CN114568305B - 一种夏栎组织培养提高再生效率的处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，包括以下步骤：首先对夏栎种子进行预处理，随后进行诱导无菌苗，随后将诱导出的无菌苗新芽分割成单株无菌苗，并分别接种在增殖培养基中增殖培养，随后进行生根培养；将去掉子叶的子叶胚接种到愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导获得紧密的愈伤组织，把紧密的愈伤组织进行体胚诱导。通过对夏栎种子进行消毒处理培育获得无菌苗，可有效避免直接对夏栎幼苗直接消毒对后续试验中所需材料幼嫩茎段造成的损伤，提高试验成功率；同时在带子叶的合子胚培养出无菌苗，并切掉无菌苗转入诱导培养后，把自身的子叶切掉继续培养，并全程暗培养，进一步提高夏栎组织培养的再生效率。

Description

一种夏栎组织培养提高再生效率的处理方法

技术领域

本发明涉及植物培养技术领域，特别是涉及一种夏栎组织培养提高再生效率的处理方法。

背景技术

夏栎(Quercus robur L.)亦称“夏橡”、“英国栎”，是壳斗科(Fagaceae)栎属(Quercus L.)大型落叶乔木，具有耐盐碱、适应性广泛的特点。在土层较厚、供水条件良好情况下，夏栎长势旺盛、根系健壮，寿命可长达100年。且夏栎是珍贵的园林绿化树种，不仅病虫害少，果还可入药或作饲料，具有极大的育种价值。由于1～3年生的夏栎幼苗主根生长快，侧根发育较慢，导致移栽苗木成活低，缓苗时间长，生根困难。

离体培养技术，能够从离体的组织、器官和细胞中培养出大量再生植株。此方法具有不受季节限制、能够保持品种优良特性、短时高效等优点。目前既已报道出世界上有130个科，超过1 500个种的植物种类能够利用此技术得到再生植株，其中包含木本植物400余种，且随着科学技术的发展仍在不断增多。通过离体培养技术获得再生植株的研究在中国20世纪70年代初就已开始，并早已在国际上处于领先水平，该技术已经成为大量繁殖和保存植物种质资源的有效途径。然而，在国内，由于夏栎在生长量和生长速度方面不如大多数其他栎类树种，导致其繁殖速度慢，数量较少，并且引进困难，因此在相关方面报道较少。

发明内容

针对目前夏栎繁殖速度慢，数量较少，并且引进困难的技术问题，本申请提出了一种夏栎组织培养提高再生效率的处理方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本申请公开了一种夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，包括以下步骤：

S1、首先对夏栎种子预处理，获得带子叶的合子胚作为培养体；

S2、将培养体依次经过流水冲洗、酒精漂洗、无菌水第一次冲洗、升汞浸泡以及无菌水第二次冲洗后，通过无菌吸水纸将培养体上的水分吸干，最后将培养体接种至无菌苗培养基中进行培养诱导无菌苗；

S3、将无菌苗培养基中培养诱导出的无菌苗新芽分割成单株无菌苗，并将单株无菌苗分别接种至增殖培养基中进行增殖培养；

S4、当无菌苗培育至3-4cm高时，将无菌苗接种到生根培养基中进行生根培养；

S5、通过步骤S3获得无菌苗幼嫩茎段外植体，同时把切掉幼嫩茎段以后的带子叶胚去掉子叶，将去掉子叶的子叶胚接种到愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导；

S6、通过步骤S5获得紧密的愈伤组织，将紧密的愈伤组织接种至体胚诱导培养基进行体胚诱导。

本申请通过对夏栎种子进行消毒处理培育获得无菌苗，可有效避免直接对夏栎幼苗直接消毒对后续试验中所需材料幼嫩茎段造成的损伤，提高试验成功率；同时在带子叶的合子胚培养出无菌苗，并切掉无菌苗转入诱导培养后，把自身的子叶切掉继续培养，并全程暗培养，可诱导出愈伤组织并进一步进行体细胞胚发生，进一步提高夏栎组织培养的再生效率。

