CN110150147B

CN110150147B - 一种大叶杨组培快繁方法

Info

Publication number: CN110150147B
Application number: CN201910383838.6A
Authority: CN
Inventors: 刘妍婧; 王一鸣; 曾庆银
Original assignee: CHINESE ACADEMY OF FORESTRY
Current assignee: CHINESE ACADEMY OF FORESTRY
Priority date: 2019-05-09
Filing date: 2019-05-09
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2039-05-09
Also published as: CN110150147A

Abstract

本发明提供了一种大叶杨的组培快繁方法，属于植物组织培养技术领域。本发明先将大叶杨枝条依次冷藏、浸泡和水培，得到8～10cm长的幼嫩小枝；然后对所述幼嫩小枝进行无菌处理，得到无菌叶片；将所述无菌叶片分割成小块，接种到不定芽诱导培养基上诱导培养，得到不定芽；再将所述不定芽分割成带有一个腋芽的茎段，每个茎段分别接种于生根培养基上生根培养，得到生根苗；最后将所述生根苗炼苗后移栽，得到大叶杨种苗。本发明提供的大叶杨组培快繁方法步骤简单，周期短，叶片年增殖数可达到81株，能有效实现大叶杨的组培快繁。

Description

一种大叶杨组培快繁方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种大叶杨组培快繁方法。

背景技术

大叶杨(学名：Populus lasiocarpa Oliv.)是杨柳科杨属的多年生木本植物，为我国特有的乡土树种，原产于华中地区，仅在湖北、陕西、四川、贵州和云南省有野生种分布，国外无野生种群分布。又因分布于鄂西北、鄂西南最多而又被称为鄂西大叶杨，俗名为水冬瓜，属大叶杨派中的一种。大叶杨适宜海拔600～2800m，喜湿润温凉气候，有一定的耐寒能力，具有较高的生态价值，其高山地区的适应性是山地杨树育种的优良基因资源。其木材白色，轻软，结构细，为造纸、板料、家具等优良用材，是一种优良的乡土阔叶树种。但是，迄今大叶杨仍处于野生状态，分布零散，采种困难，且实生苗遗传分化现象严重，生产中种子育苗应用较少，未得到有效保护与利用。因此，开展大叶杨种质资源的保存与利用研究具有重要意义。

已有研究显示，大叶杨扦插成活率极低，不同生根剂处理的枝插成活率均为零，根插成活率亦低于15％。嫁接成活率相对较高，但对砧木要求特殊，目前仅发现山地杨与其具有较高的亲和性。这些都对大叶杨种质资源的保存造成一定困难。

发明内容

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种大叶杨组培快繁方法，建立大叶杨高效组培快繁体系，以期为解决生产中大叶杨的育苗问题提供参考。

本发明提供的技术方案如下：

一种大叶杨组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)将大叶杨枝条依次冷藏、浸泡和水培，得到8～10cm的幼嫩小枝；

(2)对所述幼嫩小枝进行无菌处理，得到无菌叶片；

(3)将所述无菌叶片分割成0.5～1.5cm×0.5～1.5cm的小块，接种到不定芽诱导培养基上诱导培养，得到不定芽；

所述不定芽诱导培养基的组成包括：以1/2MS培养基为基准，每升1/2MS培养基中还包括6-BA0.8～1.2mg、NAA0.08～0.12mg、琼脂4～8g和蔗糖25～35g，所述不定芽诱导培养基的pH值为5.5～6；

(4)将所述不定芽分割成带有一个腋芽的茎段，每个茎段分别接种于生根培养基上生根培养，得到生根苗；

(5)将所述生根苗炼苗后移栽，得到大叶杨种苗。

优选的，步骤(1)所述冷藏的温度为2～6℃，冷藏的时间为8～12d。

优选的，步骤(1)所述浸泡的温度为10～30℃，浸泡的时间为36～60h。

优选的，步骤(2)所述无菌处理依次包括洗洁精溶液浸泡、清水冲洗、酒精溶液浸泡和次氯酸钠溶液浸泡；所述洗洁精溶液的稀释倍率为200～500，洗洁精溶液浸泡的时间为5～15min所述清水冲洗的时间为40～80min；所述酒精溶液的体积浓度为60～80％，酒精溶液浸泡的时间为20～40s；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为3～7％，次氯酸钠溶液浸泡的时间为4～7min。

