CN114431149A - 珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法，包括：外植体的消毒：选取成熟未开裂的的蒴果消毒；种子萌发培养：取出种子，均匀播撒在培养基上，在光照条件下进行无菌萌发；诱导侧芽分化培养：将剥去叶片的小假鳞茎转接到分化培养基中，在光照条件下进行培养；生根壮苗培养：当分化后的小苗长出1‑2片叶子、叶长2‑3cm时转接到生根壮苗培养基中进行培养；炼苗与移栽：先将组培幼苗移入温室中炼苗，取出后进行清洗、消毒浸泡；移栽到装有基质的育苗穴盘中。本发明选取成熟未开裂的的蒴果作为外植体，依次经过消毒、种子萌发、侧芽分化、生根壮苗、炼苗和移栽，优化各阶段培养参数，建立大规模繁殖手段和科学的有效的保护方法。

Description

珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法

技术领域

本发明属于植物繁殖技术领域，具体涉及珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法。

背景技术

繁殖可以说是物种整个生活史中最关键的一环，也是种群维持和更新的重要步骤，繁殖生物学研究也一直是对濒危植物研究的热门方向。我国利用兰科植物的历史可以追溯到公元前，但由于人工繁殖技术不够成熟和普及，难以满足目前市场日益增长的消费需求，使得许多物种的野生资源遭到破坏性采集。兰科植物繁殖有2个显著特性：一是兰科植物的种子通常非常微小，一个蒴果内就可能有数以百万计的种子，但种子自身无法贮藏养分，种子在自然条件下的萌发率较低；加上病虫害的侵染和虫、鸟等动物喜食其果实，更加导致了其自然条件下繁殖困难，因此人工培养基可以为其提供养分，快速获得大批实生苗；二是自然条件下，兰科尤其是地生兰依赖与真菌共生，形成兰科菌根(OrchidMycorrhizae)为种子提供营养和代谢产物等。因此，种子无菌萌发和内生菌共生萌发是兰科植物2种主要大规模繁殖方法和繁殖生物学研究重点，也是进行后续保育工作的基础环节。

大黄花虾脊兰(C.sieboldii)是虾脊兰属地生草本植物，生于海拔400-2000m的山地林下，属于大陆与岛屿之间间断分布的物种。近年来，由于大黄花虾脊兰生境被大肆破坏，导致该种群数量迅速减少，除了外部的不可抗力对其生境产生消极影响外，还源自于大黄花虾脊兰本身的繁殖缺陷。急需建立大规模繁殖手段和科学的有效的保护方法。

发明内容

针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法，从而实现该种植物的快速育苗。

本发明通过以下技术方案予以实现：

珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：选取成熟未开裂的的蒴果，进行消毒操作；

(2)种子萌发培养：切开蒴果取出种子，均匀播撒在已以MS为基本培养基并添加不同浓度的植物生长调节剂培养基上，所述植物生长调节剂为(0-1mg/L)6-BA、(0-0.1mg/L)NAA和(0-0.1mg/L)TDZ的，在光照条件下进行无菌萌发成原球茎，间隔7d检查污染情况与萌发情况；

(3)诱导侧芽分化培养：将剥去叶片的小假鳞茎转接到分化培养基MS+0.05mg/LTDZ+(0.5-2.5mg/L)6-BA中，在光照条件下进行培养，使得原球茎形成侧芽；

(4)生根壮苗培养：当分化后的小苗长出1-2片叶子、叶长2-3cm时便可转接到生根壮苗培养基中，以MS为基本培养基，添加0.2-1.5mg/L萘乙酸NAA，在光照条件下进行培养，60d后统计生根壮苗后小苗的叶片数量、根数及根长，培养成组培幼苗；

(5)炼苗与移栽：先将组培幼苗移入温室中炼苗4至14天，再将幼苗从培养基中取出后进行清洗、消毒浸泡；然后移栽到装有基质的育苗穴盘中，每穴孔移入一株苗，移栽完成后浇透水，定期喷施营养液并进行常规管理。

优选地，所述步骤(2)中萌发培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.1mg/LTDZ。

优选地，所述步骤(3)中分化培养基为MS+0.05mg/L TDZ+2.5mg/L 6-BA。

优选地，所述步骤(4)中生根壮苗培养基为MS+0.5mg/L NAA

优选地，所述步骤(5)中炼苗时间为7d，育苗穴盘中的基质为花生壳：腐质土＝1∶1的复合基质。

与现有技术相比，本发明有益效果包括：

(1)本发明选取成熟未开裂的的蒴果作为外植体，依次经过消毒、种子萌发、侧芽分化、生根壮苗、炼苗和移栽，优化各阶段培养参数，克服了大黄花虾脊兰本身的繁殖缺陷，建立大规模繁殖手段和科学的有效的保护方法。

