CN110583489B - 一种大叶杨的组培快繁方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大叶杨的组培快繁方法和应用，包括：以大叶杨幼嫩叶柄为外植体，外植体依次进行不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养和移栽。利用上述的组培快繁方法得到的组培生根苗培养时间短，培养流程简便，提高了大叶杨繁殖的效率；能快速获得遗传性状一致的大叶杨组培生根苗，组培生根苗移栽成活率高。利用组培快繁技术，进行外植体培养，不受季节气候变化、自然灾害的影响，可进行大规模的工业化育苗，利用上述组培快繁方法，可以保持优良基因型的特性不变，从而为大叶杨优良种质资源的保存和利用提供技术保障。

Description

一种大叶杨的组培快繁方法和应用

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体而言，涉及一种大叶杨的组培快繁方法和应用。

背景技术

杨树是杨柳科杨属树种的统称，乔木，雌雄异株。杨属分为5个派：白杨派、黑杨派、青杨派、胡杨派和大叶杨派。杨属树种约有100余种，主要分布于北半球温带和寒带地区。中国有杨树53种，是杨树分布主要中心区之一。杨树在我国的分布很广，从新疆到东部沿海，从黑龙江、内蒙古到长江流域都有分布，具有普遍分布的特点。杨树由于其生长快、繁殖容易、适应性强、木材用途广等特点，在世界上有较大的栽培面积，是速生丰产林、短周期工业用材林、防护林及园林绿化的重要造林树种。

杨树人工杂交育种和扦插繁殖是培育杨树新品种的主要手段。但是研究显示，大叶杨嫁接繁殖难度较大，扦插成活率也极低。这些都对大叶杨繁育及种质资源的保存造成一定困难。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种大叶杨的组培快繁方法和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种大叶杨的组培快繁方法，通过外源激素诱导大叶杨的叶柄产生不定芽进行快速繁殖。

目前，杨树人工杂交育种和扦插繁殖是培育杨树新品种的主要手段。但是研究显示，大叶杨扦插成活率极低，不同生根剂处理的枝插成活率均为零，根插成活率亦低于15％。嫁接成活率相对较高，但对砧木要求特殊，目前仅发现山地杨与砧木具有较高的亲和性。这些都对大叶杨繁育及种质资源的保存利用造成一定困难。

由此本发明实施例提供一种大叶杨的组培快繁方法，通过外源激素诱导大叶杨的叶柄产生不定芽进行快速繁殖。选取幼嫩叶子的叶柄为起始外植体，具有以下的优点：选取幼嫩叶子的叶柄为起始外植体，这样对嫩枝的影响小，可以持续取材，枝条的用量少，相比选取茎段做外植体需要的枝条少得多，因此减少了对树体的损害；另外，更重要的是，叶柄为起始外植体容易消毒成功，而以茎段为外植体时，通常选用的是带少量叶柄的茎段，这样茎段和叶柄相连处（叶腋）不容易彻底清洗和消毒。因此，本发明实施例中选用叶柄避免了叶腋处不容易彻底清洗和消毒的问题，因此消毒容易成功，进而提高了诱导率。

在可选的实施方式中，组培快繁方法包括依次进行的以下步骤：获取大叶杨植株幼嫩叶子的叶柄作为外植体，外植体进行灭菌消毒；不定芽诱导培养；增殖培养；生根培养；炼苗移栽。

在可选的实施方式中，获取外植体包括: 每年春天在大叶杨发芽前，选取成年大叶杨的枝条置室内进行水培，将萌发的嫩枝上的叶柄切下，得到外植体；

优选的，选取成年大叶杨的1-2年生枝条，修剪成1-1.5m长的枝条置室内进行水培；

更优选的，选取嫩枝的第1-2个展开叶的叶柄。

本发明实施例提供一种大叶杨的组培快繁过程中，获取大叶杨植株的外植体包括：每年春天在大叶杨发芽前，选取成年大叶杨的1-2年生枝条，修剪成1-1.5m长的枝条置室内桶中水培，由于室内环境较室外干净，因此，水培萌发的嫩枝也干净，容易消毒。