优选地，所述步骤S2、S3以及S4中具体培养条件为：培养温度(25±1)℃，光照时间16h/d，光照强度1500-2000Lx。

优选地，所述步骤S5和步骤S6均采用暗培养。

优选地，所述步骤S1中夏栎种子选自生长健壮、干形通直、树冠端正、无病虫害、处于壮龄，且耐水淹的优良单株的夏栎植株。

优选地，所述步骤S1中夏栎种子预处理时，首先将外壳去掉，利用手术刀在种子胚上方6-9mm位置处横切掉，获得带有一部分子叶的合子胚。

优选地，所述步骤S2中具体处理方法包括将培养体放置到流水下冲洗两个小时，随后在超净工作台上用75％酒精漂洗30s，然后利用无菌水进行一次冲洗，随后将培养体浸泡在0.1％升汞10min，最后用无菌水进行二次冲洗。

优选地，所述步骤S2中无菌苗培养基的配方为：MS+0.6mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D，PH 5.8；所述步骤S3中增殖培养基的配方为：WPM+0.4mg/L 6-BA，pH 5.8；所述步骤S4中生根培养基的配方为：WPM+0.25mg/L IBA+0.10mg/L NAA，pH 5.8；所述步骤S5中愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA，PH 5.8；所述步骤S6中体胚诱导培养基的配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，PH 5.8。

优选地，所述步骤S2中培养体接种方法包括将吸干水分的夏栎种子接种至含无菌苗培养基的培养瓶中进行培养，每个培养瓶中接种2粒夏栎种子，共接种30瓶，培养3周后观察，并统计夏栎种子发芽率及其污染率。

优选地，所述步骤S2中，将培养20-30天的无菌苗的幼嫩茎段作为外植体，并切成1-2cm，随后将切割后的分段外植体接种于所述步骤S3增殖培养基中培养瓶中进行增殖培养。

与现有技术相比，有益效果在于：

1、通过先对夏栎种子进行消毒，再使消毒后种子萌发以获得夏栎无菌苗，随后利用夏栎无菌苗的幼嫩茎段作为外植体，相较于直接在夏栎幼嫩茎段上进行消毒，可有效避免直接消毒对后续试验中所需材料幼嫩茎段造成损伤，提高试验成功率；

2、通过在特定的培养基中培养夏栎种子，可快速获取无菌苗，且成活率高，本申请处理方法可更大量高效的获得夏栎组培苗，从而有助于提高试验效率；

3、本申请将在带子叶的合子胚培养出无菌苗并切掉无菌苗转入诱导培养后，把自身的子叶切掉继续培养，并全程暗培养，可诱导出愈伤组织并进一步进行体细胞胚发生，进而可进一步提高夏栎组织培养的再生效率，满足市场需求。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的工作流程图。

图2是本发明中夏栎带子叶合子胚诱导苗生长示意图。

图3是本发明中夏栎茎段诱导苗生长示意图。

图4是本发明中增殖苗生长示意图。

图5是本发明中夏栎生根苗生长示意图。

图6是本发明中胚性愈伤组织示意图。

图7是本发明中愈伤组织体胚诱导示意图。

具体实施方式

本申请提出了一种夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，包括以下步骤：

S1、首先对夏栎种子预处理，获得带子叶的合子胚作为培养体；

S2、将培养体依次经过流水冲洗、酒精漂洗、无菌水第一次冲洗、升汞浸泡以及无菌水第二次冲洗后，通过无菌吸水纸将培养体上的水分吸干，最后将培养体接种至无菌苗培养基中进行培养诱导无菌苗；

S3、将无菌苗培养基中培养诱导出的无菌苗新芽分割成单株无菌苗，并将单株无菌苗分别接种至增殖培养基中进行增殖培养；

S4、当无菌苗培育至3-4cm高时，将无菌苗接种到生根培养基中进行生根培养；

S5、通过步骤S3获得无菌苗幼嫩茎段外植体，同时把切掉幼嫩茎段以后的带子叶胚去掉子叶，将去掉子叶的子叶胚接种到愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导；

S6、通过步骤S5获得紧密的愈伤组织，将紧密的愈伤组织接种至体胚诱导培养基进行体胚诱导。

本申请通过对夏栎种子进行消毒处理培育获得无菌苗，可有效避免直接对夏栎幼苗直接消毒对后续试验中所需材料幼嫩茎段造成的损伤，提高试验成功率；同时在带子叶的合子胚培养出无菌苗，并切掉无菌苗转入诱导培养后，把自身的子叶切掉继续培养，并全程暗培养，可诱导出愈伤组织并进一步进行体细胞胚发生，进一步提高夏栎组织培养的再生效率。