(2)本发明对种子萌发、侧芽分化、生根壮苗、移栽等各个阶段中培养基质、炼苗时间进行选择优化，筛选出适宜的培养基成分和炼苗时间，诱导虾脊兰种子快速萌发、分化、增值、生根、存活，获得质量优、存活率高的稳定植株。

附图说明

图1为本发明中种子无菌萌发30d、150d、180d、300d、360的过程。

图2为本发明中6-BA不同浓度下诱导侧芽分化情况。

图3为本发明在不同炼苗时间和栽培基质下移栽试管苗的生长情况。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明作进一步地说明。

珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法，包括如下步骤：

1、外植体的消毒

将授粉130d后的自然结实产生的大黄花虾脊兰果实进行消毒操作：在洗涤剂和水混合浸泡20min，流水清洗10min。然后在超净工作台中，用75％乙醇浸泡30s，并使用0.1％升汞消毒10min，灭菌水清洗3遍以上。

2、种子萌发培养

切开蒴果取出种子，均匀播撒在以MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA，NAA，TDZ的培养基表面上，所有培养基均添加6.5g/L琼脂，0.5g/L活性炭，pH＝5.6(下同)，每组重复约10瓶，光周期为12h/d，光强为2000-2500lx，温度为26±2℃，间隔7d检查污染情况与萌发情况，并拍照记录，180d后统计萌发率。如图1，培养约150d后，种子吸水后胚明显膨大，突破种皮；180d后肉眼可观察到原球茎增多，大量叶绿素使得种胚明显增大变绿；300d可见叶芽从叶原基萌出，但根较稀疏；转接生根培养基60d后可见较长根系，叶芽分化出2-4片新叶。

采用正交实验设计表L9对3种植物生长调节剂在3个浓度水平进行优化筛选，结果如下表1所示。

表1种子萌发的正交设计与结果

注：数据为平均值±标准差(n＝10)；kn表示在某个因素时的同一剂量水平的平均值(n＝1，2，3，4)；R表示极差。

由表1可知，第9组的萌发率最高，为34.85％；第一组的萌发率最低，为7.08％。主体间效应分析结果表明：6-BA、TDZ对种子萌发的影响显著(P＝0.001，P＝0.015)；NAA对种子萌发的影响极显著(P＝0.000)。对各因素R值进行比较的结果表明，对种子萌发的影响程度为：NAA＞TDZ＞6-BA.根据K值，6-BA在浓度为0.5mg/L水平上最佳，NAA、TDZ在浓度为0.1mg/L水平上最佳，即在该系列的最佳萌发培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.1mg/L TDZ。

3、诱导侧芽分化培养

将剥去叶片的小假鳞茎转接到分化培养基MS+0.05mg/L TDZ+(0.5，1.5，2.5)mg/L6-BA中，光周期为12h/d，光强为2000-2500lx，温度为26±2℃，间隔7d检查污染情况与萌发情况，每处理接种35瓶，每瓶接4个，每处理重复3次。

6-BA对大黄花虾脊兰诱导侧芽分化有显著作用，其中细胞分裂素6-BA浓度在2.0mg/L诱导侧芽分化效果最好，且随着6-BA浓度的提高，诱导侧芽分化效果也随之上升(如图2、表2)。大黄花虾脊兰侧芽分化的最适合培养基为MS+2.5mg/L 6-BA+0.05mg/L TDZ。

表2 6-BA不同浓度下诱导侧芽分化情况

4、生根壮苗培养

当小苗长出1-2片叶子、叶长2-3cm时便可转接到生根壮苗培养基中，以MS为基本培养基，比较添加不同浓度的萘乙酸NAA(0.2mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L)对大黄花虾脊兰生根壮苗的影响，每个处理组接种10株小苗，光周期为12h/d，光强为2000-2500lx，温度为26±2℃，间隔7d检查污染情况与萌发情况。60d后统计生根壮苗后小苗的叶片数量、根数及根长。