优选的，所述清水冲洗、酒精溶液浸泡或者次氯酸钠溶液浸泡后，还包括无菌蒸馏水润洗或冲洗。

优选的，步骤(3)所述诱导培养的培养温度为20～25℃，所述诱导培养期间进行光照处理；光照时间为15～17h/d，光照强度为2200～2800lx，培养时间为120～150d；每两周更换一次培养基。

优选的，步骤(4)所述生根培养基的组成包括：以1/2MS培养基为基准，每升1/2MS培养基中还包括NAA0.08～0.12mg、IBA0.15～0.25mg、琼脂6～8g和蔗糖12～18g；所述生根培养基的pH值为5.5～6。

优选的，步骤(4)所述生根培养的培养温度为20～25℃，所述生根培养期间进行光照处理；光照时间为15～17h/d，光照强度为2200～2800lx，培养时间为30～40d。

优选的，步骤(5)所述移栽的基质为草炭土。

优选的，步骤(5)所述炼苗后，去除生根苗的全部叶片，保留顶芽；所述移栽后10d内保持环境温度为20～25℃，环境湿度为60～90％。

有益效果：本发明提供了一种大叶杨组培快繁方法，包括以下步骤：(1)将大叶杨枝条依次冷藏、浸泡和水培，得到8～10cm长的幼嫩小枝；(2)对所述幼嫩小枝进行无菌处理，得到无菌叶片；(3)将所述无菌叶片分割成0.5～1.5cm×0.5～1.5cm的小块，接种到不定芽诱导培养基上诱导培养，得到不定芽；所述不定芽诱导培养基的组成包括：以1/2MS培养基为基准，每升1/2MS培养基中还包括6-BA0.8～1.2mg、NAA0.08～0.12mg、琼脂4～8g和蔗糖25～35g，所述不定芽诱导培养基的pH值为5.5～6；(4)将所述不定芽分割成带有一个腋芽的茎段，每个茎段分别接种于生根培养基上生根培养，得到生根苗；(5)将所述生根苗炼苗后移栽，得到大叶杨种苗。

本发明提供的大叶杨组培快繁方法中，冷藏能使枝条腋芽进入被迫休眠，提高腋芽的萌发率；将冷藏后的大叶杨枝条先经室温浸泡，再经水培，能够有效的打破大叶杨腋芽的休眠状态，激活腋芽的活性，使腋芽从休眠状态恢复，开始萌发并长出幼嫩小枝，提高腋芽萌发率，并为大叶杨叶片直接诱导出为不定芽提供必要条件。

采用本发明提供的不定芽诱导培养基进行诱导时，无菌处理后的叶片小块先膨大再形成愈伤组织，愈伤组织再生长出不定芽。本发明仅需120～150d即可从无菌处理后的叶片上诱导得到不定芽，显著缩短了组织培养时间，并且直接从叶片诱导得到的不定芽可以直接生根培养；进而实现从一片叶片培养得到多株种苗的目的，提高了增殖系数。

本发明提供的大叶杨组培快繁方法省略了不定芽增殖培养等复杂工序，通过不定芽诱导培养基直接从叶片上诱导出不定芽，有效的缩短了组织培育时间、简化操作步骤；本发明提供的方法可以使一片叶片扩繁成多株种苗，突破了只能种子繁育一株种苗的局限，一片叶片的年增殖数可达81株。

本发明提供的方法从无菌叶片接种到不定芽诱导培养基开始到移栽成活得到不定芽种苗为止，总用时约200d，其后将不定芽生根到移栽成活缩短至40～50d，繁殖周期缩短，生根率提高到接近100％。

