的建立方法，包括1）将处理消毒后的黄豆杉种子置于显微镜下剥离种皮与胚乳，取出种胚接种于DCR培养基中，于25±2℃温度条件下，16h光照和8h黑暗交替进行或采用黑暗过渡培养，培养至黄豆杉幼苗长至第一对真叶完全展开时，转移至16h光照和8h黑暗交替培养。幼苗高度＞2cm时，将幼苗转移至生根培养基中进行生根诱导；2）选取生长健硕的黄豆杉无菌幼苗进行驯化移栽，后正常养护。本发明方法可有效提高黄豆杉种子的萌发率，且生长势较均一，解决种子休眠时间长的问题，使胚在1‑2个月内形成正常幼苗,为黄豆杉快速繁殖奠定理论基础，也为研究黄豆杉中紫杉醇生物合成提供了良好的培养系统。

Description

黄豆杉种胚快繁体系的建立方法

技术领域

本发明属于植物快繁技术领域，具体涉及一种黄豆杉种胚快繁体系的建立方法。

背景技术

黄豆杉(Taxus wallichiana f.flaviarilla)是在南方红豆杉(Taxuswallichianavar.mairei)群落中发现的天然变型，与南方红豆杉相比，其肉质假种皮呈金黄色，具有较高的观赏价值。当前关于红豆杉快繁体系建立有较多研究，但有关黄豆杉快速繁殖的研究还未见报道。在安徽旌德南方红豆杉群体中发现天然变异的黄豆杉，在同一生长环境下，黄豆杉种胚较小，且在野外发现黄豆杉长势弱于南方红豆杉，而当前南方红豆杉快繁体系是否适用于黄豆杉需要进一步研究。参考了当前报道的红豆杉属种胚离体培养的方法用于黄豆杉种胚的培养中发现，种胚部分可以正常萌动，即子叶部分张开，变绿，胚根伸长，发育为完整幼苗，而大部分种胚萌动时胚根部位产生大量的棕红色酚类物质，在后续的培养过程中，即使子叶变绿，而下胚轴部位持续弯曲、膨大，形状异常，呈玻璃化现象，胚根无法正常伸长，导致种胚无法继续生长成苗。为了解决黄豆种胚下胚轴玻璃化问题，本申请从植物激素、添加物、光照条件方面寻找可解决黄豆杉种胚离体培养中下胚轴异常膨大问题的方法，以期建立稳定的黄豆杉种胚快繁体系。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种黄豆杉种胚快繁体系的建立方法，以解决黄豆杉种子自然条件下处于休眠状态，生长缓慢，再生能力差的问题。

具体通过以下技术方案加以实现：

黄豆杉种胚快繁体系的建立方法，包括以下步骤：

1)将黄豆杉种子剥去肉质假种皮后置于烧杯中，浓硫酸预处理种皮后流水冲洗，后置于超净工作台中消毒，置于显微镜下剥离种皮与胚乳，取出种胚接种于DCR培养基中培养，培养条件：25±2℃温度条件下，采用16h光照和8h黑暗交替进行或直接采用黑暗过渡培养，培养至黄豆杉幼苗长至第一对真叶完全展开时，转移至16h光照和8h黑暗交替培养；待黄豆杉幼苗高度＞2cm时，将黄豆杉幼苗转移至生根培养基中进行生根诱导；

2)选取生长健硕的黄豆杉无菌幼苗进行驯化移栽，后进行正常养护。

进一步地，16h光照和8h黑暗交替进行培养时，光照培养的光照强度为2100lx。

进一步地，黑暗过渡培养需全天24h黑暗，培养14d后，转移至16h光照和8h黑暗交替进行的条件下进行培养。

进一步地，步骤1)中黄豆杉种子的处理过程为：黄豆杉去除肉质假种皮→浓硫酸处理6-8min→流水冲洗2-4h→75％酒精消毒1min→1.5％次氯酸钠溶液真空抽滤消毒18min→无菌水冲洗4-5次。

进一步地，DCR培养基中含有1.0mg/LBA、0.5mg/LKT、3.0mg/L、2.0g/LAC、2.5％蔗糖、0.36％Gelrite、pH为5.7。

进一步地，步骤2)驯化移载的具体过程为：

6-1)选取生长健硕，根系发达的黄豆杉无菌苗，先在驯化室打开封口膜放置3-5天；

6-2)栽培土配制：蛭石：珍珠岩：泥炭按质量比1:1:1的比例混合后，装入8cm*8cm营养盒中备用；

6-3)取出黄豆杉无菌苗用清水将培养基清洗干净，后用含有多菌灵的清水浸泡3min后，栽入营养盒，浇水后，外罩塑料袋以保湿；

6-4)置于驯化室中培养，前一周注意水分管理，后去除塑料袋进行正常养护，培养2个月后观察新根生长情况。

本发明采用组织培养技术，可提高黄豆杉种子发芽率，不受时间和气候条件限制，不仅可以有效提高育种进程，且可在短时间内繁育大量优良植株，成为解决紫杉醇资源匮乏的重要途径。

