CN101699990B - 茛力花离体培养和快速繁殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种茛力花离体培养和快速繁殖的方法包括下述步骤：取短缩茎作为外植体，并对外植体进行清洗消毒处理；将外植体接种到初始培养基中，进行初始培养；将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+BA 2.5-3.5mg·L-1+NAA 0.8-1.5mg·L-1+蔗糖25-35g·L-1+琼脂4-8g·L-1，诱导不定芽；将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养；试管苗分切后，转移至生根培养基中，该生根培养基为1/2MS+NAA3.5-4.5mg·L-1+蔗糖15-25g·L-1+琼脂4～8g·L-1；生根试管苗清洗，移至基质中栽种。优点是：年繁殖系数提高到1∶16000000，成本降低至1～2元每株，且不受季节限制，环境易控，减少变异植株的产生，种苗品质高，一致性好。
Description
技术领域
本发明属于植物快繁方法技术领域，具体为茛力花离体培养和快速繁殖。
背景技术
茛力花(Acanthus mollis L.)为爵床科爵床属多年生草本，常绿，是希腊的国花。叶片硕大，长可达60cm，叶面有光泽，深波纹状。花苞长达0.5cm，紫红色，花粉白色，开花时节，花朵从紫红色花苞中抽出，生动乖巧，故俗名“金蝉脱壳”。穗状花序，高耸艳丽，花序可长达1米，夺人眼球。宽大的翠绿叶片和挺拔的花序构成了典雅大气的风韵，是一种雅俗共赏的花卉。在5月下旬至7月上旬开花，花期两个月左右，可进一步丰富夏季景观，提升园林品质，是良好的庭院及花坛背景植物，也可以孤植。
茛力花喜充分阳光，喜排水良好的土壤，耐寒、耐热、不择土壤、具有良好的观赏特性和景观效果，冬夏两季均能在上海露地生长，今后在上海及周边地区具有良好的推广及应用前景。茛力花目前国内数量不多，引种价格昂贵，分株、切根等繁殖速度慢，年增殖系数仅有5，繁殖周期长，且受季节限制，不利于优良种苗的推广。因此我们采用了离体培养的方式，探索其快速繁殖技术，解决茛力花在园林应用中的瓶颈所在。目前，除了生物学观察及栽培方面，有零星报道之外，其系统的离体培养尚未见，开展茛力花离体培养的研究以及进一步抗逆植株的筛选工作，对推广茛力花在绿地中的应用具有开创性意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种茛力花离体培养和快速繁殖的方法，可在离体条件下快速繁殖茛力花，且生产的茛力花种苗品质高，一致性好。
本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是：一种茛力花离体培养和快速繁殖的方法，取茛力花外植体经初始培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得试管苗，进行移栽，其中所用到的培养基及激素包括：
MS培养基(Murashing and Skoog medium，以下简称MS)，MS配方中的药品成分和培养基的具体配制方法为现有公知技术，在此不再赘述。
附加的植物激素为6-苄基氨基嘌呤(benzylaminopurine，以下简称为BA)、奈乙酸(naphthylene acetic acid，以下简称为NAA)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，以下简称为IAA)；基本培养基中所用药剂和各类激素均由sigma公司购得。
快培方法包括下述步骤：
第一步：选择生长健壮，具有较好品质特征且无病虫害茛力花的短缩茎作为外植体，短缩茎长度为0.5～1cm，切取包含生长点外植体，为长度0.5～1cm，直径0.3～0.6cm的圆柱体，进行清洗消毒处理后接种；
第二步：在无菌环境下，切除外植体与消毒剂接触过的切面，将外植体接种到初始培养基中，进行初始培养；
第三步：将初始培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+BA2.5～3.5mg·L-1+NAA0.8～1.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1，诱导不定芽；
第四步：将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养，以获得株高株型比较一致的试管苗用以生根培养；
第五步：将经壮苗培养生长到1.5cm以上的试管苗切割成单个不定芽并转移至生根培养基中获得生根试管苗，该生根培养基为1/2MS+NAA3.5～4.5mg·L-1+蔗糖15～25g·L-1+琼脂4～8g·L-1，待试管苗有3片以上叶片和2～3条根时，进行下一步的移栽；
第六步：移栽前试管苗先置于自然环境下一周，再从培养瓶中取出生根试管苗，对所得的生根试管苗进行清洗，洗净根部附着的培养基，移栽至草炭和珍珠岩混合的基质中进行。
上述的初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养的培养条件均为无菌室内光周期为10～15h/d，光照强度1500～2500lx，培养温度为室温。