附图说明

图1为本发明实施例1所述长至8～10cm的新生小枝照片；

图2为本发明实施例1所述接种于不定芽诱导培养基中的1cm×1cm的叶片(含叶柄)小块；

图3为本发明实施例1所述大叶杨不定芽照片；

图4为本发明实施例1所述生根培养基培养得到的生根苗照片；

图5为本发明所述组培快繁方法移栽后获得的大叶杨种苗照片。

具体实施方式

本发明提供了一种大叶杨组培快繁方法，包括以下步骤：

(1)将大叶杨枝条依次冷藏、浸泡和水培，得到8～10cm长的幼嫩小枝；

(2)对所述幼嫩小枝进行无菌处理，得到无菌叶片；

(5)将所述生根苗炼苗后移栽，得到大叶杨种苗。

本发明先将大叶杨枝条依次冷藏、浸泡和水培，得到8～10cm的幼嫩小枝。在本发明中，所述大叶杨枝条优选为秋季采摘的当年生大叶杨枝条，更优选为去除了老叶的大叶杨枝条。在本发明中，所述冷藏的温度优选为2～6℃，更优选为4℃；所述冷藏的时间优选为8～12d，更优选为10d。所述浸泡的温度为室温，优选为10～30℃，更优选为15～25℃。所述浸泡的时间优选为36～60h，更优选为48h。本发明对具体的水培方法不作特别限定，本领域常规操作即可。本发明首先利用低温冷藏促进大叶杨枝条上的腋芽的休眠，再室温浸泡和水培培养以打破大叶杨枝条腋芽的休眠状态，促使其萌发。采用本发明提供的预处理方式处理大叶杨腋芽能够将腋芽的萌芽期(由大叶杨枝条长出8～10cm的幼嫩小枝所用时间)缩短到1个月，显著缩短繁殖周期。

得到幼嫩小枝后，本发明对所述幼嫩小枝进行无菌处理，得到无菌叶片。在本发明中，所述无菌处理优选依次包括洗洁精溶液浸泡、清水冲洗、酒精溶液浸泡和次氯酸钠溶液浸泡。所述洗洁精溶液的稀释倍率优选为200～500，更优选为300～400；洗洁精溶液浸泡的时间优选为5～15min，更优选为10min；所述清水冲洗的时间优选为40～80min，更优选为60min；所述酒精溶液的体积浓度优选为60～80％，更优选为70％，酒精溶液浸泡的时间优选为20～40s，更优选为30s；所述次氯酸钠溶液的质量浓度优选为3～7％，更优选为5％，次氯酸钠溶液浸泡的时间优选为4～7min，更优选为5min。在本发明中，所述清水冲洗、酒精溶液浸泡或者次氯酸钠溶液浸泡后，优选还包括无菌蒸馏水润洗或冲洗的步骤。在本发明更具体的实施方式中，所述无菌处理的步骤为：将新生的幼嫩小枝置于洗洁精溶液中浸泡10min，取出洗净后，用流水冲洗1h，并用蒸馏水润洗3遍，再于超净工作台中消毒；消毒方法为：先用70％的酒精浸泡30s，随后用无菌蒸馏水冲洗3遍，再用5％次氯酸钠溶液浸泡5min(期间不断搅拌)，接着用无菌蒸馏水冲洗5次，剪下叶片(含叶柄)，所获得的材料即为无菌叶片。

得到无菌叶片后，本发明将所述无菌叶片分割成小块，接种到不定芽诱导培养基上诱导培养，得到不定芽。在本发明中，所述分割的规格优选为0.5～1.5cm×0.5～1.5cm，更优选为1cm×1cm。所述不定芽诱导培养基的组成包括：以1/2MS培养基为基准，每升1/2MS培养基中还包括6-BA0.8～1.2mg、NAA0.08～0.12mg、琼脂4～8g和蔗糖25～35g；更优选包括：以1/2MS培养基为基准，每升1/2MS培养基中还包括6-BA1mg、NAA0.1mg、琼脂6g和蔗糖30g。所述不定芽诱导培养基的pH值为5.5～6，优选为5.8。本发明对pH值的调整方法没有特殊限定，采用本领域常用的酸、碱调节即可。在本发明中，所述诱导培养的温度优选为20～25℃，更优选为21～23℃；所述诱导培养的光照时间优选为15～17h/d，更优选为16h/d；所述诱导培养的光照强度优选为2200～2800lx，更优选为2500lx。在本发明所述诱导培养过程中，优选每两周更换一次培养基。在本发明所述不定芽诱导培养基中，经过无菌处理的叶片小块仅需要120～150d即可诱导出不定芽。所述无菌处理的叶片小块在不定芽诱导培养基中先生长形成愈伤组织，继而愈伤组织上分化出多个不定芽，即本发明提供的方法能够直接诱导叶片萌发出不定芽，精简了繁育步骤。同时，如附图3所示大叶杨叶片诱导得到的不定芽，本发明提供的方法使得一片叶片即可直接诱导得到不定芽，提高了繁殖系数。

