CN109937880B

CN109937880B - 一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法

Info

Publication number: CN109937880B
Application number: CN201910313432.0A
Authority: CN
Inventors: 王彩云; 侯俊; 王永; 阮培均; 张翔宇; 周茂嫦; 邹涛; 黄晓旭; 李恒谦; 成忠均; 柳敏; 查钦
Original assignee: Bijie City Institute Of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Bijie City Institute Of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2019-04-18
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2039-04-18
Also published as: CN109937880A

Abstract

本发明涉及中药材种植技术领域，特别涉及一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法。该方法具体包括如下步骤：（1）卫矛种子外植体的采集；（2）种子前处理；（3）种子消毒；（4）种子萌发诱导；（5）胚状体诱导。采用本发明方法，不仅能有效抑制卫矛种子内生菌的生长，而且能显著提高卫矛种子萌发率和胚状体诱导率。具体表现为：卫矛种子内生菌污染率降低至8%以下，种子萌发率从不足10%提高到90%以上，胚状体诱导率达88%以上，对于实现卫矛的规模化种子繁殖和组织培养的开展具有重要意义。

Description

一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法。

背景技术

卫矛（Euonymus alatus）又名鬼箭羽，是卫矛科卫矛属植物。卫矛种子为贵州的一种名贵苗药药材，具有解毒消肿、破血通经、杀虫之功效，还可以用于治疗产后淤血腹痛、月经不调、糖尿病、跌打损伤肿痛等症。但目前，卫矛种子存在萌发率低、活力低等问题，而现有的研究仅限于卫矛化学成分及药理作用以及部分组织培养等方面，其中并未涉及卫矛种子内生菌抑制、胚状体诱导等过程的研究。

卫矛的繁殖方法包括播种和嫁接。播种方法为：秋天果实成熟后采收，待果皮开裂后收集种子并晾干、收藏。翌年一月将种子用30℃温水浸种24小时，然后于湿沙背阴处贮藏。3月下旬移至背风向阳处并保持20~25℃催芽，待胚根出现后即可播种。采取条播，株距3~5 cm，行距35 cm，覆土厚度2~3 cm，播种量10 kg/亩。嫁接方法为可用丝棉木作砧木，3月中下旬砧木萌动时即可嫁接，采用劈接和切接方法进行，有很高的观赏价值。

卫矛种子在自然条件下萌发率极低，常规播种试验证明其萌发率几乎为零，而经过一定浓度的赤霉素、细胞分裂素等激素处理之后，萌发率依然不足10%。由于种子萌发条件的限制，现在卫矛快繁技术多是以带芽茎段作为外植体，但是组培苗生长缓慢，炼苗不易成活。目前，园林上多采用丝棉木作为砧木进行嫁接繁殖，虽然可以实现卫矛的规模化繁殖，但嫁接属于无性繁殖，无法实现卫矛的基因重组和品种改良及杂交优势的利用。因此，只有实现卫矛的种子顺利成苗，才能实现亲本到子代的延续，杂交培育新品种才具有可行性，突破卫矛种子的萌发技术，对于实现该品种的种质保存和品种改良具有非常重要的意义。因此，提供一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明提供了一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法。采用本发明方法能将卫矛种子作为外植体培养胚状体过程中内生菌污染率降低至8%以下，提高卫矛种子萌发率达90%以上，胚状体的诱导率达88%以上，对于实现卫矛的再生植株诱导及组织培养快繁体系的建立具有非常重要的作用。本发明提出的消毒方法和接种方法，操作简单，且解决了卫矛种子组织培养过程中内生菌污染这一难题，大大降低了污染率，极大的促进了卫矛种子的萌发和胚状体的培养。本发明为卫矛实生苗育苗，为分子育种的愈伤诱导及再生体系的建立等奠定技术基础，同时也提高卫矛种子的萌发率及利用率，从源头上解决市场苗木及资源紧缺等问题。

本发明可通过以下技术步骤实现：

1）种子采集

于8～10月份，待卫矛种子成熟（外层绿色果皮裂开，露出里面红色假种皮）后，于晴天的上午10：00后采收种子。种子采收时，应连果蒂一起摘下，摘下后放入干净的泡沫冰盒中带回实验室备用。