选取幼嫩叶子的叶柄为起始外植体，这样对嫩枝的影响小，可以持续取材，仅需1-2个水培枝条就可以获取到大量的叶柄，相比选取茎段做外植体需要的水培枝条少得多。

在可选的实施方式中，外植体进行灭菌消毒包括以下步骤：取大叶杨幼嫩叶柄作为外植体，依次进行清洗、流水冲洗、84消毒液浸泡和无菌水冲洗，将叶柄两端接触消毒液的伤口切除；

优选的，消毒灭菌包括以下步骤：取大叶杨幼嫩叶柄作为外植体，将叶柄置于洗洁精水中浸泡20-30min，接着用流水冲洗20-30min，然后用70-75％的酒精浸泡5-10s，随后用10-15% 的84消毒液浸泡10-15min，接着用无菌蒸馏水冲洗2-3次，得到无菌的外植体；

更优选的，采用70％酒精浸泡10s，随后用15 %的84消毒液浸泡10min。

本发明实施例提供一种大叶杨的组培快繁过程中，外植体的消毒灭菌采用酒精和84消毒液。目前对于外植体的消毒大多采用0.1%的升汞来消毒，因为升汞比次氯酸钠消毒效果好，但会对环境造成严重污染，多数实验室已严禁使用。本发明实施例中采用消毒液为70%酒精和家用84消毒液，消毒液对环境友好，消毒效果好，成功率可达100%，且对外植体的杀伤力小。

在可选的实施方式中，不定芽诱导培养包括以下步骤：将灭菌消毒后的叶柄切成长0.3-0.5cm的小段，水平接种于不定芽诱导培养基中；

优选的，接种之后，先置于黑暗条件下培养2-3d，然后移入光照培养间培养以促进叶柄上的不定芽生长分化。

本发明实施例提供一种大叶杨的组培快繁过程中，在不定芽诱导培养阶段，将消毒灭菌之后的叶柄两端接触消毒液的伤口切除，这样切除了消毒剂已杀伤的伤口细胞，该步骤对提高不定芽的诱导率有很大帮助；然后将叶柄切成小段，可以得到多个接种的叶柄外植体，将切段之后的叶柄小段接种，接种后先暗培养2-3d，这样有利于活化伤口细胞，也避免外植体褐化，从而提高不定芽的诱导率，在此基础上，再移入光照培养间进行培养，整个不定芽诱导培养阶段外植体无褐化现象，10-15 d后可观察到叶柄上再生的不定芽突起，随着培养时间的延长，不定芽逐渐伸长，利用上述的步骤进行诱导培养，诱导效率高，叶柄不定芽诱导率可达100%。

在可选的实施方式中，不定芽诱导培养的培养基包括：1/2MS基本培养基，附加TDZ0.003-006 mg/L、6-BA 0.2-0.4 mg/L 以及IBA 0-0.2 mg/L。以上的不定芽诱导培养的培养基是以1/2MS作为基本培养基，在基本培养基中再附加TDZ 0.003-006 mg/L、 6-BA 0.2-0.4 mg/L 以及IBA 0-0.2 mg/L，以促进不定芽分化。

在可选的实施方式中，增殖培养包括以下步骤：将叶柄上诱导出的不定芽切下，分割成单个不定芽或2-3个不定芽丛接种于增殖培养基中，置于光照培养间培养；

优选的，将不定芽切下，分割成2-3个不定芽丛。

在可选的实施方式中，增殖培养的培养基包括：用B5培养基中的有机质代替MS基本培养基中的有机质作为基本培养基，在基本培养基中再附加6-BA 0.5-2.0 mg/L和NAA0.05-0.2 mg/L，以上述的培养基作为增殖培养的培养基，可明显提高增殖培养的不定芽的增殖系数。