以下结合附图1-7，对本发明的技术方案作进一步阐释：

如图1-图7所示，本申请公开了一种夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，包括以下步骤：

S1、首先对夏栎种子预处理，夏栎种子选自生长健壮、干形通直、树冠端正、无病虫害、处于壮龄，且耐水淹的优良单株的夏栎植株，夏栎种子预处理时，首先将外壳去掉，利用手术刀在种子胚上方6-9mm位置处横切掉，获得带有一部分子叶的合子胚作为培养体。

S2、将培养体依次经过流水冲洗、酒精漂洗、无菌水第一次冲洗、升汞浸泡以及无菌水第二次冲洗后，一次冲洗次数为三次，二次冲洗次数为五次，通过无菌吸水纸将培养体上的水分吸干，最后将培养体接种至无菌苗培养基中进行培养诱导无菌苗，培养温度(25±1)℃，光照时间16h/d，光照强度1500-2000Lx。也就是说，选取颗粒饱满的夏栎种子，在消毒前的剥种阶段，把夏栎种子外壳去掉以后，用手术刀在种子胚上方8mm左右处横切掉，留下一部分带子叶的合子胚，将其放到流水下冲洗两个小时，在超净工作台用利用75％酒精漂洗30s，无菌水冲洗接着用升汞浸泡10min，最后用无菌水冲洗4-6次；冲洗完毕，用无菌吸水纸将种子上的水分吸干备用。

在一些实施例中，所述步骤S2中培养体接种方法包括将吸干水分的夏栎种子接种至含无菌苗培养基的培养瓶中进行培养，每个培养瓶中接种2粒夏栎种子，共接种30瓶，培养3周后观察，并统计夏栎种子发芽率及其污染率。

表1为不同消毒方式对夏栎种子的影响，如表1所示：

(注：不同小写字母:差异显著(P<0.05))

通过表1试验数据可知，当选用75％酒精和0.1％升汞浸泡10min时，夏栎种子污染率和死亡率最低，夏栎种子存活率最高。

具体地，所述步骤S2中无菌苗培养基的配方为：MS+0.6mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D，PH 5.8。

表2为不同激素配比对夏栎种子诱导率的影响，如表2所示：

(注：不同小写字母:差异显著(P<0.05))

通过表2试验数据可知，当选用0.6mg/L 6-BA，1.0mg/L 2,4-D时，夏栎种子诱导率最高。

S3、将无菌苗培养基中培养诱导出的无菌苗新芽分割成单株无菌苗，并将单株无菌苗分别接种至增殖培养基中进行增殖培养，培养温度(25±1)℃，光照时间16h/d，光照强度1500-2000Lx。也就是说，在夏栎种子诱导出无菌苗新芽后，将各无菌苗新芽分割成单株无菌苗分别进行增殖培养，可实现短时间内快速获得大量无菌苗，大大提高无菌苗培育效率。

在一些实施例中，所述步骤S2中，将培养20-30天的无菌苗的幼嫩茎段作为外植体，并切成1-2cm，随后将切割后的分段外植体接种于所述步骤S3增殖培养基中培养瓶中进行增殖培养。也就是说，截取夏栎种子诱导培育20-30天的无菌苗幼嫩茎段作为外植体，并且将外植体培育在增殖培养基中进行增殖培育，可进一步提高夏栎无菌苗培育速度。

具体地，所述步骤S3中增殖培养基的配方为：WPM+0.4mg/L 6-BA，pH 5.8。

表3为不同激素配比对夏栎茎段增殖效果的影响，如表3所示：

(注：不同小写字母:差异显著(P<0.05))

通过表3试验数据可知，当选用0.4mg/L 6-BA时，夏栎茎段增殖效果最好。

S4、当无菌苗培育至3-4cm高时，将无菌苗接种到生根培养基中进行生根培养，培养温度(25±1)℃，光照时间16h/d，光照强度1500-2000Lx。也就是说，将培育至高3-4cm的无菌苗接种到生根培养基中进行生根培育，生根培养基中配方为：WPM+0.25mg/L IBA+0.10mg/L NAA，pH 5.8。

表4为不同激素配比对夏栎茎段生根效果的影响，如表4所示：

(注：不同小写字母:差异显著(P<0.05))

通过表4试验数据可知，当选用0.25mg/L IBA，0.10mg/L NAA时，夏栎茎段生根效果最好。

S5、通过步骤S3获得无菌苗幼嫩茎段外植体，同时把切掉幼嫩茎段以后的带子叶胚去掉子叶，将去掉子叶的子叶胚接种到愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导，愈伤组织诱导培养采用暗培养，愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA，PH 5.8。

