CN108094204A - 一种距瓣尾囊草种子组培快繁方法 - Google Patents

一种距瓣尾囊草种子组培快繁方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于草本植物繁殖技术领域，公开了一种距瓣尾囊草种子组培快繁方法，10％次氯酸钠消毒处理种子30min，外植体污染率仅为5.6％，存活率82.7％；植物生长调节剂诱导条件是MS+2mg·L‑1 6‑BA+0.1mg·L‑1NAA，种子萌芽率67.1％；400mg·L‑1赤霉素浸种12h，萌芽率83.91％；MS+0.5mg·L‑1TDZ+0.1mg·L‑1NAA中增殖系数2.23；组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L‑ 1NAA上生根培养，生根率88.3％；移栽基质筛选试验中，腐殖土：蛭石＝1:1条件下距瓣尾囊草组培苗生长效果最好，成活率达66.7％。

Description

一种距瓣尾囊草种子组培快繁方法
技术领域
本发明属于草本植物繁殖技术领域，尤其涉及一种距瓣尾囊草种子组培快繁方法。
背景技术
2010年11月，距瓣尾囊草(Urophysa rockii)被列为国家“一级珍稀保护植物”名录，目前数量稀少，种子自然萌发率极低，繁殖困难。距瓣尾囊草为多年生草本。根状茎粗壮，木质，粗约1厘米。叶多数；叶片的轮廓卵形或宽卵形，长2.3-5.2厘米，宽2.6-7厘米，中全裂片有长0.3-2.5厘米的柄，宽菱形或扇状菱形，宽1.8-3.5厘米，三深裂，深裂片常具三圆齿，两面均疏被白色短柔毛，侧全裂片无柄或具1-2毫米的短柄，斜扇形，不等二深裂；叶柄长8.5-14厘米，被白色短柔毛，基部有鞘。花葶长7-12厘米；聚伞花序通常有1花；苞片1-2，线形或披针状线形，长3-6毫米，宽约1毫米；花梗长4.5-10厘米；萼片天蓝色，倒卵形至宽椭圆形，连同爪共长约2厘米，宽7-8毫米，顶端钝；花瓣船形，长约6毫米，顶端钝，距长约2毫米；雄蕊长8-10毫米，花药长约1毫米，黄色；退化雄蕊披针形，白膜质，与花瓣近等长；心皮5，长约1厘米。蓇葖长约4毫米，密生明显的横脉，疏被短柔毛，宿存花柱丝形，长达8毫米；种子椭圆形，长约1.5毫米，暗褐色，密生小疣状突起。3月开花，4月开始结果。
综上所述，现有技术存在的问题是：目前该物种只能通过种子播种繁殖，且繁殖困难。通过组培繁殖，能极大提高繁殖速率，增加植株数量，更好地保护该国家一级保护植物。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种距瓣尾囊草种子组培快繁方法。
本发明是这样实现的，一种距瓣尾囊草种子组培快繁方法，所述距瓣尾囊草种子组培快繁方法
步骤一，10％次氯酸钠消毒处理距瓣尾囊草种子30min；
步骤二，芽诱导培养，MS+2mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1NAA；400mg·L-1赤霉素浸种12h；
步骤三，继代增殖培养，MS+0.5mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA中芽增殖；
步骤四，组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L-1NAA上生根培养；
步骤五，移栽基质体积比腐殖土：蛭石＝1:1条件下距瓣尾囊草组培苗生长。
进一步，所述距瓣尾囊草种子组培快繁方法的培养基中加3％蔗糖、0.7％琼脂粉和0.05％活性炭，pH5.8，按植物组织培养配制和灭菌。
进一步，培养温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度为1500～2000lx。
进一步，将有生根组培苗的培养瓶放置于室温自然光照条件下炼苗3-5d，后揭开封口膜，用镊子轻轻夹出小苗，在自来水下冲洗干净基部残留的培养基，用0.1％的多菌灵溶液消毒3-5min；再用清水洗净，栽种到预先消毒处理过的基质中，基质用营养钵分装，每钵栽种1株，浇水淋透，保湿遮荫；1周后再浇水1次，15d喷施1次营养液，常规管理。
本发明的另一目的在于提供一种采用所述距瓣尾囊草种子组培快繁方法繁殖的距瓣尾囊草。
本发明以距瓣尾囊草种子为外植体，通过消毒条件、芽诱导、芽增殖、生根和移栽试验探索种子快繁的最佳无菌培养条件。10％次氯酸钠消毒处理种子30min，消毒效果最好，外植体污染率仅为5.6％，存活率可达82.7％，因此该条件适合作为距瓣尾囊草种子的消毒剂，而0.1％升汞不适合作为种子的消毒剂。种子的芽诱导培养条件：植物生长调节剂诱导条件是MS+2mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1NAA，种子萌芽率达67.1％；400mg·L-1赤霉素浸种12h，距瓣尾囊草种子萌芽率最高，达83.91％。MS+0.5mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA中芽增殖效果最好，增殖系数达2.23。组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L-1NAA上生根培养，生根率可达88.3％，生根条数可达2-3。移栽基质筛选试验中，腐殖土：蛭石＝1:1条件下距瓣尾囊草组培苗生长效果最好，成活率达66.7％。