本发明所提供的黄豆杉种胚离体快速繁殖的方法可有效提高黄豆杉种子的萌发率，且生长势较均一。黄豆杉离体胚经黑暗过渡培养后在含有0.5mg/L BA、1.0mg/L KT、3.0mg/L GA₃和2.0g/L AC的培养基中培养，胚根附近棕红色酚类物质释放最少，可有效缓解黄豆杉下胚轴玻璃化现象，种胚萌动率和成苗率最高；另外，南方红豆杉种胚在此培养基中也可萌发、成苗，效率较高，说明本发明的培养基配方在红豆杉属种胚培养过程中有一定的适用性。黄豆杉体外胚培养方法不仅可解决种子休眠时间长的问题，还可使胚在1-2个月内形成正常幼苗，为黄豆杉快速繁殖奠定理论基础，也为研究黄豆杉中紫杉醇生物合成提供了良好的培养系统。

附图说明

图1为黄豆杉种子(图中，(A)黄豆杉种子含假种皮，比例尺＝500um；(B)黄豆杉种子，比例尺＝2mm；(C)黄豆杉种胚，比例尺＝1000um)；

图2为黄豆杉种胚无菌萌发过程(图中，(A)黄豆杉种胚刚离体时；(B)离体胚子叶张开；(C)离体胚子叶张开变绿；(D)离体胚产生红棕色代谢物；(E)离体胚下胚轴弯曲；(F)离体胚下胚轴膨大，玻璃化；(G)黄豆杉无菌苗)；

图3为不同浓度BA、KT对黄豆杉种胚成苗的影响(图中，不同小写字母表示不同材料、浓度在p<0.05水平的差异显著性)；

图4为不同光照条件对黄豆杉种胚可溶性蛋白含量的影响；

图5为黄豆杉无菌苗驯化移栽；

图6为黄豆杉(右)与南方红豆杉(左)种胚。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，以便更好地理解本技术方案。

实施例

利用黄豆杉种胚进行快速繁殖的方法，按下列步骤进行：

1)黄豆杉种子处理：将黄豆杉种子剥去肉质假种皮后置于烧杯中，浓硫酸处理6-8min，流水冲洗2-4h后置于超净工作台中。75％酒精消毒1min，后1.5％次氯酸钠溶液真空抽滤消毒18min，无菌水冲洗干净后在SZ61体式显微镜(OLYMPUS，日本)下剥离种胚，将其接种在相应培养基中培养30d后统计其萌动率、成苗率、下胚轴异常膨大率。培养条件：光照培养时光照强度为2100lx，培养方式采用16h光照/8h黑暗、温度为25±2℃；或为24h黑暗、温度为25±2℃。

2)植物激素对黄豆杉种胚成苗的影响：以添加0.5mg/L KT、3.0mg/L GA₃的DCR培养基为基本培养基，分别以不同浓度BA(0.5、1.0、2.0mg/L)诱导黄豆杉种胚萌发成苗；以添加1.0mg/L KT、3.0mg/LGA₃的DCR培养基为基本培养基，分别以不同浓度BA(0.5、1.0、2.0mg/L)诱导黄豆杉种胚萌发成苗。以上每种处理16颗种胚，3次重复。处理培养30d后观察其生长状况，并统计萌动率、成苗率、下胚轴异常膨大率。

3)活性炭对黄豆杉种胚成苗的影响：将种胚置于以DCR为基础培养基，添加0.5mg/L BA、1.0mg/L KT、3.0mg/L GA₃和25.0g/LSucrose，实验组加入0.2％ Ac(Activatedcarbon)，对照组不添加Ac。在8h黑暗/16h光照条件下培养30d后统计其生长指标(萌动率、成苗率、下胚轴异常膨大率)。每种处理下18颗种胚，3次重复。

