CN106258997A - 无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法 - Google Patents

无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，该无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法通过外植体采集、营养芽诱导、类原球茎的诱导及繁殖、分化培养、壮苗培养及移栽6个步骤得到种苗；本发明的目的旨在提供一种简单、易行、经济、高效的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法。

Description

无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物组织培养方法的领域，尤其是无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法。
背景技术
无距虾脊兰(CalanthetsoongianaT.TangetF.T.Wang.)为中国特有的兰科植物，是一类十分受人喜爱而又易栽培的兰花，其花色艳丽，具有极高的观赏价值。无距虾脊兰主要分布于我国浙江、江西、福建、贵州和广西等地，常见于海拔450～1450m的山坡林下、路边和阴湿岩石上。
虽然我国具有丰富的无距虾脊兰资源，但由于无距虾脊兰野生环境遭到严重破坏，加上人们对无距虾脊兰进行过度采挖，导致其野生资源锐减，分布范围急剧减少，使这一珍稀兰科植物处于濒危灭绝的边缘，目前无距虾脊兰已列为国家二级保护植物，因此迫切需要对无距虾脊兰进行人工繁育。
目前，无距虾脊兰种苗主要通过分株方式繁殖，但分株繁殖系数极低，远远不能满足市场的需要。另外，无距虾脊兰种子由于胚发育不完全，自然状态下极难萌发。因此，通过植物组织培养技术进行无距虾脊兰种苗繁殖，以达到保护无距虾脊兰野生资源、进行可持续开发利用是十分必要的。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的在于提供一种简单、易行、经济、高效的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是这样的：一种无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，包括以下步骤：
步骤1：外植体采集，采集生长健壮的无距虾脊兰的叶鞘未打开的营养芽为外植体；
步骤2：营养芽诱导，将外植体接种到营养芽诱导培养基中培养即可诱导形成不定芽；
步骤3：类原球茎的诱导及增殖，切取步骤2所得的不定芽的茎尖并接种到类原球茎诱导培养基中诱导类原球茎的形成并进行类原球茎的增殖；
步骤4：分化培养，将步骤3所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中分化出小苗；
步骤5：壮苗培养，将步骤4得到的小苗转接到壮苗培养基中培养形成试管苗；
步骤6：移栽，得到种苗。
在上述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法中，步骤2中营养芽诱导培养基包括：1/2MS、0.2～1.0mg/L6-BA、0.1～0.5mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁，pH为5.4～5.8。
需要说明的是：50～100ml/L椰子汁是指1L培养基中，含有50-100ml天然椰汁或与天然椰汁浓度相同或相近的椰汁。
在上述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法中，所述的步骤2诱导时间为20～30天。
在上述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法中，所述的步骤3中所述的类原球茎诱导培养基包括：MS、2.0～5.0mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
在上述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法中，所述的步骤3中的培养时间为45～60天，增殖周期为20～30天，增殖系数为5～7倍。
在上述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法中，所述的步骤4中所述的原球茎分化培养基包括：MS、0.5～1.5mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
在上述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法中，所述的步骤4中培养时间为30～40天。
在上述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法中，步骤5中所述的壮苗培养基包括：MS、1.0～2.0mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100g/L香蕉汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH为5.4～5.8。
需要说明的是：50～100g/L香蕉汁是指在1L培养基中，含有50-100g去皮香蕉。
在上述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法中，所述的步骤5中培养时间为20～30天。
在上述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法中，步骤2～5的培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～16小时/天；
所述的步骤2中，还包括对外植体接种前对外植体进行清水冲洗、升汞消毒、无菌水漂洗；
所述的步骤6具体为：将步骤5所得健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗3～5天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明利用植物组织培养技术进行无距虾脊兰优质种苗规模化繁殖，建立了无距虾脊兰优质种苗快速繁殖技术体系，具有高效、简单、易行、经济的特点。
2.通过本发明育成的无距虾脊兰试管苗移栽成活率达到90％以上，可以为无距虾脊兰优质种苗的生产提供一条有效的途径。