2）种子前处理：种子摘下当天，取出卫矛种子，剥去外面的种皮和假种皮，放入洁净的烧杯中，用流水冲洗干净，然后用150~200 mg/L的赤霉素GA₃浸泡28~36 h，其中前14~18 h放置于4℃冰箱中，后14~18 h放置于25~30℃恒温箱中。优选的，赤霉素GA₃的浓度为180 mg/L，先于4℃冰箱中放置16 h，后于25~30℃恒温箱中放置16 h。

3）种子消毒。将经过前处理的种子用流水清洗10 min左右，然后放入洗洁精水中浸泡30~45 min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的种子于超净工作台上，先用75%酒精浸泡60～75 s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10～12 min，无菌水漂洗4次，每次1.5min，然后将消毒后的种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干种子上残留的水分，接种前用无菌不锈钢刀片沿种子背脊线处切开，切开种皮露出胚乳即可。优选的，洗洁精水浸泡时间为40 min；75%酒精浸泡时间为60 s；0.1%升汞浸泡时间为12 min。

4）萌发诱导培养：将切好的种子接种到卫矛种子萌发培养基中。接种时外植体横放，并轻压种子使其与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，30天后可见米白色芽点愈伤组织或鲜绿色芽点从切口处长出，10天后即可转入胚状体诱导培养基中培养。其中，卫矛种子萌发培养基为MS基本培养基，添加0.5～1.0 mg/L GA₃和0.05～0.10 mg/L NAA，7 g/L卡拉胶、25 g/L的蔗糖，pH值为5.8。优选地，GA₃的浓度为0.8 mg/L，NAA的浓度为0.1 mg/L。

5）胚状体诱导培养。将萌发培养基中长势良好的种子转入胚状体诱导培养基中诱导胚状体。转接时用镊子轻压种子使愈伤组织或芽点与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见胚状体长出。其中，胚状体诱导培养基以MS为基本培养基，添加1.5~2.0 mg/L BA、0.2~0.5mg/L NAA、0.01~0.05 mg/L 2, 4-D、30 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉胶，pH值为5.8。优选地，BA的浓度为2.0 mg/L，NAA的浓度为0.3 mg/L，2,4-D的浓度为0.02 mg/L。

本发明的技术方案，相对于传统的直接利用种子育苗或者直接将种子接种到培养基中快繁组培苗，具有以下优势：种子萌发率高，且高达90%以上；内生菌污染率显著降低，且低于8%；30天左右就能诱导出胚状体，诱导率高达88%。采用此技术，不仅为卫矛组培苗的培养奠定基础，也为卫矛组织培养快繁技术体系的建立提供支持。

具体实施方式

实施例1

本实施案例提供的一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法，含以下步骤：

1）种子采集：于8月中旬，选择卫矛成熟种子（外层绿色果皮裂开，露出里面红色假种皮），连同果蒂一起摘下，放入干净的泡沫冰盒中带回实验室。

2）种子前处理：当天下午，取出卫矛种子，摘去果蒂，剥去外面的种皮和假种皮，放入洁净的烧杯中，用流水冲洗干净，然后用180 mg/L的GA₃溶液浸泡32 h，其中前16 h放置于4℃冰箱中，后16 h放置于25~30℃恒温箱中。

3）种子消毒。将经过前处理的种子用流水清洗10 min左右，然后放入洗洁精水中浸泡35 min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的种子于超净工作台上，先用75%酒精浸泡60s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后将消毒后的种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干种子上残留的水分，接种前用无菌不锈钢刀片沿种子背脊线处切开，切开种皮露出胚乳即可。

4）萌发诱导培养：将切好的种子接种到卫矛种子萌发培养基中。接种时外植体横放，并轻压种子使其与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，30天后可见鲜绿色芽点从切口处长出，出芽率为91.8%，内生菌污染率为6.5 %。其中卫矛种子萌发培养基为MS基本培养基，添加1.0 mg/L GA₃和0.10 mg/L NAA，7 g/L卡拉胶、25 g/L的蔗糖；将卫矛种子萌发培养基标记为：MS+1.0 mg/LGA₃+0.10 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+ 25 g/L蔗糖。MS培养基根据教科书中的配方进行配制，每1升MS培养基的基本成分表如下表1所示：