在上述方案的基础上，第一步中，所述的外植体为长度在0.5～1cm，可以为0.5，0.6，0.7，0.8，0.9或1cm，直径为0.3～0.6cm，可以为0.3，0.4，0.5或0.6的圆柱体。
在上述方案的基础上，第一步中，所述的清洗消毒处理的方法包括：取茛力花短缩茎，用水冲洗干净，去除叶片和肉质根，切成圆柱体，并使短缩茎的生长点位于圆柱体的中央，保留数片叶柄基部保护生长点，先用60～80％浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有2～4滴吐温80的0.1～0.2％的升汞液浸泡15～30分钟，无菌水冲洗至无残留无异味，得到无菌的外植体。
在上述方案的基础上，第二步中，所述的初始培养基为MS+6-BA0.15～0.25mg·L-1+NAA0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。
具体的，在初始培养基中，6-BA的激素浓度可以为0.15，0.18，0.2，0.22或0.25mg·L-1，NAA的激素浓度可以为0.15，0.18，0.2，0.22或0.25mg·L-1，蔗糖的浓度可以为25，28，30，32或35g·L-1，琼脂的浓度可以为4，5，6，7或8g·L-1。
在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10～15h/d，优选12h/d，光照强度1500～2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为18～30天，较佳的周期为22～28天，优选25天。
在上述方案的基础上，第三步增殖培养基中，具体BA的激素浓度可以为2.5，2.8，3，3.2或3.5mg·L-1，NAA的激素浓度可以为0.8，1.0，1.2或1.5mg·L-1，蔗糖的浓度可以为25，28，30，32或35g·L-1，琼脂的浓度可以为4，5，6，7或8g·L-1。
所述的增殖培养基最佳的激素组合及浓度为：MS+BA3mg·L-1+NAA1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1；在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10～15h/d，优选12h/d，光照强度1500～2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为18～35天，较佳周期为28～32天，优选30天，由此茛力花试管苗的月增殖系数平均为4.65。
在上述方案的基础上，第四步中，所述的壮苗培养基为MS+6-BA0.15～0.25mg·L-1+IBA0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1。
具体的，在壮苗培养基中，6-BA的激素浓度可以为0.15，0.18，0.2，0.22或0.25mg·L-1，IBA的激素浓度可以为0.15，0.18，0.2，0.22或0.25mg·L-1，蔗糖的浓度可以为25，28，30，32或35g·L-1，琼脂的浓度可以为4，5，6，7或8g·L-1。
优选的壮苗培养基为：MS+6-BA0.2mg·L-1+IBA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1；在壮苗培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为10～15h/d，优选12h/d，光照强度1500～2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，培养周期为18～30天，较佳周期为18～22天，优选20天左右，由此试管苗长至2cm高，比较整齐。
在上述方案的基础上，在生根培养基中，具体NAA的激素浓度可以为3.5，3.8，4，4.2或4.5mg·L-1+蔗糖的浓度可以为15，18，20，22或25g·L-1，琼脂的浓度可以为4，5，6，7或8g·L-1。
所述的生根培养基最佳的激素和矿质元素及碳源组合机浓度值为：1/2MS+NAA4mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6g·L-1；培养条件为无菌室内光周期为10～15h/d，优选12h/d，光照强度1500～2500lx，优选2000lx，培养温度为室温，优选25℃，由此生根率最高可达95％，平均生根条数为2.37，诱导生成的根比较粗壮。
在上述方案的基础上，第六步中，将生根试管苗至于自然环境中6～10天，一般为一周，取出洗净，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭与珍珠岩的混合基质中，一般草炭与珍珠岩的混合比例为1∶1，起始6～10天(一般为一周)内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95％左右，并适当遮阳，其后(约二周后)按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照。