从表3可以看到，小苗在添加0.2mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L的NAA培养基中在叶片数量上没有显著性差异。而分别在添加1.0mg/L，1.5mg/L的NAA的培养基中，大黄花虾脊兰试管苗的生根数量和根长差异不显著，但与其他组差异显著。因此，大黄花虾脊兰生根壮苗的最适合培养基为MS+0.5mg/L NAA。

表3不同浓度的NAA对生根壮苗的影响

注：不同上标字母表示有显著差异(P＜0.05)

5、炼苗与移栽

实验材料为培养360d的组培苗，移入南昌大学兰花苑温室中，自然光照室温下分别炼苗4d，7d，14d，炼苗时间实验结果如表4所示，揭开瓶盖后再炼苗3天使其适应大棚环境。然后从培养基中轻柔提起幼苗，用清水洗去残余培养基，然后用陶氏绿大生、甲基托布津和水1∶1∶1000混合后浸泡10min。清水洗去药液，然后移植到24方孔育苗穴盘中，育苗穴盘内有已灭菌的栽培基质，穴孔边长为6Gm，每穴孔移入一株苗，移栽完成后浇透水。15d喷施1次营养液，进行常规管理。50d后统计植株的成活率以及生长状况(用游标卡尺测量每株幼苗最大叶片的长度和宽度，作为基本生物量指标)。

表4炼苗时间对移栽苗成活率的影响

栽培基质主要分为3组，1)花生壳∶腐殖土(1∶1)；2)花生壳：腐质土∶蛭石(1∶1∶1)；3)花生壳；腐质土：树皮(1∶1∶1)，60d后计数成活率，培养基质为花生壳∶腐殖土(1∶1)的小苗长势最好，成活率也最高达97.9％；而栽培基质为花生壳；腐质土∶蛭石(1∶1∶1)的小苗长势最弱，成活率为81.8％。实验结果(表5)显示，花生壳∶腐殖土(1∶1)的栽培基质最适合大黄花虾脊兰的生长，炼苗的最佳时间为7d。如图3所示，其中：A为对比在炼苗4d、7d、14d移栽移栽苗生长情况；B为移栽120d后的生长情况；为在炼苗7d后移栽在花生壳：腐质土＝1∶1的基质中移栽苗生长情况；D为在炼苗7d后移栽在花生壳：腐质土：蛭石＝1∶1∶1的基质中移栽苗生长情况；E为在炼苗7d后移栽在花生壳：腐质土：树皮＝1∶1∶1的基质中移栽苗生长情况。

表5移栽基质对移栽苗成活率的影响

以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)外植体的消毒：选取成熟未开裂的的蒴果，进行消毒操作；

(2)种子萌发培养：切开蒴果取出种子，均匀播撒在以MS为基本培养基并添加不同浓度的植物生长调节剂培养基上，所述植物生长调节剂为(0-1mg/L)6-BA、(0-0.1mg/L)NAA和(0-0.1mg/L)TDZ的，在光照条件下进行无菌萌发成原球茎，间隔7d检查污染情况与萌发情况；

(3)诱导侧芽分化培养：将剥去叶片的小假鳞茎转接到分化培养基MS+0.05mg/L TDZ+(0.5-2.5mg/L)6-BA中，在光照条件下进行培养，使得原球茎形成侧芽；

(4)生根壮苗培养：当分化后的小苗长出1-2片叶子、叶长2-3cm时便可转接到生根壮苗培养基中，以MS为基本培养基，添加0.2-1.5mg/L萘乙酸NAA，在光照条件下进行培养，60d后统计生根壮苗后小苗的叶片数量、根数及根长，培养成组培幼苗；

(5)炼苗与移栽：先将组培幼苗移入温室中炼苗4至14天，再将幼苗从培养基中取出后进行清洗、消毒浸泡；然后移栽到装有基质的育苗穴盘中，每穴孔移入一株苗，移栽完成后浇透水，定期喷施营养液并进行常规管理。

2.根据权利要求1所述的珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法，其特征在于：所述步骤(2)中萌发培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+0.1mg/L TDZ。

3.根据权利要求1所述的珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法，其特征在于：所述步骤(3)中分化培养基为MS+0.05mg/L TDZ+2.5mg/L 6-BA。

4.根据权利要求1所述的珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法，其特征在于：所述步骤(4)中生根壮苗培养基为MS+0.5mg/L NAA。

5.根据权利要求1所述的珍稀濒危植物大黄花虾脊兰的种子非共生萌发方法，其特征在于：所述步骤(5)中炼苗时间为7d，育苗穴盘中的基质为花生壳∶腐质土＝1∶1的复合基质。

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