得到不定芽后，本发明将所述不定芽分割成带有一个腋芽的茎段，每个茎段分别接种于生根培养基上生根培养，得到生根苗。在本发明中，所述所述生根培养基的组成优选包括：以1/2MS培养基为基准，每升1/2MS培养基中还包括NAA0.08～0.12mg、IBA0.15～0.25mg、琼脂6～8g和蔗糖12～18g；所述生根培养基的pH值为5.5～6；更优选包括：以1/2MS培养基为基准，每升1/2MS培养基中还包括NAA0.1mg、IBA0.2mg、琼脂7g和蔗糖15g。所述生根培养基的pH值优选为5.5～6，更优选为5.8。本发明对pH值的调整方法没有特殊限定，采用本领域常用的酸、碱调节即可。在本发明中，所述生根培养的培养温度优选为20～25℃，更优选为21～23℃；所述诱导培养的光照时间优选为15～17h/d，更优选为16h/d；所述诱导培养的光照强度优选为2200～2800lx，更优选为2500lx。在本发明中，所述生根培养的时间优选30～40d；所述生根培养在第10～15d左右即可生根，生根后继续在原培养条件下培养一段时间后，得到生根苗。

得到生根苗后，本发明对得到的生根苗进行炼苗。本发明对具体的炼苗方法不作特别限定，本领域常规炼苗方式即可。优选的，所述炼苗的光照强度为2200～2800lx，更优选为2500lx。所述炼苗的时间优选为7～10d。

炼苗后，本发明优选去除生根苗的全部叶片，保留顶芽，再进行移栽。在本发明中，所述移栽的基质优选为草炭土。所述移栽后10d内的培养温度优选为20～25℃，更优选为21～23℃；培养湿度优选为60～90％，更优选为70～80％。移栽后，待顶芽重新生长，即得大叶杨种苗。

本发明以大叶杨叶片为外植体，提供了一种大叶杨组培快繁方法。该方法成本低、繁殖时间短、增殖系数高，能使一片大叶杨叶片的年增殖数达到81株组培苗。本发明提供的方法有效解决生产中大叶杨繁殖长期依赖种子繁殖的限制，为大叶杨生产繁殖和规模化种植提供了技术保障，克服了种子繁殖栽培用种量大、繁殖系数低的问题。

下面通过实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

取10月份采集的当年生大叶杨枝条，去除老叶后，置于4℃冰箱中冷藏放置2周，促使腋芽休眠。

将冷藏后的大叶杨枝条在室温下浸泡2d，然后进行水培，每天换水，待腋芽打破休眠萌发，新生小枝长至8～10cm时(如附图1所示)，剪下小枝置于洗洁精溶液中浸泡10min，取出洗净后用流水冲洗1h，并用蒸馏水润洗3遍，再于超净工作台中消毒。

在超净台中将初步清洗后的大叶杨新生幼嫩小枝置于烧杯中，用体积分数70％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，用质量分数5％的次氯酸钠溶液浸泡5min，期间不断搅拌，再用无菌水冲洗5次后将小枝上的叶片(含叶柄)剪成1cm×1cm的小块接种于不定芽诱导培养基中(如附图2所示)。所述的不定芽诱导培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂6g+蔗糖30g，培养基的pH值为5.8。在培养温度22±1℃、光照时间16h/d、光照强度2500lx的条件下，对接种后的不定芽诱导培养基培养120～150d，叶片边缘先分化出愈伤组织，愈伤组织再分化出不定芽，即得大叶杨的不定芽(如附图3所示)。