本发明实施例提供一种大叶杨的组培快繁过程中，在增殖培养阶段，将不定芽诱导培养长出的不定芽切下，分割成单个不定芽或2-3个不定芽丛接种于增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养时接种用芽丛，而不是单个芽，显著提高了增殖率，对于少量组培样本尤为有效，效果明显。同时，在增殖培养阶段，MS基本培养基中的有机质用B5培养基的有机质替代，增殖系数达到8以上。

在可选的实施方式中，生根培养包括：将增殖培养后高度达到1.5cm的不定芽切下，接种于生根培养基中进行生根培养；

优选的，生根培养基为1/2 MS，附加 IBA 0.3-0.6mg/L ，蔗糖20-30 g/L。

本发明实施例提供的大叶杨组培快繁过程中，在生根培养阶段，将增殖培养后高约1.5cm的不定芽切下，接种于生根培养基中进行生根培养。生根培养基以1/2 MS作为基本培养基，并附加 IBA 0.3-0.6 mg/L ，蔗糖20-30 g/L，一周后开始生根，生根率可达100%，取根尖采用常规压片法观察染色体，随机选取10株试管苗进行检测，染色体数均为38条，没有发现染色体数目异常的植株。

在可选的实施方式中，炼苗移栽包括以下步骤：将组培生根苗置于荫棚中，经闭瓶炼苗，开瓶炼苗后，移栽进草炭：珍珠岩=2:1的基质中保湿培养。

第二方面，本发明实施例还提供一种利用上述组培快繁方法在大叶杨资源保存和繁殖中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供一种大叶杨的组培快繁方法和应用。本发明以大叶杨幼嫩叶柄为外植体进行组培快繁。由于叶柄容易获得和消毒灭菌彻底，利用叶柄作为外植体进行组培快繁，可以高效获得不定芽，通过外源激素诱导进行快速繁殖，显著提高了大叶杨繁殖的效率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中的叶柄的切段照片；

图2为本发明实施例1中的叶柄切段上不定芽诱导的情况；

图3为本发明实施例1中的不定芽增殖培养的照片；

图4为本发明实施例1中的不定芽生根培养的照片；

图5为本发明实施例1中的不定芽生根培养之后的根尖染色体照片；

图6为本发明实施例1中的组培苗移栽后的生长情况。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行。如培养温度、光照强度及光照时间、培养基pH值及培养基灭菌条件等均为组织培养常规条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

（1）、外植体消毒灭菌和不定芽诱导培养

先将外植体按照以下标准方法进行消毒灭菌：每年春天在大叶杨发芽前，选取成年大叶杨的1-2年生枝条，修剪成约1m长的枝条置室内桶中水培，隔天换一次新鲜的自来水。待枝条抽生嫩枝后，选取第1-2个展开叶的叶柄为外植体，将叶柄置于洗洁精水中浸泡20min，接着用流水冲洗30min，再于超净工作台中消毒。消毒方法为：先用70％的酒精浸泡10s，随后用15％的84消毒液浸泡10min，接着用无菌蒸馏水冲洗3次，所获得的材料即为无菌的外植体。将叶柄两端接触消毒液的伤口切除，剩下的叶柄切成长约0.4cm的小段，切段之后的叶柄参见图1。

将切段之后的叶柄进行不定芽诱导培养：切段之后的叶柄水平接种于不定芽诱导培养基中，置于黑暗条件下培养2d，然后移入光照培养间进行不定芽诱导培养，不定芽生长情况的照片参见图2，诱导培养阶段外植体无褐化现象，10-15d后可观察到叶柄上再生的不定芽突起，随着培养时间的延长，不定芽逐渐伸长，40-50d后可进行不定芽增殖培养。

诱导不定芽培养基的配方：1/2 MS+ TDZ0.005 mg/L + 6-BA 0.3 mg/L +IBA 0.1mg/L。

以上的不定芽诱导培养阶段，消毒液浓度、消毒时间对外植体的不定芽诱导均有影响，叶柄在不同的消毒液浓度下浸泡不同的时间后，将其切为长约0.4cm的小段，切段后的叶柄编号为1-6，将编号为1-6的叶柄切段接种在不定芽诱导培养基上，接种个体在接种15ｄ后统计污染率，40ｄ后统计不定芽诱导率，结果如表1所示。

