CN116098063B - 一种石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于组织培养育苗技术领域，具体公开了一种石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法及应用，本发明通过对石蒜的实验和研究，建立了石蒜属植物组培快速繁殖体系和优化快速繁殖技术，进一步解决组培扩繁技术存在的问题，达到在不消耗石蒜母球(鳞茎)的前提下，使用石蒜叶鞘部分进行组织培养，从而构建试管苗再生体系。本发明一方面保持组培扩繁技术的快速繁殖速度，另一方面加强对外植体的利用效率，进一步扩大石蒜属植物外植体的选择范围。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养育苗技术领域，具体公开了一种石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法及应用。
背景技术
石蒜属(Lycoris spp.)是石蒜科多年生草本植物，全世界总共有石蒜属原种约30种，我国是石蒜属植物分布中心，中国分布有石蒜属植物约18种，12种为我国特有。我国有6种(长筒石蒜、短蕊石蒜、安徽石蒜、稻草石蒜、江苏石蒜和广西石蒜)被列入《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》(简称红色植物名录)。石蒜的花朵形似百合，具有较高的园艺价值。
随着我国社会人口的老龄化日益严重，老年痴呆症发病率呈上升趋势，市场需要大量治疗及治愈老年痴呆症的有效药物。而石蒜科植物中的生物碱-加兰他敏是一种有效的、具有竞争性和可逆的乙酰胆碱酶抑制剂，易通过血脑屏障进入脑组织，对中枢神经作用较强，对于治疗阿尔兹海默症具有良好的药效，所以石蒜可以作为加兰他敏原料药的天然来源。除加兰他敏外，石蒜属植物还含有其他生物碱，如石蒜伦碱、维他廷、石蒜碱和力可拉敏等，且它们均具有重要的药用价值，因此石蒜属植物的人工栽培蕴含巨大的市场前景和社会效益。
然而石蒜属植物生长缓慢,主要以自然分球进行繁殖，繁殖系数仅为1～2，子球从形成到开花需2～3年，且种子成熟度差，因其无法在短时间内进行大量快速繁殖,种球的供应仍以野生资源为主。而且由于近年来的过度开发，野生石蒜资源濒临枯竭,石蒜市场出现优良种类供不应求的现象,该情况严重制约着石蒜属植物的推广和应用。营养生长期长、自然繁殖系数低是制约我国石蒜属植物规模化生产繁育的两个重要问题。目前，有关石蒜属植物组培扩繁体系均以成熟鳞茎为外植体实现植株再生，多采用鳞茎块或双鳞片形式，其缺陷主要有三点：一是由于成熟鳞茎长期生活于自然土壤环境，携带细菌、真菌等较多，组培污染率极高；二是挖取成熟鳞茎作为外植体，造成了对石蒜属植物野生种球资源的破坏与浪费；三是通过鳞片诱导不定芽，特别是双鳞片法，诱导率较低，同时诱导周期较长。
发明内容
本发明的目的是提供了一种石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗快繁方法及应用，在保证组培繁殖速度的同时，以叶鞘为外植体，避免切割鳞茎时造成污染，做到不消耗石蒜母球(鳞茎)，扩大外植体的选择范围。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为；
一种石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法，包括以下步骤：
步骤S1：将石蒜种子去种皮，消毒后，组培萌发成原生小鳞茎；
步骤S2：取无菌原生小鳞茎的叶鞘，切成小段，接种在不定芽诱导培养基上诱导不定芽产生；
步骤S3：不定芽诱导出来以后，切下接种到不定芽增殖培养基上，进行增殖培养，使不定芽数目增多；
步骤S4：再将增殖后的不定芽，切下接种到小鳞茎膨大培养基上，使小鳞茎快速生长膨大成球，形成试管苗。
作为本发明的进一步说明，所述的一种石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法，具体包括以下步骤：
步骤S1：将石蒜种子去种皮，消毒后，接种到原生小鳞茎培养基上，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为50μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，进行20～30天的培养后，种子萌发形成原生鳞茎；
步骤S2：取无菌原生小鳞茎的叶鞘，切成小段，接种在不定芽诱导培养基上在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为25μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，培养20～30天，诱导不定芽产生；
