CN106577281B - 黄花远志茎段组培高成苗率培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种黄花远志茎段组培高成苗率培育方法，它包括如下步骤：采集及消毒外植体、诱导培养获得腋芽、壮苗培养获得强壮茎段、继代增殖获得组培茎段、诱根培养获得诱根处理茎段、试管外生根。它采用以带有尚未萌发腋芽的半木质化枝条，去除叶片，切取至少带1个节间茎段作为外植体,采用本发明的步骤，利于黄花远志种苗主根形成，提高种苗质量,提高远志药材的产量，且后代种苗不易出现变异，对黄花远志种苗的培育和药材生产具有非常重大的意义。
Description
技术领域
本发明涉及繁殖黄花远志种苗的方法，特别涉及一种黄花远志茎段组培高成苗率培育方法，属于黄花远志种苗培养方法技术领域。
背景技术
黄花远志(Polygala fallax Hemsl.)属远志科(Polygalaceae)远志属(Polygala)植物，别名倒吊黄、黄花参、鸡仔树、观音串、假黄花远志等，分布于江西、福建、湖南、广东、广西和云南，生于山谷林下水旁阴湿处。其根含有皂苷类、糖脂类、酮类等物质，干燥根是一种应用历史悠久的民间常用药，具有补益、强壮、祛湿、散瘀功效，临床用于病后体虚、腰膝酸痛、跌打损伤黄疸、水肿、月经不调等。另外，黄花远志花序倒垂，鲜黄色，长20～30cm，花期从夏到秋长达90d以上，可作为观赏花卉植物开发利用，是一种集药用和绿化观赏为一体的珍稀、名贵植物，经济价值高，具有广阔的市场前景，急需进行规模化人工栽培，为此需要有大量的苗木供应市场，但是不成熟、不完善的繁殖技术是制约黄花远志优良品种推广及规模化种植的主要障碍。
目前，黄花远志种苗的繁殖主要有种子实生繁殖、扦插育苗和组织培养；种子实生繁殖为有性繁殖，后代往往发生性状分离不能保存母株的优良性状；而且由于种子成熟期不一致、采收困难，种子休眠导致自然条件下萌发的成苗率低下，难以满足开发和生产的要求。扦插育苗属于无性繁殖，后代虽然能保持母株优良性状，但是繁殖系数低、速度慢、成苗时间长、成本高、易带病毒导致种质退化，常常受穗条数量限制无法满足生产用苗之需。已报道的组织培养技术尚处于研究阶段，生根率低且不稳定，特别是现有技术生产的试管苗根系为须根，能形成药材的主根发根率低下，难以实现高质量黄花远志种苗的工厂化生产。因此急需建立具主根的黄花远志种苗快速繁殖与高成苗技术。
黄花远志组织培养的研究已见申请发明专利“一种黄花倒水莲的组织培养繁殖方法(申请号201210147606.9)”，以及刘秀芳等发表的研究论文“黄花倒水莲组培快繁技术研究”报道，以上文献均以带腋芽幼嫩茎段作为外植体,采用不定芽增殖的途径快繁，培养过程不定芽容易出现玻璃化及不定芽基部且容易出现愈伤组织，影响种苗质量,且后代种苗易出现变异，不利于优良品种的快速繁殖与推广；试管苗生根培养采用诱导形成毛细须根的方式提高移栽成活率，而黄花远志药用部位是根茎，毛细须根大大影响了根茎的产量；以上文献均未涉及试管苗移栽管理的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄花远志茎段组培高成苗率培育方法，本发明的育苗方法可以利用尚未萌发腋芽的半木质化枝条切取的茎段这类微小器官培育成苗，可以快速选育出能保持母本原有的优良性状和纯度的黄花远志优良株系，能有效提高黄花远志的成苗率。
本方法进一步能有效降低外植体褐变、防止试管苗玻璃化及愈伤组织化的现象，进一步能获得健壮且性状稳定的试管苗，实现黄花远志种苗的快速繁殖，为其规模化生产应用奠定基础。这对黄花远志的工厂化育苗、优良品种或品系的繁育推广具有很大的开发应用价值。
黄花远志茎段组培高成苗率培育方法包括以下步骤：
(1)采集及消毒外植体：采集黄花远志的带有尚未萌发腋芽的半木质化枝条，去除叶片，切取至少带1个节间茎段作为外植体，并对其进行消毒；
(2)诱导培养获得腋芽：切去上述经消毒的无菌外植体的与消毒剂接触的两端部，留下具至少1个节间的茎段，接着将茎段的形态学下端斜插于诱导腋芽萌发的腋芽诱导培养基上进行腋芽诱导培养15-20天，
腋芽诱导培养条件为：温度20±2℃、无光照的黑暗条件；
通过以上的处理，隐形腋芽萌发伸长，有的叶片展开。
(3)壮苗培养获得强壮茎段：切割下经步骤(2)诱导培养的腋芽并转移至强壮腋芽生长的壮苗培养基中进行强壮腋芽生长培养15-20天，
强壮腋芽生长培养条件为：光照强度2000-2500lx、光照时间10-12h/d，温度25±2℃，
通过以上的处理，萌发的腋芽伸长、叶片平展。
(4)继代增殖获得组培茎段：将经步骤(3)获得的健壮茎段转接至继代增殖培养基中进行丛生芽的增殖培养25-35天；
丛生芽的增殖培养条件为：温度20-26℃，光照时间10-12h/d，光照强度2000-2500lx；
通过以上的处理，诱导丛生芽，平均增殖系数为3.5-4.5。