表1每1升MS培养基的基本成分表

5）胚状体诱导培养。将萌发培养基中长势良好的种子转入胚状体诱导培养基中诱导胚状体。转接时用镊子轻压种子使愈伤组织或芽点与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见胚状体长出，胚状体诱导率为89.4%。卫矛胚状体诱导培养基为MS基本培养基，添加1.5 mg/LBA、0.5 mg/L NAA、0.02 mg/L 2, 4-D、7 g/L卡拉胶、30 g/L的蔗糖；将卫矛胚状体诱导培养基标记为：MS+1.5 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA+0.02 mg/L 2，4-D +7 g/L卡拉胶+ 30 g/L蔗糖。MS的基本成分与表1中相同。

实施例2

1）种子采集：于9月初，选择卫矛成熟种子，连同果蒂一起摘下，放入干净的泡沫冰盒中带回实验室。

2）种子前处理：当天下午，取出卫矛种子，摘去果蒂，剥去外面的种皮和假种皮，放入洁净的烧杯中，用流水冲洗干净，然后用150 mg/L的GA₃溶液浸泡30 h，其中前15h放置于4℃冰箱中，后15h放置于25~30℃恒温箱中。

3）种子消毒。将经过前处理的种子用流水清洗10 min左右，然后放入洗洁精水中浸泡30 min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的种子于超净工作台上，先用75%酒精浸泡60s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡12 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后将消毒后的种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干种子上残留的水分，接种前用无菌不锈钢刀片沿种子背脊线处切开，切开种皮露出胚乳即可。

4）萌发诱导培养：将切好的种子接种到卫矛种子萌发培养基中。接种时外植体横放，并轻压种子使其与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，32天后可见鲜绿色芽点从切口处长出，出芽率为90.5%，内生菌污染率为6.0 %。其中卫矛种子萌发培养基为MS基本培养基，添加1.0 mg/L GA₃和0.05 mg/L NAA，7 g/L卡拉胶、25 g/L的蔗糖；将卫矛种子萌发培养基标记为：MS+1.0 mg/LGA₃+0.05 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+ 25 g/L蔗糖。MS的基本成分与表1中相同。

5）胚状体诱导培养。将萌发培养基中长势良好的种子转入胚状体诱导培养基中诱导胚状体。转接时用镊子轻压种子使愈伤组织或芽点与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见胚状体长出，胚状体诱导率为88.6%。卫矛胚状体诱导培养基为MS基本培养基，添加1.5 mg/LBA、0.5 mg/L NAA、0.01 mg/L 2, 4-D、7 g/L卡拉胶、30 g/L的蔗糖；将卫矛胚状体诱导培养基标记为：MS+1.5 mg/L BA+ 0.5 mg/L NAA+0.01 mg/L 2，4-D+7 g/L卡拉胶+ 30 g/L蔗糖。MS的基本成分与表1中相同。

实施例3

1）种子采集：于9月中旬，选择卫矛成熟种子，连同果蒂一起摘下，放入干净的泡沫冰盒中带回实验室。

2）种子前处理：当天下午，取出卫矛种子，摘去果蒂，剥去外面的种皮和假种皮，放入洁净的烧杯中，用流水冲洗干净，然后用200 mg/L的GA₃溶液浸泡36 h，其中前18 h放置于4℃冰箱中，后18 h放置于25~30℃恒温箱中。

3）种子消毒。将经过前处理的种子用流水清洗10 min左右，然后放入洗洁精水中浸泡30 min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的种子于超净工作台上，先用75%酒精浸泡60s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后将消毒后的种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干种子上残留的水分，接种前用无菌不锈钢刀片沿种子背脊线处切开，切开种皮露出胚乳即可。