步骤S3：不定芽诱导出来以后，切下接种到不定芽增殖培养基上，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为25μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，培养8-10周，进行增殖培养，使不定芽数目增多；
步骤S4：再将增殖后直径为2～5mm的不定芽，切下基盘朝下接种到小鳞茎膨大培养基上，每个膨大培养基接种4～6个不定芽，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为50μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，使小鳞茎快速生长膨大成球，即获得显著膨大的小鳞茎，直径在8～12mm之间，形成试管苗。
更优选的，所述石蒜为石蒜科石蒜属植物长筒石蒜(Lycoris longituba)、中国石蒜(Lycoris chinensis Traub)、换锦花(Lycoris sprengeriComes ex Baker)或忽地笑(Lycoris aurea(L'Herit)Herb)；所述步骤S1中，于结实期选取石蒜成熟种子作为外植体。步骤S1中，所述消毒包括以下步骤：将剥好皮的种子流水冲1h，用200mg/L的头孢水冲洗2次之后放入超净工作台中，接着使用75％的酒精洗30s，0.5％的苯扎溴铵洗15min，无菌水清洗3次；清洗期间不停的摇晃。
所述步骤S1中，将消毒后的石蒜种子接种到已灭菌的MS+1mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8的原生小鳞茎培养基上进行培养原生小鳞茎。
更优选的，所述步骤S2中，将原生小鳞茎的叶鞘切成0.2-0.5cm的小段；在MS+5.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA，30g/L蔗糖，琼脂6g/L，pH值5.8的不定芽增殖培养基上进行不定芽诱导培养筛选。
更优选的，步骤S3中，将筛选出的不定芽移植到MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，30g/L蔗糖，琼脂6g/L，pH值5.8的不定芽增殖培养基上进行不定芽的增殖。
更优选的，步骤S4中，所述将增殖完成的小鳞茎接种到MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂的小鳞茎膨大培养基上进行膨大培养，形成试管苗。
作为本发明的进一步说明，本发明还提供了所述的方法在石蒜属植物的品种选育、组培快繁或工厂化种苗生产中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明在不消耗石蒜母球(鳞茎)的前提下，使用石蒜叶鞘部分进行组织培养，构建了石蒜属植物试管苗再生体系和组培快速繁殖体系。一方面保持组培扩繁技术的快速繁殖速度，另一方面加强对外植体的利用效率，进一步扩大石蒜属植物外植体的选择范围。优化了目前石蒜组培扩繁技术仍存在的许多问题，例如原本埋在土中的外植体不易彻底消毒，造成后期染菌；石蒜母球(鳞茎)在切割过程中渗出黏液，容易被污染浪费等。
2)组织培养快繁技术一般常用的方法是通过进行诱导愈伤组织再诱导不定芽，但这种方法存在的问题是：①随着继代次数增多，愈伤组织的再生能力显著退化；②经愈伤组织阶段，变异率高；本申请的石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法不通过愈伤组织阶段，没有变异的风险。
3)本发明的方法简易，更易应用于生产，可在石蒜品种选育、组织培养快繁和工厂化种苗生产中应用。可用于石蒜种质资源的保存和扩繁，在有效保存种质的同时，增加种质资源的繁殖量，可有效提高种质资源分发和利用效率。
4)本发明的组培快繁方法具有繁殖速度快，繁殖系数大，繁殖方式多，繁殖后代整齐一致；能保持原有品种的优良性状；可获得无毒苗；可进行工厂化生产；经济效益高；可以很大程度上缩小季节、气候、病虫害等因素对石蒜生长繁殖的影响等特点。构建了组培脱毒技术体系，对优良品种提纯复壮，获得优质原种；建立高效无性繁育体系，满足市场对优质无性系种苗的需要等，非常适用于当今商业化生产的需求，对石蒜属植物的开发利用也有重大的意义。
附图说明
图1为实施例2中不同6-BA和NAA浓度对不定芽诱导影响的结果图；
图2为实施例3中不同6-BA和NAA浓度对不定芽增殖影响的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
选取结实期长筒石蒜(Lycoris longituba)成熟种子作为外植体，根据前期摸索好的消毒条件，将剥好皮的种子流水冲1h，用200mg/L的头孢水冲洗2次之后放入超净工作台中，接着使用75％的酒精洗30s，0.5％的苯扎溴铵洗15min，无菌水清洗3次。清洗期间不停的摇晃，将其接种到已灭菌原生小鳞茎培养基上，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为50μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，进行20～30天的培养后，种子萌发形成原生鳞茎；采用原生小鳞茎培养基的组成为：MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8；取得了良好的结果。
