CN110959530A - 一种无距虾脊兰野外回归方法 - Google Patents

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田敏
王彩霞
张莹
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    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques

Abstract

本发明涉及一种无距虾脊兰野外回归方法。本发明通过组织培养的无距虾脊兰繁殖速度快、繁殖系数大，克服了野外萌发率极低的现状，从种子转化到再生植株的时间极短，确定了适宜无距虾脊兰野外回归的林分环境，提高了无距虾脊兰野外回归的存活率。

Description

一种无距虾脊兰野外回归方法
发明领域
本发明涉及一种无距虾脊兰野外回归方法，属于濒危植物保育技术领域。
背景技术
无距虾脊兰为兰科虾脊兰属，是中国特有种。无距虾脊兰于1951年首次在浙江省临安西天目山境内发现并命名，其模式标本即采自西天目山。其它分布地仅限于江西武宁、福建崇安及沙县、贵阳及梵净山等地。《中国物种红色名录》将虾脊兰属植物全部列为濒危或濒临灭绝等级，2015年专家对中国虾脊兰属的生存状况重新进行了评估，明确了无距虾脊兰的濒危等级为极危。无距虾脊兰具有一定的观赏价值，其总状花序上疏生数朵淡紫色小花，典雅清秀，植株飘逸挺拔。无距虾脊兰野生种群的繁育能力低下，其种子细小，野外萌发率极低，实生苗少，对种群的更新和维持贡献较小。其自然种群主要以无性繁殖为主，但每个基株的分株一般只有1～2个，自然繁殖系数较低，当母株受到侵害时，直接影响到种群数量的稳定性，小的种群存在随时灭绝的可能性。
发明内容
为了解决无距虾脊兰野生种群有性繁殖能力低下、野生资源濒临灭绝的问题，本发明提出一种无距虾脊兰种苗野外回归的技术，提高了无距虾脊兰野生回归的存活率。
本发明的目的通过如下技术方案来实现：
一种无距虾脊兰野外回归方法，所述方法包括下列步骤：
(1)人工授粉及蒴果选择
对野外处于盛花期的无距虾脊兰开花植株进行人工授粉，采摘授粉后合适胚龄的幼果；
(2)无菌播种
取出幼果中的种子，将种子抖落在基础MS培养基表面发育形成原球茎；
(3)种苗繁育
将原球茎再转接到增殖培养基中获得无菌萌发植株，在壮苗培养基上进行壮苗培养，培养获得无菌瓶苗；
(4)种苗的移栽驯化
选取健壮的无菌瓶苗，将小苗移栽于育苗盘中，在温室大棚中进行驯化栽培获得回归苗；
(5)回归生境选择与栽植
选择与原生境相似或邻近的林分环境栽培定植回归苗。
本发明通过人工授粉，将种子在基础MS培养基生成原球茎，再转接到增殖培养基中获得无菌萌发植株，解决了无距虾脊兰发芽力低等缺点，壮苗后经过温室大棚中进行驯化栽培，获得长势良好的回归苗，并选择在与无距虾脊兰原生境相似或邻近的林分环境进行栽植，继而提高了无距虾脊兰存活率，达到了野外回归的效果。
上述一种无距虾脊兰野外回归方法中，所述步骤(2)培养基的成分为MS+30g·L-1蔗糖+8.0g·L-1琼脂，pH＝5.8。无距虾脊兰花种子极细，种子内仅有一个发育不完全的胚，发芽力很低，加之种皮不易吸收水分，用常规方法播种不能萌发，故需要人工培养基来供给养分，才能萌发,MS培养基无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足种子萌发的营养和生理需要。
上述一种无距虾脊兰野外回归方法中，其特征在于步骤(3)的增殖培养基成分为：MS+1.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA，pH＝5.8。较高浓度的6-BA和较低浓度NAA的配比可加快原球茎的增殖速度。
上述一种无距虾脊兰野外回归方法中，其特征在于步骤(3)的壮苗培养基成分为：MS+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA，pH＝5.8。较低浓度的6-BA和较高浓度的NAA主要用于诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。
上述的一种无距虾脊兰野外回归方法，其特征在于，在基础MS培养基、增殖培养基、壮苗培养基的培养条件均为：培养温度25±2℃，光照光强2500～3000Lux，光照时间16h·d-1,暗培养8h·d-1。研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗培养下比在光下更好。所以光照强度和光照时间对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，而且适宜的暗培养可以减少种子和原球茎褐化，从而提高原球茎的诱导率和生长状态。