本发明的有益效果是：
本发明对加快茛力花的繁殖速度，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导出不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系，年繁殖系数由自然状态下的1∶5，提高到1∶16000000，成本由原来的8～10元每株，降低至1～2元每株。且不受季节限制，环境易控，适合全国各地，解决了茛力花繁殖慢、种苗参差不齐等问题。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的茛力花种苗品质高，一致性好，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
一种茛力花离体培养和快速繁殖的方法，去茛力花外植体经初始培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得试管苗，进行移栽，包括下述步骤：
第一步：于天气晴朗的中午，选择生长健壮，无病虫害茛力花的短缩茎做为外植体，短缩茎长度为0.5～1cm，茛力花短缩茎比较肥大，又深埋于地下，感染土壤中各种微生物比较多，消毒非常困难，经过反复实验，得到以下最佳外植体处理方式：自来水冲洗干净，去掉叶片和肥厚的肉质根，切为直径大约0.5cm，高度大约0.5cm的近圆柱状，短缩茎生长点位于中央，并留2片极短的叶柄基部保护中间的生长点，以减弱消毒处理时消毒液对生长点分生细胞的伤害。先用72％的酒精消毒40s，无菌水冲洗3次，再用0.2％升汞液(加数滴吐温80)浸15min，无菌水冲洗至消毒液无残留。
第二步：在无菌环境下，切除与消毒剂接触过的外植体的切面，接种到初始培养基MS+6-BA0.2mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1上，培养基pH调为5.8左右，一个试管接种一个，避免交叉感染，于光周期为12h/d，光照强度为2000lx，培养温度为25℃的无菌室内培养25天；
无菌操作室在使用前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，紫外灯在关闭10分钟后，才可进行接种操作；接种用具在121℃条件下高压灭菌35分钟，培养基在121℃条件下高压灭菌18分钟。
第三步：采用MS为基本培养基，附加激素6-BA、NAA、IAA，共设计了12种培养基配方。将生长健壮一致的无菌苗分别转到上述培养基中，培养1个月后统计结果。表1结果表明，茛力花增殖需要浓度较高的细胞分裂素，当BA为1mg·L-1时，增殖速度非常缓慢，当BA浓度为3mg·L-1时，对茛力花丛生芽的增殖效果最好，而当浓度达到5mg·L-1时，茛力花又非常容易出现玻璃化的畸形现象。添加生长素对茛力花的增殖有促进作用，NAA和IAA二者相比，NAA对茛力花丛生芽增殖的效果略好于IAA。综合考虑激素种类和浓度，MS+BA3mg·L-1+NAA1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1培养基是茛力花增殖的最佳培养基，在该培养基上茛力花的月增殖系数为4.65，产生的丛生芽发育正常，叶色浓绿，长势旺盛，无玻璃化现象，可以做为茛力花扩繁增殖的培养基，增殖培养的周期为30天。
表1不同激素及其浓度对芽增殖的影响
注：增殖系数＝增殖苗数/接种数
各培养基均包含蔗糖30g·L-1和琼脂6g·L-1。
第四步：在增殖培养基上，茛力花试管苗生长高度参差不齐，将丛生芽分切后，转移至壮苗培养基MS+6-BA 0.2mg·L-1+IBA 0.2mg·L-1
+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1中培养20天左右，试管苗普遍长至2cm高时，就可以用来诱导生根。
第五步：大量元素减半的1/2MS比MS更有利于生根，表2结果表明，蔗糖含量为20g·L-1时，也能够提高生根率及平均生根数。当NAA浓度为2mg·L-1时，生根率比较低；当上调至6mg·L-1时，生根率虽然可以达到100％，但是在试管苗的基部容易出现愈伤化组织，不利于后期的移栽；当NAA浓度为4mg·L-1时，生根率最高达到95％，平均生根条数为2.37，诱导生成的根比较粗壮，没有玻璃化等不良现象。茛力花生根最适培养基确定为1/2MS+NAA4mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6g·L-1。
表2不同培养基对根诱导的影响
注：生根率＝生根试管苗数/接种数
平均生根数＝生根总条数/生根试管苗数
各培养基均包含琼脂6g·L-1。
第六步：将茛力花生根试管苗置于自然环境一周后，再从瓶中取出，用自来水洗净根部的培养基，洗时注意保护根不被折断，并且要彻底洗净根上的琼脂，以免腐烂而影响成活率；用500倍托布津水溶液浸泡根部数秒钟，然后移栽到草炭∶珍珠岩＝1∶1的基质中。移栽一周内，采用喷雾保持叶面湿润状态，相对湿度控制在95％左右，并适当遮阳，二周后按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光强至全光照。茛力花成活率可以达到90％。