萌动率＝子叶变绿数/无菌外植体数*100％；

成苗率＝正常幼苗数/无菌外植体数*100％；

下胚轴异常膨大率＝下胚轴异常膨大数/无菌外植体数*100％。

4)光照条件对黄豆杉种胚成苗及其可溶性蛋白含量的影响：分别设置黑暗过渡培养：24h黑暗，2周后转至正常光照条件(8h黑暗/16h光照)下培养2周，对照组：直接正常光照条件(8h黑暗/16h光照)培养4周。将种胚置于以DCR为基础培养基，添加0.5mg/L BA、1.0mg/L KT、3.0mg/L GA₃、25g/L Sucrose和0.2％Ac培养基中。每皿放置16颗种胚，3次生物学重复。培养4周后测定实验组与对照组黄豆杉种胚可溶性蛋白的含量(苏州梦犀生物医药科技有限公司BCA蛋白法含量测试盒)。

5)黄豆杉再生苗生根、驯化培养：选取长势一致的黄豆杉无菌幼苗，移至以DCR为基本培养基，含有不同浓度的IBA培养基中进行生根诱导培养，每个处理12颗幼苗，2次重复。培养30d后统计生根率、根长、根粗，后将其移至驯化室(16h光照/8h黑暗、温度为25±2℃)，驯化过渡培养一周后将黄豆杉幼苗移栽至混合基质中(蛭石：珍珠岩：泥炭＝1:1:1)培养。

试验例1：黄豆杉种子基本特征

黄豆杉果实与种子形态如图1所示，成熟黄豆杉种子外有金黄色肉质假种皮，种子多呈卵圆型，少数呈锥形，种脐有椭圆型和三角形，种皮坚硬有光泽。黄豆杉胚长为3.38±0.152mm，胚率为0.65±0.130(表1)。

表1黄豆杉种子基本特征

试验例2：不同浓度BA、KT对黄豆杉成苗的影响

以发育状态基本一致的黄豆杉离体胚(如图1)为试验材料，接种于以DCR为基础培养基，添加不同浓度的BA(0.5、1.0、2.0mg/L)、KT(0.5、1.0mg/L)培养基中，观察黄豆杉合子胚的萌动(图2)及幼苗生长状况。30d后统计数据，见图3，当KT浓度为0.5mg/L时，黄豆杉合子胚生长状况随BA浓度的升高，成苗率显著下降，下胚轴异常膨大生长的状况愈严重，即BA浓度为0.5mg/L时，黄豆杉种胚成苗率最高，为37.8％，下胚轴异常膨大率为16.9％，BA浓度为1.0mg/L(或＞1.0mg/L)时，成苗率显著下降，下胚轴异常膨大，玻璃化现象严重，胚根无法正常伸长，黄豆杉幼苗无法正常生长或停滞生长，直至死亡。当KT浓度为1.0mg/L时，黄豆杉合子胚生长状况随BA浓度的升高，成苗率显著下降，即BA浓度为0.5mg/L时，黄豆杉种胚胚根基本可正常伸长，幼苗生长状况较好，叶片嫩绿，成苗率最高，为56.5％，下胚轴异常膨大率为各处理组较低水平，随着BA浓度(＞0.5mg/L)的升高，黄豆杉下胚轴玻璃化现象严重，无法正常生长，胚芽生长也逐渐停滞，成苗率显著下降。

试验例3：活性炭对黄豆杉成苗的影响

选取发育状态基本一致的黄豆杉种胚(如图1)为试验材料，在含有或不含有活性炭的培养基中培养30d后统计数据。如表2所示，在含有活性炭的培养基中，黄豆杉种胚基本可以萌动，下胚轴有少量异常膨大现象，在种胚萌发的过程中，红色有害代谢产物较少，成苗率为56.53％。不含有活性炭的对照处理，黄豆杉种胚可正常萌动，在种胚的后续培养中，胚根周围红色代谢物较多，种胚生长受损严重，种苗玻璃化现象严重，成苗率为37.56％，下胚轴异常膨大率为57.82％。

表2活性炭对黄豆杉种胚生长的影响

试验例4：不同光照条件对黄豆杉种胚成苗及可溶性蛋白含量的影响

以发育状态基本一致的黄豆杉离体胚为试验材料，观察不同光照条件培养(14d)对黄豆杉种胚成苗以及可溶性蛋白含量的影响。如表3所示，黄豆杉种胚离体后直接光照培养，成苗率仅为45.33％，下胚轴多形态异常，膨大，质地较脆，呈玻璃化现象。经黑暗过渡培养2周后再转入光照条件下培养，下胚轴异常膨大率仅为6.73％，胚根多可正常生长，伸长，成苗率为70.33％。此外，在黑暗过渡培养刚结束时(14d)，离体胚可溶性蛋白含量低于直接光照培养处理，但未达到显著差异水平，见图4所示；在离体胚培养28d后，黑暗过渡培养的种胚中可溶性蛋白含量显著大于对照，见图4。