上述一种无距虾脊兰野外回归方法中，步骤(4)的无菌瓶苗为苗长5～10cm高，苗基部长出3条以上新根。长出新根后的无菌瓶苗在种苗移栽后易于成活。
上述一种无距虾脊兰野外回归方法中，步骤(2)温室大棚进行驯化栽培的条件为：空气湿度应控制在60％～80％，散射光强度控制在1000Lux～3000Lux。无距虾脊兰一般生长在透水和保水性良好的倾斜山坡或石隙，稀疏的山草旁，次生杂木林阴下，或有遮阴，日照时间短的地方，温室大棚条件能满足无距虾脊兰的习性忌阳光直射，喜湿润，忌干燥。
上述一种无距虾脊兰野外回归方法中，所述步骤(5)的的林分环境为林分郁闭度为0.4～0.6的沙壤土林下坡地。沙壤土林下坡地土质疏松，排水良好，富含有机质，以及水源条件好，阴湿、通风良好能满足无距虾脊兰的习性。
上述一种无距虾脊兰野外回归方法中，所述步骤(6)的回归苗为在温室大棚驯化栽培二年后的苗,具体规格为：苗高＞5.0cm，苗径＞0.15cm，叶片数≥3，根数≥5，有种球。
本发明方法具有如下优点：本申请通过组织培养的无距虾脊兰繁殖速度快、繁殖系数大，克服了野外萌发率极低的现状，从种子转化到再生植株的时间极短，确定了适宜无距虾脊兰野外回归的林分环境，在林分郁闭度为0.4～0.6提高了无距虾脊兰野外回归的存活率。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
本实施例提供一种无距虾脊兰野外回归方法，包括如下步骤：
(1)人工授粉及蒴果选择
野生居群中，在盛花期4月挑选晴朗的上午，于10：00对开花植株进行人工授粉。授粉时，用镊子取出花粉块放置在粘性的柱头上。
将授粉后120d的健康、无病虫害的蒴果带回实验室，将蒴果先置于流水下冲洗30min，然后在接种室的超净工作台上用75％酒精表面擦拭，用2.5％次氯酸钠溶液灭菌20min，无菌水冲洗6次，将灭菌处理后的蒴果置于灭菌滤纸上吸干水分后，用解剖刀纵向切开果实，获得种子。
(2)无菌播种
将蒴果内粉末状的种子均匀撒在MS培养基上，培养温度为25℃，光照光强为2800Lux，光照时间为12h·d-1。
(3)种苗繁育
播种90d后形成原球茎，然后将原球茎转接到增殖培养基中进行培养，120d后分化发育形成小苗。将小苗转移到壮苗培养基上进行继代培养，60d后可获得大量完整的长约4～5cm的瓶苗。
(4)种苗的移栽驯化
待瓶苗长至5～10cm高，苗基部长出3条以上新根，选取健壮的瓶苗，打开瓶盖放置3～5d，用镊子轻轻取出瓶苗，放入清水中，洗去瓶苗根部的培养基。将洗净的小苗移栽于育苗盘中，在温室大棚中进行驯化栽培，大棚空气湿度应控制在70％，散射光强度控制在2000Lux。
(5)回归生境选择与栽植
选择在温室大棚驯化栽培二年后(具体规格为：苗高＞5.0cm，苗径＞0.15cm，叶片数≥3，根数≥5，有种球)的回归苗，在3月15日在与原生境相似或邻近的林分环境，林分郁闭度约为0.4～0.6，土质疏松，排水良好，富含有机质的沙壤土，以及水源条件好，阴湿、通风良好的林下坡地进行野外栽培定植，栽植前，清除杂灌、草、杂质和残渣，清除土中大石块、树根等，按20cm×20cm株行距进行栽植，起穴，将驯化苗栽植在穴中，覆土，覆土厚度以盖住根系约3cm～5cm为宜。每月定期到野生栽植点进行查看，对已受病虫侵害的植株，及时清理，对于被雨水冲出根的苗，及时培土。
表1：无距虾脊兰野外播种和MS培养基中播种萌发率
野外播种 MS培养基播种
萌发率(％) 0 32
表2：不同郁闭度下无距虾脊兰栽植半年后的存活率统计
郁闭度 0.2 0.4 0.6 0.8
栽培数 100 100 100 100
存活数 45 80 85 60
存活率(％) 45 80 85 60
野外播种主要是将采到的成熟果实打开后,把里面的种子撒播于原生地林下的土壤里。
由上述统计表可知本发明通过组织培养，克服了无距虾脊兰种子细小，野外萌发率极低的现状，快速获得大量的回归苗，选择林分郁闭度约为0.4～0.6，土质疏松，排水良好，富含有机质的沙壤土，以及水源条件好，阴湿、通风良好的林下坡地进行野外栽培定植，进一步促进了无距虾脊兰幼苗的成长，显著提高了无距虾脊兰栽植野外回归的存活率。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (9)