附图说明
图1是本发明实施例提供的距瓣尾囊草种子组培快繁方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的距瓣尾囊草种子组培快繁方法包括以下步骤：
S101：10％次氯酸钠消毒处理距瓣尾囊草种子30min；
S102：芽诱导培养，MS+2mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1NAA；400mg·L-1赤霉素浸种12h；
S103：继代增殖培养，MS+0.5mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA中芽增殖；
S104：组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L-1NAA上生根培养；
S105：移栽基质为腐殖土：蛭石＝1:1条件下距瓣尾囊草组培苗生长。
下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
(1)外植体消毒
10％次氯酸钠消毒处理种子30min，消毒效果最好，外植体污染率仅为5.6％，存活率可达82.7％，因此该条件适合作为距瓣尾囊草种子的消毒剂，而0.1％升汞不适合作为种子的消毒剂。
试验方法：
a.0.1％升汞作为消毒剂
种子洗净后，用自来水清洗干净，晾干，备用。置于超净工作台中，用70％乙醇处理后和0.1％升汞溶液分别处理3、5、8、10min，无菌水冲洗8次，接种。记录种子污染率和存活率。
b.次氯酸钠溶液作为消毒剂
种子洗净后，用自来水清洗干净，晾干，备用。置于超净工作台中，用70％乙醇处理后和不同浓度(5％、10％和20％)次氯酸钠溶液处理不同时间(5、15、30min)，无菌水换洗8次，接种。记录种子污染率和存活率。
试验结果：
a.0.1％升汞作为消毒剂
0.1％升汞作为最常用的消毒剂之一，在本试验中对距瓣尾囊草种子消毒效果较好，在处理3、8和10min下均未出现污染情况，仅3、5min处理的种子的污染率为5.00％。0.1％升汞对种子发芽也有明显影响，处理时间5、8和10min下的种子两个月均无发芽迹象，种皮呈深褐色，而3min处理的种子的发芽率仅为6.67％，叶片颜色浅绿。升汞消毒效果好，但是可能抑制种胚生长发育，因此升汞不适合作为种子的消毒剂。
b.次氯酸钠溶液作为消毒剂
距瓣尾囊草消毒试验中，次氯酸钠溶液的各浓度和不同时间处理下的消毒效果差异显著。相同浓度下，外植体随处理时间的延长，污染率逐步降低，存活率提高；相同处理时间下，外植体污染率随次氯酸钠浓度提高而降低，存活率也提高。其中5％次氯酸钠消毒种子5min的效果最差，污染率100％，而10％次氯酸钠消毒种子30min的效果最好，污染率仅为5.6％，存活率可达82.7％。因此，距瓣尾囊草种子的最佳消毒剂为10％次氯酸钠消毒30min。
(2)芽诱导培养
种子的芽诱导培养条件：植物生长调节剂诱导条件是MS+2mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1NAA，种子萌芽率达67.1％；400mg·L-1赤霉素浸种12h下距瓣尾囊草种子萌芽率最高，达83.91％。
试验方法：
采用MS为基本培养基，加入素6-BA(1、2、2.5mg·L-1)，和NAA(0.1、0.2、0.4mg·L-1)进行二因素三水平随机试验，共9种处理，每种处理接种10瓶，每瓶3个外植体，观察萌发情况，记录萌芽率。
经消毒处理的种子接种于10种诱导培养基中，观察发现种子开始萌发时间为22天，最晚的萌发启动时间为60天)。在种子萌发期间，6-BA和NAA的影响较大。在诱导种子萌发过程中，不但需要控制植物生长调节剂的浓度，细胞分裂素和生长素的配比更为重要。在各诱导培养基中，2mg·L-1 6-BA和0.1mg·L-1NAA组合萌芽率最高(67.1％)。在外植体伸长、生长过程中，6-BA的浓度对外植体叶片生长发育影响较大。当6-BA浓度为1mg·L-1时外植体叶片颜色浅绿，部分叶片颜色不均匀，当浓度为2mg·L-1时叶片颜色浓绿，浓度继续增大时叶片全部皱缩。而NAA处理下，距瓣尾囊草外植体在较低浓度下的生长情况明显优于较高浓度。综合生长状况和结果，促进距瓣尾囊草种子萌发和生长的最佳激素组合为2mg·L-16-BA和0.1mg·L-1NAA，萌芽率达67.1％，叶片呈绿色，无皱缩叶片，生长速度快。
(3)赤霉素浸种时间对种子发芽的影响
试验方法：
取籽粒饱满、无病虫害的种子各30粒，分别用400mg·L-1赤霉素浸泡6、12、24、36、48小时，洗净，置于超净工作台消毒后接种于MS+2mg·L-1 6-BA+0.1mg·L-1NAA。观察萌发情况，记录萌芽率。
试验结果：