具体实施例
下面结合具体实施方式对本发明的权利要求最进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。
实施例1
1)外植体采集
春季当营养芽生长时，选取生长健壮的无距虾脊兰的叶鞘未打开的营养芽为外植体。
2)营养芽诱导
将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗下剥去外面的叶鞘至仅剩两层叶鞘。将包裹有两层叶鞘的营养芽置于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒30分钟，无菌水冲洗2次后剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟。无菌水冲洗3次后剥去最后一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5分钟，无菌水冲洗5次后经无菌滤纸吸干水分后剪切成0.3cm左右的芽点并接种至营养芽诱导培养基中培养21天即可诱导形成不定芽，污染率为5.3％。
所述的营养芽诱导培养基为：1/2MS+0.3mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂+60ml/L椰子汁，pH为5.6。
3)类原球茎的诱导及增殖
切取步骤2)所得的不定芽的茎尖并接种到类原球茎诱导培养基中培养50天即可诱导类原球茎的形成，并在该培养基中进行类原球茎的增殖，增殖系数为5.4倍，增殖周期为23天。
所述的类原球茎诱导培养基为：MS+3.5mg/L6-BA+0.6mg/LNAA+18g/L蔗糖+5.0g/L琼脂+75ml/L椰子汁+0.5g/L活性炭，pH为5.6。
4)分化培养
将步骤3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养33天即能分化出小苗，分化率达到87.3％。
所述的原球茎分化培养基为：MS+1.1mg/LNAA+23g/L蔗糖+3.8g/L琼脂+0.3g/L活性炭，pH为5.64～5.8。
5)壮苗培养
将步骤4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养25天即能形成试管苗，生根率达到97.8％。
所述的壮苗培养基为：MS+1.0mg/LNAA+15g/L蔗糖+4.5g/L琼脂+50g/L香蕉汁+0.3g/L活性炭，pH为5.6。
6)移栽
将步骤5)所得健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗3天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培60天后，成活率达到93.7％。
上述步骤2)～5)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12小时/天。
实施例2
1)外植体采集
春季当营养芽生长时，选取生长健壮的无距虾脊兰的叶鞘未打开的营养芽为外植体。
2)营养芽诱导
将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗下剥去外面的叶鞘至仅剩两层叶鞘。将包裹有两层叶鞘的营养芽置于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒45分钟，无菌水冲洗3次后剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟。无菌水冲洗4次后剥去最后一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒6分钟，无菌水冲洗6次后经无菌滤纸吸干水分后剪切成0.4cm左右的芽点并接种至营养芽诱导培养基中培养25天即可诱导形成不定芽。诱导率达到83.6％，污染率低于3％。
所述的营养芽诱导培养基为：1/2MS+0.6mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+18g/L蔗糖+5.0g/L琼脂+70ml/L椰子汁，pH为5.5。
3)类原球茎的诱导及增殖
切取步骤2)所得的不定芽的茎尖并接种到类原球茎诱导培养基中培养53天即可诱导类原球茎的形成，并在该培养基中进行类原球茎的增殖，增殖系数为5.1倍，增殖周期为24天。
所述的类原球茎诱导培养基为：MS+4.0mg/L6-BA+0.6mg/LNAA+26g/L蔗糖+5.5g/L琼脂+65ml/L椰子汁+0.35g/L活性炭，pH为5.5。
4)分化培养
将步骤3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养36天即能分化出小苗，分化率达到87.4％。
所述的原球茎分化培养基为：MS+1.2mg/LNAA+27g/L蔗糖+4.8g/L琼脂+0.3g/L活性炭，pH为5.5。
5)壮苗培养
将步骤4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养25天即能形成试管苗，生根率达89.1％。
所述的壮苗培养基为：MS+1.5mg/LNAA+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂+80g/L香蕉汁+0.4g/L活性炭，pH为5.5。
6)移栽
将步骤5)所得健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗4天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培60天后成活率达到96.2％。
上述步骤2)～5)的培养条件为：培养温度为27℃，光照强度为1800lx，光照时间为14小时/天。
实施例3
1)外植体采集
春季当营养芽生长时，选取生长健壮的无距虾脊兰的叶鞘未打开的营养芽为外植体。
2)营养芽诱导
将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗下剥去外面的叶鞘至仅剩两层叶鞘。将包裹有两层叶鞘的营养芽置于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒50分钟，无菌水冲洗3次后剥去一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟。无菌水冲洗5次后剥去最后一层叶鞘，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水冲洗7次后经无菌滤纸吸干水分后剪切成0.5cm左右的芽点并接种至营养芽诱导培养基中培养29天即可诱导形成不定芽。诱导率达到91.5％，污染率低至2％。