4）萌发诱导培养：将切好的种子接种到卫矛种子萌发培养基中。接种时外植体横放，并轻压种子使其与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，30天后可见鲜绿色芽点从切口处长出，出芽率为91.5%，内生菌污染率为7.5%。其中卫矛种子萌发培养基为MS基本培养基，添加0.5 mg/L GA₃和0.08 mg/L NAA，7 g/L卡拉胶、25 g/L的蔗糖；将卫矛种子萌发培养基标记为：MS+0.5mg/LGA₃+0.08 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+25 g/L蔗糖。MS的基本成分与表1中相同。

5）胚状体诱导培养。将萌发培养基中长势良好的种子转入胚状体诱导培养基中诱导胚状体。转接时用镊子轻压种子使愈伤组织或芽点与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见胚状体长出，胚状体诱导率为90.4 %。卫矛胚状体诱导培养基为MS基本培养基，添加1.8 mg/LBA、0.3 mg/L NAA、0.02 mg/L 2, 4-D、7 g/L卡拉胶、30 g/L的蔗糖；将卫矛胚状体诱导培养基标记为：MS+1.8 mg/L BA+ 0.3 mg/L NAA+0.02 mg/L 2，4-D+7 g/L卡拉胶+ 30 g/L蔗糖。MS的基本成分与表1中相同。

]实施例4

1）种子采集：于10月上旬，选择卫矛成熟种子，连同果蒂一起摘下，放入干净的泡沫冰盒中带回实验室。

2）种子前处理：当天下午，取出卫矛种子，摘去果蒂，剥去外面的种皮和假种皮，放入洁净的烧杯中，用流水冲洗干净，然后用160 mg/L的GA₃溶液浸泡34 h，其中前17h放置于4℃冰箱中，后17h放置于25~30℃恒温箱中。

3）种子消毒。将经过前处理的种子用流水清洗10 min左右，然后放入洗洁精水中浸泡40 min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的种子于超净工作台上，先用75%酒精浸泡60s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡12 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后将消毒后的种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干种子上残留的水分，接种前用无菌不锈钢刀片沿种子背脊线处切开，切开种皮露出胚乳即可。

4）萌发诱导培养：将切好的种子接种到卫矛种子萌发培养基中。接种时外植体横放，并轻压种子使其与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，30天后可见鲜绿色芽点从切口处长出，出芽率为90.8%，内生菌污染率为5.0%。其中卫矛种子萌发培养基为MS基本培养基，添加0.50 mg/L GA₃和0.05 mg/L NAA，7 g/L卡拉胶、25 g/L的蔗糖；将卫矛种子萌发培养基标记为：MS+0.5 mg/LGA₃+0.05 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+ 25 g/L蔗糖。MS的基本成分与表1中相同。

5）胚状体诱导培养。将萌发培养基中长势良好的种子转入胚状体诱导培养基中诱导胚状体。转接时用镊子轻压种子使愈伤组织或芽点与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见胚状体长出，胚状体诱导率为91.2%。卫矛胚状体诱导培养基为MS基本培养基，添加2.0 mg/LBA、0.3 mg/L NAA、0.02 mg/L 2,4-D、7 g/L卡拉胶、30 g/L的蔗糖；将卫矛胚状体诱导培养基标记为：MS+2.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L NAA+0.02 mg/L 2,4-D + 7 g/L卡拉胶+ 30 g/L蔗糖。MS的基本成分与表1中相同。

实施例5

（1）种子采集：于10月下旬，选择卫矛成熟种子，连同果蒂一起摘下，放入干净的泡沫冰盒中带回实验室。

（2）种子前处理：当天下午，取出卫矛种子，摘去果蒂，剥去外面的种皮和假种皮，放入洁净的烧杯中，用流水冲洗干净，然后用180 mg/L的GA₃溶液浸泡28 h，其中前14h放置于4℃冰箱中，后14 h放置于25~30℃恒温箱中。

3）种子消毒。将经过前处理的种子用流水清洗10 min左右，然后放入洗洁精水中浸泡40 min左右，再用流水冲洗干净。冲洗后的种子于超净工作台上，先用75%酒精浸泡60s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后将消毒后的种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干种子上残留的水分，接种前用无菌不锈钢刀片沿种子背脊线处切开，切开种皮露出胚乳即可。