赤霉素浸种处理种子会提高种子的萌发率，因此继续探索赤霉素浸种时间对发芽的影响。赤霉素浸种时间对距瓣尾囊草种子萌发率有显著影响。浸种时间为12h时，萌芽率显著高于其他处理，为83.91％，各处理下的萌发启动时间不统一，浸种处理和空白处理启动均在接种后13-21天，可见，赤霉素浸种只能提高萌芽率，不能缩短发芽时间，这可能和距瓣尾囊草种子的种胚在尚未成熟有较大关系。因此，赤霉素的最佳浸种时间选择12h。
(4)继代增殖培养
MS+0.5mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA中芽增殖效果最好，增殖系数达2.23。
试验方法：
在无菌条件下，将生长良好的芽转到增殖培养基上继续培养。培养基中添加噻苯隆TDZ(0.1、0.5、1mg·L-1)和NAA(0.1、0.3mg·L-1)，共六个处理，每个处理接种10瓶，每瓶3个外植体。一个月后统计增殖系数。
试验结果：
培养20d后，在无菌条件下，将生长良好的芽转接到6种增殖培养基，30d统计增殖芽数。各增殖培养基中，都有芽增殖现象，其中以MS+0.5mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA处理增殖效果最好，增殖系数为2.23，显著高于其他处理。总体看来，TDZ浓度相同时，随着NAA浓度(0.1mg·L-1、0.3mg·L-1)提高，增殖系数降低，苗质量也降低；NAA浓度为0.1mg·L-1，增殖系数随TDZ浓度的提高先提高后降低，而NAA浓度为0.3mg·L-1，增殖系数随TDZ浓度的提高而降低，说明距瓣尾囊草芽的增殖以低浓度细胞分裂素和低生长素浓度配比为宜。在培养过程中，不分割增殖的芽，以芽丛形式继续增殖，芽丛越大，芽数量越多，增殖越快。
(5)组培苗的生根培养及移栽
组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L-1NAA上生根培养，生根率可达88.3％，生根条数可达2-3条。
长势良好的组培苗转入添加0.1mg·L-1NAA的1/2MS固体培养基培养7天后，芽基部开始形成白色凸点，培养20天长出较多的白色不定根，生根率可达88.3％，生根条数可达2-3条，植株生长健壮，发育良好。
NAA/(mg·L-1) 生根率/％ 平均根数/条
0.05 45 1.2
0.1 88.3 2.5
0.2 2.2
0.3 25 1.2
(6)培养条件
以上所述培养基中均附加3％蔗糖、0.7％琼脂粉和0.05％活性炭，pH5.8，按植物组织培养常规方法配制和灭菌。培养温度为(25±2)℃，光照时间12h/d，光照强度为1500～2000lx。
(7)炼苗与移栽
移栽基质筛选试验中，腐殖土：蛭石＝1:1条件下距瓣尾囊草组培苗生长效果最好，成活率达66.7％。
将有生根组培苗的培养瓶放置于室温自然光照条件下炼苗3-5d，后揭开封口膜，用镊子轻轻夹出小苗，在自来水下冲洗干净基部残留的培养基，用0.1％的多菌灵溶液消毒3-5min，然后再用清水洗净，栽种到预先消毒处理过的基质中，基质用营养钵分装，每钵栽种1株，浇水淋透，适当保湿遮荫。1周后再浇水1次，15d喷施1次营养液，进行常规管理。10d后苗高可伸长2cm。30d后，苗的成活率达到66.7％，新根发早，根系发达、粗壮，植株生长良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种距瓣尾囊草种子组培快繁方法，其特征在于，所述距瓣尾囊草种子组培快繁方法
步骤一，10％次氯酸钠消毒处理距瓣尾囊草种子30min；
步骤二，芽诱导培养，MS+2mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA；400mg·L-1赤霉素浸种12h；
步骤三，继代增殖培养，MS+0.5mg·L-1TDZ+0.1mg·L-1NAA中芽增殖；
步骤四，组培苗在培养基1/2MS+0.1mg·L-1NAA上生根培养；
步骤五，按照体积比移栽基质为腐殖土：蛭石＝1:1条件下距瓣尾囊草组培苗生长。
2.如权利要求1所述的距瓣尾囊草种子组培快繁方法，其特征在于，所述距瓣尾囊草种子组培快繁方法的培养基中加3％蔗糖、0.7％琼脂粉和0.05％活性炭，pH5.8，按植物组织培养配制和灭菌。
3.如权利要求2所述的距瓣尾囊草种子组培快繁方法，其特征在于，培养温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度为1500～2000lx。
4.如权利要求1所述的距瓣尾囊草种子组培快繁方法，其特征在于，将有生根组培苗的培养瓶放置于室温自然光照条件下炼苗3-5d，后揭开封口膜，用镊子轻轻夹出小苗，在自来水下冲洗干净基部残留的培养基，用0.1％的多菌灵溶液消毒3-5min；再用清水洗净，栽种到预先消毒处理过的基质中，基质用营养钵分装，每钵栽种1株，浇水淋透，保湿遮荫；1周后再浇水1次，15d喷施1次营养液，常规管理。
5.一种采用权利要求1～4任意一项所述距瓣尾囊草种子组培快繁方法繁殖的距瓣尾囊草。
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