1.一种无距虾脊兰野外回归方法，所述方法包括下列步骤：
(1)人工授粉及蒴果选择
对野外处于盛花期的无距虾脊兰开花植株进行人工授粉，采摘授粉后合适胚龄的幼果；
(2)无菌播种
取出幼果中的种子，将种子抖落在基础MS培养基表面发育形成原球茎；
(3)种苗繁育
将原球茎再转接到增殖培养基中获得无菌萌发植株，在壮苗培养基上进行壮苗培养，培养获得无菌瓶苗；
(4)种苗的移栽驯化
选取健壮的无菌瓶苗，将小苗移栽于育苗盘中，在温室大棚中进行驯化栽培，获得回归苗；
(5)回归生境选择与栽植
选择与原生境相似或邻近的林分环境栽培定植回归苗。
2.根据权利要求1所述的一种无距虾脊兰野外回归方法，其特征在于，步骤(2)所述培养基的成分为MS+30g·L-1蔗糖+8.0g·L-1琼脂，pH＝5.8。
3.根据根据权利要求1的一种无距虾脊兰野外回归方法，其特征在于，步骤(3)所述增殖培养基的成分为MS+1.0mg·L-16-BA+0.05mg·L-1NAA，pH＝5.8。
4.根据权利要求1所述的一种无距虾脊兰野外回归方法，其特征在于，步骤(3)所述壮苗培养基的成分为MS+0.5mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA，pH＝5.8。
5.根据权利要求1所述的一种无距虾脊兰野外回归方法，其特征在于，基础MS培养基、增殖培养基、壮苗培养基的培养条件均为：培养温度25±2℃，光照光强2500～3000Lux，光照时间16h·d-1,暗培养8h·d-1。
6.根据权利要求1所述的一种无距虾脊兰野外回归方法，其特征在于，所述步骤(4)中的无菌瓶苗为：苗长5～10cm高，苗基部长出3条以上新根。
7.根据根据权利要求1所述的一种无距虾脊兰野外回归方法，其特征在于，步骤(4)所述温室大棚进行驯化栽培的条件为：空气湿度应控制在60％～80％，散射光强度控制在1000Lux～3000Lux。
8.根据权利要求1所述的一种无距虾脊兰野外回归方法，其特征在于，步骤(5)所述林分环境为林分郁闭度为0.4～0.6的沙壤土林下坡地。
9.根据权利要求1所述的一种无距虾脊兰野外回归方法，其特征在于，步骤(5)所述驯化后的回归苗：苗高＞5.0cm，苗径＞0.15cm，叶片数≥3，根数≥5，有种球。
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