CN109329060B - 以换锦花石蒜鳞茎盘为外植体进行组培快繁的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种以换锦花石蒜鳞茎盘为外植体诱导不定芽获取再生植株的方法，包括下述步骤：外植体的选取与消毒、不定芽诱导、继代培养与增殖、根的诱导、组培苗移栽。本发明方法诱导萌动率达到98%，初代单株增殖不定芽15倍以上，生根率达到99%，通过该方法能够有效的解决换锦花石蒜离体快速繁殖的问题。

Description

以换锦花石蒜鳞茎盘为外植体进行组培快繁的方法

技术领域

本发明涉及换锦花石蒜（Lycoris sprengeri Comes ex Baker）组织培养繁殖方法，属于草本观赏植物种苗繁殖的技术领域。

背景技术

换锦花石蒜（Lycoris sprengeri Comes ex Baker）是石蒜科石蒜属的一种。多年生草本植物。地下茎肥厚。鳞茎卵形，直径约3.5厘米。早春出叶，叶带状。花茎高约60厘米；总苞片2枚；伞形花序有花4-6朵；花淡紫红色，花被裂片顶端常带蓝色，倒披针形，边缘不皱缩。花期8-9月。性喜阴湿环境，怕强光直射，宜生长于疏松肥沃的沙壤土。原产于中国和日本，世界各地广为栽培。是优良的宿根草本花卉，园林中常用作背阴处绿化，可作花坛或花径材料，亦是美丽的切花。鳞茎有毒，入药有催吐、祛痰、消肿、止痛之效。

目前该品种种苗数量在国内非常少，相关研究表明换锦花石蒜在自然状态下分球繁殖系数很低，而种子繁殖无法保证花色的遗传性状，因此换锦花石蒜资源紧缺，其应用受到了限制。

有关换锦花石蒜及其同属植物的组织培养，国内外鲜有报道。单卓以鳞茎为外植体，进行了香石蒜组培快繁的研究（香石蒜的组培快繁技术研究，园林科技，2012年第3期，8-11页）。朱锦等以石蒜的鳞茎为材料研究了小鳞茎的分化和增殖（石蒜组培繁殖技术的研究，浙江林业科技，2002年第4期，45-48页）。以往研究均得到了石蒜属其他种的增殖培养基和生根培养基，多以鳞茎为外植体，常出现污染率高和增殖率相对比较低的问题。而高增殖率低污染率的石蒜属植物组织培养快速繁殖方法尚未建立。发明人前期以红花石蒜花序轴为外植体建立了该种的离体快繁体系，然而同一技术在同属不同种的应用上存在差异，简单套用存在诱导效果不佳的效果，且换锦花石蒜的种源数量相比红花石蒜，更加稀缺，花期可取的花序轴更加有限，因此花序轴途径不适用于换锦花石蒜。

综上所述，采取组织培养繁殖换锦花石蒜是解决换锦花石蒜资源短缺的重要途径之一，对换锦花石蒜的开发和推广利用都有着非常重要的意义。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是公开了以换锦花石蒜鳞茎盘为外植体进行植株离体再生的方法。

为解决该技术采用如下的技术方案：

A）外植体选择与消毒，选取换锦花石蒜生长期的鳞茎盘为外植体，消毒方法用洗涤剂振摇15min，流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒90s，再用0.2%的升汞消毒25min，最后用无菌水洗涤5次，每次洗1min；

步骤B）不定芽的诱导：消毒后的外植体进行1分4切割，保留鳞茎长度8-12mm，接种于诱导培养基(组分为：MS+6-BA 2.5mg/L +玉米素0.3mg/L + NAA 0.2mg/L)中进行不定芽诱导，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx；

步骤C）继代培养与增殖：将步骤B）中所得换锦花石蒜不定芽切割后接入继代培养基（组分为：MS+6-BA 2mg/L +NAA0.05 mg/L）中进行继代培养，光照强度为1600-1800lx；

步骤D）根的诱导：将经过步骤C）培养后的换锦花石蒜试管苗剥离至单芽后接入生根培养基（组分为1/2MS+IBA 0.6 mg/L）中进行生根培养，获得组培苗;

步骤E）组培苗移栽：将瓶盖打开，组培苗炼苗2天，将组培苗的根浸泡在复合微生物制剂中10min，移栽入基质中。

所述复合微生物制剂为：按照凝结芽胞杆菌发酵液：黄绿木霉发酵液：产黄纤维单胞菌：粪产碱杆菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠重量比＝3：1：2：3：4：1的比例制备。

所述凝结芽胞杆菌 CICC 10069；

所述黄绿木霉为黄绿木霉ACCC32248；

所述产黄纤维单胞菌具体为产黄纤维单胞菌ACCC04313；

所述粪产碱杆菌为粪产碱杆菌ATCC 31555。

首先将4种微生物分别按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到10⁷个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例3：1：2：3混合，按照重量配比添加草炭、磷酸氢二钠即得。