采用本发明所提供的方法，对加快茛力花的繁殖速度，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导出不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。年繁殖系数由自然状态下的1∶5，提高到1∶16000000，成本由原来的8～10元每株，降低至1～2元每株。且不受季节限制，环境易控，适合全国各地，解决了茛力花繁殖慢、种苗参差不齐等问题。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的茛力花种苗品质高，一致性好，具有广阔的市场前景。
Claims (6)
1.一种茛力花离体培养和快速繁殖的方法，取茛力花外植体经初始培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得试管苗，进行栽种，其特征在于包括下述步骤：
第一步：取茛力花短缩茎作为外植体，并对外植体进行清洗消毒处理；
第二步：将外植体接种到初始培养基中，进行初始培养，获得初代培养的无菌苗，所述的初始培养基为MS+6-BA0.15～0.25mg·L-1+NAA0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1；
第三步：将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+6-BA2.5～3.5mg·L-1+NAA0.8～1.5mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1，诱导不定芽；
第四步：将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养，所述的壮苗培养基为MS+6-BA0.15～0.25mg·L-1+IBA0.15～0.25mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～8g·L-1；
第五步：将经壮苗培养生长到1.5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中获得生根试管苗，该生根培养基为大量元素减半的1/2MS+NAA3.5～4.5mg·L-1+蔗糖15～25g·L-1+琼脂4～8g·L-1；
第六步：对所得的生根试管苗进行清洗，移栽到草炭与珍珠岩的混合基质中进行栽种；
其中，第一步中，切取包含生长点外植体，为长度0.5～1cm，直径0.3～0.6cm的圆柱体，进行清洗消毒处理后接种，所述的清洗消毒处理的方法包括：取茛力花短缩茎，用水冲洗干净，去除叶片和肉质根，切成圆柱体，并使短缩茎的生长点位于圆柱体的中央，保留数片叶柄基部保护生长点，先用60～80％浓度的酒精消毒30～60s，再用无菌水冲洗3～4次，然后用加有2～4滴吐温80的0.1～0.2％的升汞液浸泡15～30分钟，无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。
2.根据权利要求1所述的茛力花离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：所述的初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养的培养条件均为无菌室内光周期为10～15h/d，光照强度1500～2500lx，培养温度为室温。
3.根据权利要求1或2所述的茛力花离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：第三步中，所述的增殖培养基为MS+6-BA3mg·L-1+NAA1mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂6g·L-1。
4.根据权利要求1或2所述的茛力花离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：第五步中，所述的生根培养基为大量元素减半的1/2MS+NAA4mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂6g·L-1。
5.根据权利要求1或2所述的茛力花离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：第六步中，将生根试管苗置于自然环境中6～10天，取出洗净，用500～600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭与珍珠岩的混合基质中，起始6～10天内保持苗的叶面湿润并适当遮阳，其后按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。
6.根据权利要求2所述的茛力花离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：所述初代培养的周期为22～28天，增殖培养的周期为28～32天，壮苗培养的周期为18～22天。
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