实施例2
将实施例1获得的无菌原生小鳞茎的叶鞘切成0.2-0.5cm的小段；接种在不同浓度配比的6-BA和NAA植物生长调节剂组合培养基中(见表1)，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为25μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，培养20～30天，进行不定芽诱导培养筛选，以筛选出增殖效果最佳及生长高的培养基，所述的不定芽增殖培养基的pH5.8。
表1不同6-BA和NAA浓度配比对不定芽诱导的影响
结果分析：外植体接种到A1-A9培养基中，20-30天左右形成不定芽。由表1、图1可知，不同浓度配比的激素组合对不定芽的诱导具有不同的促进效果，各处理之间的诱导率具有显著的差异。其中不定芽诱导率最低的是A3培养基，诱导率最高的是A8培养基，达到79.1％。因此，筛选出对于长筒石蒜不定芽诱导效果最佳的培养基为MS+5.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA，30g/L蔗糖，琼脂6g/L。
实施例3
将实施例2中不定芽诱导出来以后，切下接种到不同浓度配比的6-BA和NAA植物生长调节剂组合培养基中(见表2、图2)，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为25μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，培养8-10周，进行增殖培养以筛选出增殖效果最佳及生长高的培养基。其中用于接种的不定芽增殖培养基以MS培养基为基本培养基，还含有浓度为30g/L的蔗糖、6g/L琼脂，培养基的pH值为5.8。
表2不同6-BA和NAA浓度配比对不定芽增殖的影响
| 编号 | 培养基 | 琼脂(g/L) | 蔗糖(g/L) | 6-BA(mg/L) | NAA(mg/L) | 增殖系数 |
| B1 | MS | 6 | 30 | 1 | 0.2 | 2.1 |
| B2 | MS | 6 | 30 | 1 | 0.5 | 2.7 |
| B3 | MS | 6 | 30 | 1 | 1.0 | 3.1 |
| B4 | MS | 6 | 30 | 2 | 0.2 | 4.5 |
| B5 | MS | 6 | 30 | 2 | 0.5 | 3.7 |
| B6 | MS | 6 | 30 | 2 | 1.0 | 3.5 |
| B7 | MS | 6 | 30 | 3 | 0.2 | 3.9 |
| B8 | MS | 6 | 30 | 3 | 0.5 | 5.4 |
| B9 | MS | 6 | 30 | 3 | 1.0 | 4.6 |
结果分析：不定芽的增殖激素为6-BA和NAA，不同浓度配比的6-BA和NAA植物生长调节剂的种类和浓度对不定芽的增殖具有显著的影响。由表2、图2可知，不同浓度配比的激素组合对不定芽的增殖具有不同的促进效果，各处理之间的增殖系数具有显著的差异。其中增殖系数最低的是B1培养基，诱导率最高的是B8培养基。因此，筛选出对于长筒石蒜不定芽增殖效果最佳的培养基为：MS+3mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，30g/L蔗糖，琼脂6g/L
实施例4
将实施例3增殖后直径为2～5mm的不定芽，切下基盘朝下接种到小鳞茎膨大培养基上，每个膨大培养基接种4～6个不定芽，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为50μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，使小鳞茎快速生长膨大成球，进行鳞茎膨大培养以筛选出膨大效果最佳及生长高的培养基。
表3不同小鳞茎膨大培养基对石蒜苗的影响
结果表明，采用MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+40g/L蔗糖+8g/L琼脂的小鳞茎膨大培养基上进行膨大培养，小鳞茎可快速膨大生根，直径在8～12mm之间，形成的试管苗可作为生产用的繁殖原始材料直接移入大田种植，试管苗成活率95％以上。