污染率 (％)＝污染的叶柄数/接种的总叶柄数×100％；不定芽诱导率(％)＝诱导出不定芽的叶柄数/接种的总叶柄数×100％。

表1 叶柄切段不定芽诱导培养的结果

编号	84消毒液浓度	消毒时间(min)	接种外植体数(个)	污染的叶柄数（个）	污染率(%)	诱导率(%)
							1	10%	5	30	30	100	0
2	10%	10	30	13	43.3	56.7
							3	10%	15	30	9	30	70
4	15%	5	36	6	16.7	83.3
							5	15%	10	36	0	0	100
6	15%	15	36	0	0	97.2

由表1可以看出：外植体消毒灭菌过程中，利用10% 的84消毒液浸泡，接种之后的污染率较高，提高84消毒液的浓度至15%，利用15% 的84消毒液浸泡10min，可以使接种之后的污染率为0，诱导率达到100%。进一步延长浸泡的时间，会降低不定芽的诱导率，因此，消毒的过程中，采用15% 的84消毒液浸泡10min。

（2）、增殖培养

将步骤（1）中的编号为5的外植体上诱导出的不定芽切下，分割成单个不定芽或2-3个不定芽丛接种于增殖培养基中进行增殖培养，置于光照培养间培养，30ｄ为一个增殖培养周期，不定芽丛的生长情况的照片参见图3。观察发现：MS基本培养基中的有机质用B5培养基的有机质替代后，试管苗的长势及增殖系数明显提高，接种时以2-3个不定芽丛接种明显优于单个不定芽接种。

以上的增殖培养过程中，培养基的成分和接种方式对于增殖系数均有影响，将步骤（1）中的编号为5的外植体上诱导培养出的不定芽切下，分割成单个不定芽或2-3个不定芽丛，并编号为7-12，将编号为7-12的不定芽或芽丛在不同的培养基上以不同的接种方式进行接种，培养基配方和接种方式以及接种之后的生长状态如表2。

编号7-12的不定或不定芽丛接种的培养基包括基本培养基1和基本培养基2，其中，基本培养基1：MS基本培养基。基本培养基2：MS大量、MS微量、MS铁盐及B5有机质。每种处理接种30个不定芽或30个不定芽丛，30ｄ后统计增殖系数及生长情况。

增殖系数＝30ｄ有效芽数／接种芽数。

表2 不定芽增殖培养结果

编号	培养基配方	接种方式	增殖系数	生长状态
					7	基本培养基1+6-BA 0.5+NAA 0.05	单芽	2.03	生长健壮
8	基本培养基2+6-BA 0.5+NAA 0.05	芽丛	2.96	生长健壮、叶色浓绿
					9	基本培养基1+6-BA1.0+NAA 0.1	单芽	4.2	生长健壮
10	基本培养基2+6-BA 1.0+NAA 0.1	芽丛	8.13	生长健壮、叶色浓绿
					11	基本培养基1+6-BA 2.0+NAA 0.2	单芽	4.87	出现玻璃化苗
12	基本培养基2+6-BA 2.0+NAA 0.2	芽丛	8.87	出现玻璃化苗

由表2可以看出：不定芽增殖培养的过程中，从接种方式看，接种方式为芽丛的不定芽的增殖系数高，可以达到8以上，从基本培养基来看，利用基本培养基2进行培养的增殖系数比利用基本培养基1进行培养的增殖系数高，可见，MS基本培养基中的有机质用B5培养基的有机质替代，获得的基本培养基有利于大叶杨的不定芽增殖培养。