表3不同光照条件对黄豆杉种胚成苗的影响

试验例5：不同浓度IBA对黄豆杉种胚生根的影响

选取不同浓度IBA(0.5、1.0、2.0、4.0mg/L)对黄豆杉种胚幼苗进行生根培养，观察胚根伸长、生长状态，统计数据结果如表4。黄豆杉种胚生根率随IBA浓度的升高呈“先升后降”趋势。IBA浓度为0.5mg/L时，黄豆杉种胚生根率为36.36％，根长为36.0mm，根系生长状况较差，黄豆杉幼苗长势弱。随着IBA浓度升高至1.0mg/L时，黄豆杉生根率显著增加，胚根生长较好，根粗大于其他各处理，但未达到显著水平。当IBA浓度大于1.0mg/L时，黄豆杉生根率显著性下降，根长也显著性减小，根系较细，且幼苗长势弱。

表4不同浓度IBA对黄豆杉种胚生根的影响

试验例6：黄豆杉无菌苗驯化移栽

将长势较旺，根系发达的黄豆杉无菌苗移至驯化室炼苗，将培养瓶盖打开，使其逐渐适应外部环境，约一周后，将其移栽至培养基质中，细心养护，前期注意水分管理，1个月后统计黄豆杉幼苗(图5)移栽成活率约为76.8％。

试验例7：黄豆杉与南方红豆杉种胚萌发比较在黄豆杉与南方红豆杉种胚无菌培养过程中发现，在同一采样时期，黄豆杉种胚(图6右)发育时期晚于南方红豆杉(图6左)，且黄豆杉种胚较小，在无菌培养过程中生长速度慢于南方红豆杉。本研究发现黄豆杉种胚在以DCR为基础培养基，添加1.0mg/L KT、0.5mg/LBA、3.0mg/LGA₃和2.0g/L AC的培养基中生长发育较好，下胚轴玻璃化现象明显缓解，南方红豆杉种胚在此培养基中也可萌发、成苗，效率较高，说明本研究所得培养基配方在红豆杉属种胚培养过程中有一定的适用性。

Claims

1.黄豆杉种胚快繁体系的建立方法，其特征在于，该建立方法包括以下步骤：

1）将黄豆杉种子剥去肉质假种皮后置于烧杯中，浓硫酸预处理种皮后流水冲洗，后置于超净工作台中消毒，置于显微镜下剥离种皮与胚乳，取出种胚接种于DCR培养基中培养，培养条件：25±2℃温度条件下，采用黑暗过渡培养，培养至黄豆杉幼苗长至第一对真叶完全展开时，转移至16h光照和8h黑暗交替培养，待黄豆杉幼苗高度＞2cm时，将黄豆杉幼苗转移至生根培养基中进行生根诱导；

2）选取生长健硕的黄豆杉无菌幼苗进行驯化移栽，后进行正常养护；

所述DCR培养基由1.0 mg/L BA、0.5 mg/L KT、3.0 mg/L GA₃、2.0 g/L AC、2.5 %蔗糖、0.36 %Gelrite组成，DCR培养基的pH为5.7；

步骤2）驯化移载的具体过程为：

6-1）选取生长健硕，根系发达的黄豆杉无菌苗，先在驯化室打开封口膜放置3-5天；

6-2）栽培土配制：蛭石：珍珠岩：泥炭按质量比1:1:1的比例混合后，装入8 cm*8cm营养盒中备用；

6-3）取出黄豆杉无菌苗用清水将培养基清洗干净，后用含有多菌灵的清水浸泡3min后，栽入营养盒，浇水后，外罩塑料袋以保湿；

6-4）置于驯化室中培养，前一周注意水分管理，后去除塑料袋进行正常养护，培养2个月后观察新根生长情况。

2.如权利要求1所述的黄豆杉种胚快繁体系的建立方法，其特征在于16h光照和8h黑暗交替进行培养时，光照培养的光照强度为2100 lx。

3.如权利要求1所述的黄豆杉种胚快繁体系的建立方法，其特征在于黑暗过渡培养需全天24h黑暗，培养14d后，转移至16h光照和8h黑暗交替进行的条件下培养。

4.如权利要求1所述的黄豆杉种胚快繁体系的建立方法，其特征在于步骤1）中黄豆杉种子的处理过程为：黄豆杉去除肉质假种皮→浓硫酸处理6-8min→流水冲洗2-4h→75%酒精消毒1min→1.5%次氯酸钠溶液真空抽滤消毒18min→无菌水冲洗4-5次。