在上述实验的同时，本申请将该石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法，对中国石蒜(L.chinensis)、长筒石蒜(L.longituba)、安徽石蒜(L.anhuiensis)、稻草石蒜(L.strarninea)、中国石蒜(L.chinensis)、忽地笑(L.aurea)、玫瑰石蒜(L.rosea)和换锦花(L.sprengeri)等数10种的原种或二倍体种都进行了系统的实验研究，取得了同样的技术效果，表明本发明的石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法可以适用于所有的石蒜科石蒜属植物，对世界上的石蒜科石蒜属植物的品种选育、组培快繁或工厂化种苗具有重要意义。
本发明围绕建立石蒜属植物组培快速繁殖体系和优化快速繁殖技术展开，通过对10多种属石蒜科石蒜属植物的实验和研究，进一步解决组培扩繁技术存在的问题，达到在不消耗石蒜母球(鳞茎)的前提下，使用石蒜叶鞘部分进行组织培养，从而构建试管苗再生体系。本发明一方面保持组培扩繁技术的快速繁殖速度，另一方面加强对外植体的利用效率，进一步扩大石蒜属植物外植体的选择范围。
以上所述仅是对本发明的实施方式的举例展示，并非对本发明作任何形式上的限制。本发明保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施例所限，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何简单修改或等同变化与修饰均属于本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种长筒石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤S1：将石蒜种子去种皮，消毒后，接种到已灭菌的MS+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.8的原生小鳞茎培养基上，组培使萌发成原生小鳞茎；
步骤S2：取无菌原生小鳞茎的叶鞘，切成小段，接种到MS+5.0mg/L 6-BA+1mg/L NAA，30g/L蔗糖，琼脂6g/L，pH值5.8的不定芽诱导培养基上诱导不定芽产生；
步骤S3：不定芽诱导出来以后，将筛选出的不定芽切下接种到MS+3mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA，30g/L蔗糖，琼脂6g/L，pH值5.8的不定芽增殖培养基上，进行增殖培养，使不定芽数目增多；
步骤S4：再将增殖后的不定芽，切下接种到MS+2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂的小鳞茎膨大培养基上，使小鳞茎快速生长膨大成球，形成试管苗。
2.根据权利要求1所述的长筒石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法，其特征在于具体包括以下步骤：
步骤S1：将石蒜种子去种皮，消毒后，接种到原生小鳞茎培养基上，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为50μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，进行20～30天的培养后，种子萌发形成原生鳞茎；
步骤S2：取无菌原生小鳞茎的叶鞘，切成0.2-0.5cm的小段，接种在不定芽诱导培养基上在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为25μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，培养20～30天，诱导不定芽产生；
步骤S3：不定芽诱导出来以后，切下接种到不定芽增殖培养基上，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为25μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，培养8-10周，进行增殖培养，使不定芽数目增多；
步骤S4：再将增殖后直径为2～5mm的不定芽，切下基盘朝下接种到小鳞茎膨大培养基上，每个膨大培养基接种4～6个不定芽，在温度为25±2℃、pH值为5.8、光照强度为50μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1的组培条件下，使小鳞茎快速生长膨大成球，即获得显著膨大的小鳞茎，直径在8～12mm之间，形成试管苗。
3.根据权利要求2所述的长筒石蒜叶鞘诱导试管小鳞茎的试管苗的快繁方法，其特征在于：步骤S1中，所述消毒包括以下步骤：将剥好皮的种子流水冲1h，用200mg/L的头孢水冲洗2次之后放入超净工作台中，接着使用75％的酒精洗30s，0.5％的苯扎溴铵洗15min，无菌水清洗3次；清洗期间不停的摇晃。
4.权利要求1-3任一所述的方法在长筒石蒜的品种选育、组培快繁或工厂化种苗生产中的应用。
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