本发明相对现有技术的有益效果为：换锦花石蒜繁殖通常采用分植鳞茎繁殖，3-4年分栽一次，增殖率非常低。而采用本发明组织培养的方法对换锦花石蒜进行繁殖，能够有效的得到大量无菌苗，解决换锦花石蒜快速繁殖的问题；通过对外植体消毒、诱导培养基、继代培养基及生根培养基的选取，能够使得诱导萌动率达到98%，单株增殖不定芽15倍以上，生根率达到99%，增殖率和移栽成活率高，能够高效的得到换锦花石蒜种苗。

具体实施方式

实施例1

外植体筛选

以换锦花石蒜鳞茎盘、花序轴和花瓣基部3个部位为外植体，比较不同部位外植体的污染率以及对诱导不定芽的影响。

消毒方法均采用“洗用洗涤剂振摇15min，流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒90s，再用0.2%的升汞消毒25min，最后用无菌水洗涤5次，每次洗1min；”。培养于诱导培养基MS+6-BA 2.5mg/L +玉米素0.3mg/L + NAA 0.2mg/L。每处理接外植体100个，30d后统计污染率、诱导率和诱导倍数。

试验结果见表1，从表1可以看出污染率最低的外植体为花序轴，诱导率高和不定芽倍数高的外植体为鳞茎盘。

表1 外植体部位对换锦花石蒜诱导不定芽的影响

外植体部位	污染率%	诱导率%	不定芽倍数
				鳞茎盘	31.55	97.98	15.01
花序轴	23.92	76.14	5.73
				花瓣基部	27.86	34.43	3.14

通过实验发现，针对换锦花石蒜，最佳的诱导外植体为鳞茎盘。

实施例2

诱导培养基筛选

以鳞茎盘为外植体，消毒处理后，接种于含不同激素配比的诱导培养基上，比较不同培养基对诱导不定芽的影响。观察外植体发育情况，30d后统计不定芽诱导率和诱导倍数。

从表2可看出，在MS+6-BA 2.5mg/L +玉米素0.3mg/L + NAA 0.2mg/L培养基上，外植体发育最好，诱导率最高，诱导不定芽数最多。

表2 诱导培养基对换锦花石蒜诱导不定芽的影响

培养基配方	诱导率%	不定芽倍数
			MS+玉米素 2mg/L +NAA0.2 mg/L	80.41	6.84
MS+KT 2mg/L +NAA0.2 mg/L	77.44	5.12
			MS+6-BA 2.5mg/L +玉米素0.3mg/L + NAA 0.2mg/L	97.98	15.01
MS+6-BA 2mg/L +玉米素0.3mg/L + GA<sub>3</sub>0.2mg/L	80.28	6.97

实施例3

消毒方法筛选

换锦花石蒜为宿根类花卉，所取外植体为地下部分，污染率控制比较难。为降低外植体污染率，发明人在以往研究的基础上，比较不同消毒方法组合对外植体污染率的影响。首先比较酒精消毒时间，鳞茎进行预处理后，分别采用75%酒精处理30s，90s和150s，然后0.2%升汞处理15min。其次，比较升汞消毒时间，采用安利洗涤液震荡浸泡15min，转至无菌操作台上，用75%酒精浸泡90s。再用0.2%升汞分别处理15min，25min和35min，对换锦花石蒜外植体进行消毒处理。所有消毒处理的外植体接入不定芽诱导培养基。具体实验设计见表3。

从试验结果可以看出酒精消毒处理对污染控制的影响不显著，而升汞消毒时间对污染控制影响显著。最佳的消毒方法为安利洗涤液震荡浸泡15min，转至无菌操作台上，用75%酒精浸泡90s。再用0.2%升汞分别处理25min。

表3 不同消毒方法对换锦花石蒜污染控制的影响

酒精处理时间/s	升汞处理时间/min	接种数/个	污染率/%	死亡率/%
					30	15	100	83	0
90	15	100	75	5
					150	15	100	3	87
90	15	100	80	6
					90	25	100	14	18
90	35	100	15	40

实施例4复合微生物菌剂的筛选：

移栽时，凝结芽胞杆菌、黄绿木霉、产黄纤维单胞菌和粪产碱杆菌形成一个良好的微生态系统，各菌种之间合理配伍，共生协调，互不拮抗，微生物分泌根系促生素和抑菌素能够呵护幼苗根系感染腐霉根腐病、疫霉根腐病、细菌性根腐病和茎基腐病及立枯病、猝倒病等苗期病害,从而有效控制苗期的死苗烂棵现象，磷酸氢二钠给根系源源不断供给营养，维持苗强苗壮势头，极大的提高植株的适应性，提高整个成活率，经单因子试验表明，组培苗根部经过该促进剂浸泡后，移栽成活率较之不经过任何处理，成活率大大提高。