将得到的不定芽切成保留一个腋芽的茎段，分别接种于生根培养基上，在培养温度22±1℃、光照时间16h/d、光照强度2500lx的条件下培养30～40d，得到生根苗(如附图4所示)。所述生根培养基为：1/2MS+NAA0.1mg/L+IBA0.2mg/L+琼脂7g+蔗糖15g，培养基的pH值为5.8。

得到生根苗后，将培养瓶打开，装入0.5cm厚度的清水，每天更换，并逐步打开瓶盖，置于2500lx的光照下炼苗10d，取出生根苗，洗净培养基后移栽至混合土中，去除所有叶片，保留顶芽，覆盖透明塑料罩保湿。移栽后10d内保持罩内温度保持在21～23℃、湿度60～80％，移栽10d后去罩，待顶芽重新生长，即得大叶杨种苗。

本次试验中，大叶杨愈伤组织在不定芽诱导培养基中的诱导率约为30％，从叶片接种到不定芽诱导培养基开始到移栽成活得到大叶杨种苗为止需要200d，后期不定芽直接生根快繁仅需40～50d。

按照如下所示的公式，计算大叶杨叶片的年增殖数可以达到81株组培苗。

Y＝m×Xⁿ，

其中，m：叶片个数；

X：每个培养周期的不定芽数；

n：全年可增殖的周期次数。

所述全年可增殖的周期次数，是指从第一次诱导得到不定芽为基础进行扩繁培养，能够连续扩繁培养的次数。

本次试验中，当m＝1时，每个培养周期的不定芽数X＝3，全年可增殖的周期次数n＝4。一片大叶杨全年所得种苗数Y＝1×3⁴≈81株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种大叶杨组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)对所述幼嫩小枝进行无菌处理，得到无菌叶片；

所述不定芽诱导培养基的组成为：以1/2MS培养基为基准，每升1/2MS培养基中还添加6-BA 0.8～1.2mg、NAA 0.08～0.12mg、琼脂4～8g和蔗糖25～35g，所述不定芽诱导培养基的pH值为5.5～6；

所述生根培养基的组成为：以1/2MS培养基为基准，每升1/2MS培养基中还添加NAA0.08～0.12mg、IBA 0.15～0.25mg、琼脂6～8g和蔗糖12～18g；所述生根培养基的pH值为5.5～6；

(5)将所述生根苗炼苗后移栽，得到大叶杨种苗；

步骤(1)所述冷藏的温度为2～6℃，冷藏的时间为8～12d；

步骤(1)所述浸泡的温度为10～30℃，浸泡的时间为36～60h。

2.根据权利要求1所述的大叶杨组培快繁方法，其特征在于，步骤(2)所述无菌处理依次包括洗洁精溶液浸泡、清水冲洗、酒精溶液浸泡和次氯酸钠溶液浸泡；所述洗洁精溶液的稀释倍率为200～500，洗洁精溶液浸泡的时间为5～15min；所述清水冲洗的时间为40～80min；所述酒精溶液的体积浓度为60～80％，酒精溶液浸泡的时间为20～40s；所述次氯酸钠溶液的质量浓度为3～7％，次氯酸钠溶液浸泡的时间为4～7min。

3.根据权利要求2所述的大叶杨组培快繁方法，其特征在于，所述清水冲洗、酒精溶液浸泡或者次氯酸钠溶液浸泡后，还包括无菌蒸馏水润洗或冲洗。

4.根据权利要求1所述的大叶杨组培快繁方法，其特征在于，步骤(3)所述诱导培养的培养温度为20～25℃；所述诱导培养期间进行光照处理；光照时间为15～17h/d，光照强度为2200～2800lx，培养时间为120～150d；每两周更换一次培养基。

5.根据权利要求1或4所述的大叶杨组培快繁方法，其特征在于，步骤(4)所述生根培养的培养温度为20～25℃，所述生根培养期间进行光照处理；光照时间为15～17h/d，光照强度为2200～2800lx，培养时间为30～40d。

6.根据权利要求1所述的大叶杨组培快繁方法，其特征在于，步骤(5)所述移栽的基质为草炭土。

7.根据权利要求1或6所述的大叶杨组培快繁方法，其特征在于，步骤(5)所述炼苗后，去除生根苗的全部叶片，保留顶芽；所述移栽后10d内保持环境温度为20～25℃，环境湿度为60～90％。