表5为不同激素配比对夏栎合子胚诱导愈伤组织的影响，如表5所示：

(注：不同小写字母:差异显著(P<0.05))

通过表5试验数据可知，当选用0.5mg/L 6-BA，0.4mg/L NAA时，诱导愈伤组织效果最好。

S6、通过步骤S5获得紧密的愈伤组织，将紧密的愈伤组织接种至体胚诱导培养基进行体胚诱导，体胚诱导培养采用暗培养，体胚诱导培养基的配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，PH 5.8。

表6为不同激素配比对夏栎体胚诱导的影响，如表6所示：

(注：不同小写字母:差异显著(P<0.05))

通过表6试验数据可知，当选用0.5mg/L 6-BA，0.2mg/L NAA时，夏栎体胚诱导效果最好。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (9)

1.一种夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、首先对夏栎种子预处理，获得带子叶的合子胚作为培养体；

S2、将培养体依次经过流水冲洗、酒精漂洗、无菌水第一次冲洗、升汞浸泡以及无菌水第二次冲洗后，通过无菌吸水纸将培养体上的水分吸干，最后将培养体接种至无菌苗培养基中进行培养诱导无菌苗；

S3、将无菌苗培养基中培养诱导出的无菌苗新芽分割成单株无菌苗，并将单株无菌苗分别接种至增殖培养基中进行增殖培养；

S4、当无菌苗培育至3-4cm高时，将无菌苗接种到生根培养基中进行生根培养；

S5、通过步骤S3获得无菌苗幼嫩茎段外植体，同时把切掉幼嫩茎段以后的带子叶胚去掉子叶，将去掉子叶的子叶胚接种到愈伤组织诱导培养基进行愈伤组织诱导；

S6、通过步骤S5获得紧密的愈伤组织，将紧密的愈伤组织接种至体胚诱导培养基进行体胚诱导。

2.如权利要求1所述的夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，其特征在于，所述步骤S2、S3以及S4中具体培养条件为：培养温度(25±1)℃，光照时间16h/d，光照强度1500-2000Lx。

3.如权利要求1所述的夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，其特征在于，所述步骤S5和步骤S6均采用暗培养。

4.如权利要求1所述的夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，其特征在于，所述步骤S1中夏栎种子选自生长健壮、干形通直、树冠端正、无病虫害、处于壮龄，且耐水淹的优良单株的夏栎植株。

5.如权利要求1或4所述的夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，其特征在于，所述步骤S1中夏栎种子预处理时，首先将外壳去掉，利用手术刀在种子胚上方6-9mm位置处横切掉，获得带有一部分子叶的合子胚。

6.如权利要求1所述的夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，其特征在于，所述步骤S2中具体处理方法包括将培养体放置到流水下冲洗两个小时，随后在超净工作台上用75％酒精漂洗30s，然后利用无菌水进行一次冲洗，随后将培养体浸泡在0.1％升汞10min，最后用无菌水进行二次冲洗。

7.如权利要求1所述的夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，其特征在于，所述步骤S2中无菌苗培养基的配方为：MS+0.6mg/L 6-BA+1.0mg/L 2,4-D，PH 5.8；所述步骤S3中增殖培养基的配方为：WPM+0.4mg/L 6-BA，pH 5.8；所述步骤S4中生根培养基的配方为：WPM+0.25mg/L IBA+0.10mg/L NAA，pH 5.8；所述步骤S5中愈伤组织诱导培养基的配方为：MS+0.5mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA，PH 5.8；所述步骤S6中体胚诱导培养基的配方为：MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/L NAA，PH 5.8。

8.如权利要求1或6或7所述的夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，其特征在于，所述步骤S2中培养体接种方法包括将吸干水分的夏栎种子接种至含无菌苗培养基的培养瓶中进行培养，每个培养瓶中接种2粒夏栎种子，共接种30瓶，培养3周后观察，并统计夏栎种子发芽率及其污染率。

9.如权利要求1所述的夏栎组织培养提高再生效率的处理方法，其特征在于，所述步骤S2中，将培养20-30天的无菌苗的幼嫩茎段作为外植体，并切成1-2cm，随后将切割后的分段外植体接种于所述步骤S3增殖培养基中培养瓶中进行增殖培养。