本申请同样研究了生物制剂成分之间协同作用

将凝结芽胞杆菌：黄绿木霉发酵液：产黄纤维单胞菌：粪产碱杆菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠的重量比＝3：1：2：3：4：1混匀制备的复合微生物菌剂作为实验组；

对照一组：不添加凝结芽胞杆菌，其余同实验组；

对照二组：采用淡紫灰链霉菌发酵液：黄绿木霉发酵液：假丝酵母菌发酵液：粪产碱杆菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠的重量比＝2：3：4：3：5：2混匀制备的复合微生物菌剂作为实验组；

对照三组：不添加黄绿木霉、粪产碱杆菌，其余同实验组；

对照四组：不添加产黄纤维单胞菌，其余同实验组；

空白对照组：用超纯水浸泡。

表4生物菌剂对移栽成活的影响

	空白对照组	对照一组	对照二组	对照三组	对照四组	实验组
							移栽成活率	55.3%	72.4%	64.8%	70.6%	77.3%	91.5%

实施例5

1、外植体选择与消毒：于5月底，选取换锦花石蒜生长期的10个鳞茎盘为外植体，消毒方法用洗涤剂溶液振摇15min，流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒90s，再用0.2%的升汞消毒25min，最后用无菌水洗涤5次，每次洗1min，切割后，共处理40个外植体；

2、不定芽的诱导：消毒后的外植体进行1分4切割，保留鳞茎长度8-12mm，接种于诱导培养基(组分为：MS+6-BA 2.5mg/L +玉米素0.3mg/L + NAA 0.2mg/L)中进行不定芽诱导；首先在黑暗中培养24h，然后进行正常培养30天，所述正常培养为：光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx，30天后外植体诱导率为97.98%，平均每个外植体增殖15.01个；

3、继代培养与增殖：将换锦花石蒜不定芽苗切割后接入继代培养基MS+6-BA 2mg/L +NAA0.05mg/L中，每瓶接种1个，进行继代培养25天，培养温度24-26℃，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx，培养25天后，继代增殖倍数为3.6倍，可得无菌苗1821株，再进行继代1次后得无菌苗6555株；

4、根的诱导：将继代培养所得锦花石蒜试管苗接入生根培养基1/2MS+IBA 1.0mg/L中进行生根培养15天，培养温度24-26℃，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx，生根率达99%，至此共得6490株。

5、将培养瓶移出组培室，将瓶盖打开，组培苗炼苗2天，将组培苗的根浸泡在复合微生物制剂中，10min，移栽入基质中。

所述复合微生物制剂为：按照凝结芽胞杆菌发酵液：黄绿木霉发酵液：产黄纤维单胞菌：粪产碱杆菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠重量比＝3：1：2：3：4：1的比例制备。

所述凝结芽胞杆菌 CICC 10069；

所述黄绿木霉为黄绿木霉ACCC32248；

所述产黄纤维单胞菌具体为产黄纤维单胞菌ACCC04313；

所述粪产碱杆菌为粪产碱杆菌ATCC 31555。

首先将4种微生物分别按照常规方式活化，然后培养至菌液中活菌数达到10⁷个/克获得发酵液，将上述发酵液按照质量比例3：1：2：3混合，按照重量配比添加草炭、磷酸氢二钠即得。

60d后，统计移栽成活率为91.5%。

1个培养周期157d左右，可由4个鳞茎增殖出5938株植株，能够大大填补市场空白。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.以换锦花石蒜鳞茎盘为外植体进行组培快繁的方法，其特征在于，包括下述步骤：

A）外植体选择与消毒，选取换锦花石蒜生长期的鳞茎盘为外植体，消毒方法用洗涤剂振摇15min，流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒90s，再用0.2%的升汞消毒25min，最后用无菌水洗涤5次，每次洗1min；

步骤B）不定芽的诱导：消毒后的外植体进行1分4切割，保留鳞茎长度8-12mm，接种于诱导培养基中进行不定芽诱导，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx；所述诱导培养基组分为：MS+6-BA 2.5mg/L +玉米素0.3mg/L + NAA 0.2mg/L；

步骤C）继代培养与增殖：将步骤B）中所得换锦花石蒜不定芽切割后接入继代培养基中进行继代培养，光照强度为1600-1800lx；所述继代培养基组分为：MS+6-BA 2mg/L +NAA0.05 mg/L；

步骤D）根的诱导：将经过步骤C）培养后的换锦花石蒜试管苗剥离至单芽后接入生根培养基中进行生根培养，获得组培苗；所述生根培养基组分为1/2MS+IBA 0.6 mg/L；

步骤E）组培苗移栽：将瓶盖打开，组培苗炼苗2天，将组培苗的根浸泡在复合微生物制剂中10min，移栽入基质中；

所述复合微生物制剂为：按照凝结芽胞杆菌发酵液：黄绿木霉发酵液：产黄纤维单胞菌：粪产碱杆菌发酵液：草炭：磷酸氢二钠重量比＝3：1：2：3：4：1的比例制备。