（3）、生根、移栽及遗传稳定性检测

将步骤（2）中的编号为10中增殖培养后高约1.5cm不定芽切下，接种于生根培养基中进行生根培养。生根培养基为1/2 MS+ IBA 0.5 mg/L +蔗糖20g/L，一周后开始生根，生根率可达100%，不定根的生长情况参见图4，取根尖常规压片观察染色体，随机选取10株试管苗进行检测，染色体数均为38条，根尖染色体的照片参见图5，没有发现染色体数异常的植株。将以上生根之后的组培苗移栽于花盆中，长势良好，生长情况参见图6。

对比例1

利用扦插方法进行增殖，大叶杨扦插成活率极低，不同生根剂处理的枝扦插的成活率均为零，根扦插的成活率均为15%。

对比例2

利用茎段作为外植体，由于腋芽处不容易彻底清洗，由于外植体的褐化率高，导致萌发率低，也不能快速组培快繁出大量的大叶杨幼苗。

对比例3

利用叶盘（叶片）作为外植体，诱导不定芽所需时间明显较叶柄为外植体时所需时间增长，且不定芽的诱导率明显较叶柄低，也不能快速组培快繁出大量的大叶杨幼苗。

综上，本发明实施例提供一种大叶杨的组培快繁方法和应用，组培快繁是以大叶杨幼嫩叶子的叶柄为外植体，依次进行不定芽诱导培养、增殖培养、生根培养和移栽。由于叶柄容易消毒灭菌，因而消毒效果好，成功率可达100%；叶柄外植体进行不定芽诱导培养时切除接触消毒液的伤口并暗培养2-3天，可以有效活化伤口细胞并避免外植体褐化现象，叶柄不定芽的诱导率可达100%；将诱导产生的不定芽切下增殖培养，芽丛的增殖系数可达8以上；经过增殖培养的不定芽再进行生根培养，生根的组培苗移栽得到遗传性状一致的大叶杨幼苗。利用上述的组培快繁方法，可以保持优良种或品种的特性不变，从而为大叶杨优良种质资源的保存和利用提供技术保障。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种大叶杨的组培快繁方法，其特征在于，通过外源激素诱导大叶杨的叶柄产生不定芽进行快速繁殖；

所述快速繁殖包括以下步骤：叶柄灭菌消毒；不定芽诱导培养；增殖培养；生根培养；炼苗移栽；其中：

所述叶柄灭菌消毒包括以下步骤：每年春天在大叶杨发芽前，选取成年大叶杨的1-2年生枝条，修剪成1-1.5m长的枝条置室内进行水培，将萌发的嫩枝上的第1-2个展开叶的叶柄切下，将叶柄置于洗洁精水中浸泡20-30min，接着用流水冲洗20-30min，然后用70-75％的酒精浸泡5-10s，随后用10-15％的84消毒液浸泡10-15min，接着用无菌蒸馏水冲洗2-3次，得到无菌的外植体；

所述不定芽诱导培养包括以下步骤：将灭菌消毒后的叶柄，切去两端接触消毒液的伤口后，切成长0.3-0.5cm的小段，水平接种于不定芽诱导培养基中，接种之后，先置于黑暗条件下培养2-3d，然后移入光照培养间培养以促进叶柄上的不定芽分化；所述不定芽诱导的培养基为1/2MS培养基，附加TDZ 0.003-006mg/L、6-BA 0.2-0.4mg/L以及IBA 0-0.2mg/L；

所述增殖培养包括以下步骤：将叶柄上长出的不定芽切下，分割成2-3个不定芽丛接种于增殖培养基中，置于光照培养间培养，所述增殖培养的培养基为：用B5培养基中的有机质代替MS培养基中的有机质得到的改良MS培养基，附加6-BA0.5-2.0mg/L和NAA0.05-0.2mg/L；

所述生根培养包括：将增殖培养后高度达到1.5cm的不定芽切下，接种于生根培养基中进行生根培养，所述生根培养的培养基为1/2MS，附加IBA 0.3-0.6mg/L和蔗糖20g/L。

2.权利要求1所述大叶杨的组培快繁方法在大叶杨资源保存及品种繁育中的应用。

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