所述的营养芽诱导培养基为：1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.4mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁，pH为5.8。
3)类原球茎的诱导及增殖
切取步骤2)所得的不定芽的茎尖并接种到类原球茎诱导培养基中培养51天即可诱导类原球茎的形成，并在该培养基中进行类原球茎的增殖，增殖系数为6.3倍，增殖周期为24天。
所述的类原球茎诱导培养基为：MS+5.0mg/L6-BA+0.8mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+80ml/L椰子汁+0.5g/L活性炭，pH为5.8。
4)分化培养
将步骤3)所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中培养35天即能分化出小苗，分化率达到94.2％。
所述的原球茎分化培养基为：MS+1.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+0.5g/L活性炭，pH为5.8。
5)壮苗培养
将步骤4)得到的小苗转接到壮苗培养基中培养20天即能形成试管苗，生根率达到95％以上。
所述的壮苗培养基为：MS+1.8mg/LNAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100g/L香蕉汁+0.4g/L活性炭，pH为5.8。
6)移栽
将步骤5)所得健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗5天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培60天后成活率达95％以上。
上述步骤2)～5)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为2000lx，光照时间为15小时/天。
上述实施例利用植物组织培养技术进行无距虾脊兰优质种苗规模化繁殖，建立了无距虾脊兰优质种苗快速繁殖技术体系，具有高效、简单、易行、经济的特点，在上述实施例中无距虾脊兰试管苗移栽成活率达到90％以上，可以为无距虾脊兰优质种苗的生产提供一条有效的途径。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：外植体采集，采集生长健壮的无距虾脊兰的叶鞘未打开的营养芽为外植体；
步骤2：营养芽诱导，将外植体接种到营养芽诱导培养基中培养即可诱导形成不定芽；
步骤3：类原球茎的诱导及增殖，切取步骤2所得的不定芽的茎尖并接种到类原球茎诱导培养基中诱导类原球茎的形成并进行类原球茎的增殖；
步骤4：分化培养，将步骤3所得的类原球茎接种到原球茎分化培养基中分化出小苗；
步骤5：壮苗培养，将步骤4得到的小苗转接到壮苗培养基中培养形成试管苗；
步骤6：移栽，得到种苗。
2.根据权利要求1所述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，其特征在于，步骤2中营养芽诱导培养基包括：1/2MS、0.2～1.0mg/L6-BA、0.1～0.5mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁，pH值为5.4～5.8；诱导时间为20～30天。
3.根据权利要求1所述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤3中所述的类原球茎诱导培养基包括：MS、2.0～5.0mg/L6-BA、0.5～1.0mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100ml/L椰子汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH值为5.4～5.8；所述的培养时间为45～60天，增殖周期为20～30天，增殖系数为5～7倍。
4.根据权利要求1所述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤4中所述的原球茎分化培养基包括：MS、0.5～1.5mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、0.2～0.5g/L活性炭，pH值为5.4～5.8；所述的培养时间为30～40天。
5.根据权利要求1所述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，其特征在于，步骤5中所述的壮苗培养基包括：MS、1.0～2.0mg/LNAA、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、50～100g/L香蕉汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH值为5.4～5.8；所述的培养时间为20～30天。
6.根据权利要求1至5任一所述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，其特征在于，步骤2～5的培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～16小时/天。
7.根据权利要求1或2所述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤2中，还包括接种前对外植体进行清水冲洗、升汞消毒、无菌水漂洗的步骤。
8.根据权利要求1所述的无距虾脊兰优质种苗快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤6具体为：将步骤5所得健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗3～5天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得种苗。
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