4）萌发诱导培养：将切好的种子接种到卫矛种子萌发培养基中。接种时外植体横放，并轻压种子使其与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，30天后可见鲜绿色芽点从切口处长出，出芽率为93.5%,内生菌污染率为6.0 %。其中卫矛种子萌发培养基为MS基本培养基，添加0.8 mg/L GA₃和0.1 mg/L NAA，7 g/L卡拉胶、25 g/L的蔗糖；将卫矛种子萌发培养基标记为：MS+0.8 mg/LGA₃+0.1 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+ 25 g/L蔗糖。MS的基本成分与表1中相同。

5）胚状体诱导培养。将萌发培养基中长势良好的种子转入胚状体诱导培养基中诱导胚状体。转接时用镊子轻压种子使愈伤组织或芽点与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见胚状体长出，胚状体诱导率为90.8%。卫矛胚状体诱导培养基为MS基本培养基，添加2.0 mg/LBA、0.3 mg/L NAA、0.05 mg/L 2,4-D、7 g/L卡拉胶、30 g/L的蔗糖；将卫矛胚状体诱导培养基标记为：MS+2.0 mg/L BA+ 0.3 mg/L NAA+0.05 mg/L 2, 4-D+7 g/L卡拉胶+ 30 g/L蔗糖。MS的基本成分与表1中相同。

上述实例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施实例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都应包含在本发明的保护范围。

Claims

1.一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法，其特征在于如下主要步骤：

1）卫矛种子外植体的采集，于8月下旬～10月下旬，待卫矛种子成熟后，于晴天的上午采集种子；

2）种子前处理，剥去卫矛种子外面的果皮和假种皮，放入洁净的烧杯中，用流水冲洗干净，放入150～200 mg/L的赤霉素GA₃溶液中浸泡28～36 h，其中前14～18h放置于4℃冰箱中，后14～18h放置于25～30℃恒温箱中；

3）种子消毒，将经过前处理的种子用流水清洗10 min，然后放入洗洁精水中浸泡30～45 min，再用流水冲洗干净，冲洗后的种子于超净工作台上，先用75%酒精浸泡60～75s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10～12 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后将消毒后的种子放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干种子上残留的水分，接种前用无菌不锈钢刀片沿种子背脊线处切开，露出胚乳即可；

4）种子萌发诱导：将切好的种子接种到卫矛种子萌发诱导培养基中，接种时外植体横放，并轻压种子使其与培养基充分接触；培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，30天后可见米白色芽点愈伤组织或鲜绿色芽点从切口处长出，10天后即可转入胚状体诱导培养基中培养，其中，卫矛种子萌发诱导培养基为MS基本培养基+0.5～1.0 mg/L GA₃+0.05～0.10 mg/L NAA+7 g/L卡拉胶+25 g/L的蔗糖，其pH值为5.8，高压灭菌20 min；

胚状体诱导：将萌发诱导培养基中已萌发的、长势良好的种子转入胚状体诱导培养基中诱导胚状体，转接时用镊子轻压种子使愈伤组织或芽点与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见胚状体长出，其中，胚状体诱导培养基为MS基本培养基+1.5～2.0 mg/L BA+0.2～0.5mg/L NAA+0.01～0.05 mg/L 2,4-D+30 g/L的蔗糖+7 g/L的卡拉胶，其pH值为5.8，高压灭菌20 min。

2.根据权利要求1所述的一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法，其特征在于：步骤1）中所述的卫矛的成熟种子为种子外层的绿色果皮裂开，露出里面的红色假种皮时即为成熟；卫矛种子采摘时间为上午10：00以后；采摘时应连同果蒂一起摘下，摘下后应放置于干净的冰盒中，以保持种子活力及保鲜。

3.根据权利要求1所述的一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法，其特征在于：步骤4）中卫矛种子接种时，应将种子横放，并轻压种子使切口与培养基充分接触。

4.根据权利要求1所述的一种降低卫矛种子内生菌污染率、快速诱导胚状体的方法，其特征在于：步骤5）胚状体诱导培养中，外植体转接时应将外植体横放于培养基内，并用镊子轻压种子，使愈伤组织或芽点与培养基充分接触。