(5)诱根培养获得诱根处理茎段：将经步骤(4)产生的丛生芽从基部切割分离出成单芽，然后将高度大于等于3厘米的丛生芽转入诱根培养基中进行生根处理，
生根处理条件为：25±2℃温度条件下全黑暗培养7-10天，然后再进行光照培养25-35天，光照时间8-10h/d、光照强度2000-2500lx；
通过以上的处理，约85％以上的茎段基部膨大，获得诱根处理茎段。
(6)试管外生根：将经步骤(5)获得的诱根处理茎段进行加强光照培养3-5天，选择茎段叶片浓绿、茎节粗壮的茎段，将诱根处理茎段放入扦插苗床中进行试管外生根处理，然后均匀喷水，使诱根处理茎段和扦插苗床中的扦插基质接触紧密，
试管外生根条件为：遮阳网下具散射光、光照强度4000-5000lx，
试管外生根管理条件为：控制扦插苗床的白天和夜晚温度分别为25℃-30℃和20℃-25℃，空气湿度保持在85-90％，10天后喷淋1000倍多菌灵溶液1次，开始渐减加强光照并逐渐减小空气湿度，直至完全去掉保护措施(指去掉保温和遮阳的设施条件)，15天后喷施0.05％磷酸二氢钾溶液1次，直至苗高大于等于8厘米即可。
进一步地，所述的腋芽诱导培养基为：在1/2B5培养基中加入浓度为1.5-2.0mg/L的NAA、浓度为0.5-0.8g/L的活性炭、浓度为8-12g/L的蔗糖和浓度为7.0-7.8g/L的琼脂，控制pH为5.5-6.5。
使用该腋芽诱导培养基及培养方法，有以下优点：初代培养采用降低了铵盐浓度的1/2B5培养基，适合生长缓慢、对无机盐浓度要求比较低的黄花倒水莲的生长，同时大大减少了铵盐对黄花倒水莲的抑制作用，有利于腋芽的萌发；第三，接种后的外植体置于黑暗、低温条件下，能有效降低外植体的污染率与褐变率，提高培养成功率。
进一步地，所述的壮苗培养基为：1/2B5培养基中加入浓度为0.3-0.5mg/L的NAA、浓度为0.5-0.8mg/L的6-BA、浓度为20-30mg/L的壳聚糖、浓度为20g/L的蔗糖和浓度为7.0-7.8g/L的琼脂，控制上述壮苗培养基的pH为5.5-6.5。
在腋芽萌发后迅速更换培养基并转入提高温度的光照条件下培养，该培养基降低了生长素NAA的浓度、提高了蔗糖使用量，能有效减缓已萌发腋芽的迅速生长，在腋芽叶片尚未完全进行光合作用情况下增加碳源供应，诱导细胞进行光合作用，叶片展开、变绿，避免腋芽玻璃化和基部愈伤组织化，为继代增殖培养提供了强壮的组培茎段。
进一步地，所述的继代增殖培养基为：B5培养基中加入浓度为0.3-0.5mg/L的NAA、浓度为2.7-3.5mg/L的6-BA、浓度为0.5-1.0g/L的胰蛋白胨、浓度为20g/L的蔗糖和浓度为6.5-7.3g/L的琼脂，控制该继代增殖培养基的pH为5.5-6.5。
在培养基中添加胰蛋白胨，能加快细胞壁形成，促进细胞分裂增殖，提高增殖倍数形成丛生芽，实现增殖培养的目的。
进一步地，所述的诱根培养基为：B5培养基中加入浓度为0.5-0.8mg/L的NAA、浓度为0.5g/L的活性炭、浓度为20g/L的蔗糖和浓度为6.7-7.5g/L的琼脂粉，调节该诱根培养基的pH值为5.8-6.5。
进一步地，步骤(5)时，将高度低于3厘米的单芽切成带节茎段并将该带节茎段转入步骤(4)的继代增殖培养基，按照步骤(4)的继代增殖培养的方法继续培养。
进一步地，所述的扦插苗床从下至上依次铺设有3-5厘米的黄壤土层和4-6厘米的扦插层，所述的扦插层的扦插基质由泥炭与河沙以1.5-1.8︰0.5-0.8混合均匀制成；为防止杂菌滋生，当扦插苗床铺好后用稀释600-700倍的多菌灵药液喷透，再用和生根处理茎段粗度相仿的玻璃棒在扦插苗床上按株行距为5厘米×8厘米、插孔深度为1.5-2.5厘米进行插孔，扦插前插孔可以保证组织培养茎段基部不磨损，从而可以防止基部褐化影响根的正常生长。
进一步地，步骤(1)，所述的外植体取自连续3天以上晴天、保持不浇水的露天栽培植株，剪成带1个节间的茎段前，用质量浓度为75％的酒精棉球搽拭外植体2遍以上，剪成带1个节间的茎段后，用质量浓度为0.1％的二氧化氯浸泡处理12-20分钟，并用无菌水冲洗2-3遍，保存于干燥的无菌瓶中。
相比现有技术，本发明存在如下的有益效果：
1.本发明采用以带有尚未萌发腋芽的半木质化枝条，去除叶片，切取至少带1个节间茎段作为外植体,采用本发明的步骤，利于黄花远志种苗主根形成，提高种苗质量,提高远志药材的产量，且后代种苗不易出现变异，对黄花远志种苗的培育和药材生产具有非常重大的意义。
2.初代培养阶段采用诱导腋芽、强壮腋芽两个初代培养的步骤，包括使用不同的诱导培养基及培养条件，其中诱导腋芽的初代培养基添加较低浓度的蔗糖及使用较高的琼脂量有效降低了外植体的污染率，在适宜的诱导培养基中采用黑暗培养降低了褐变率。在腋芽萌发后切下腋芽迅速更换培养基并转入提高温度的光照条件下培养，该培养基降低了生长素NAA的浓度、提高了蔗糖使用量，能有效减缓腋芽的伸长速度，在腋芽叶片尚未完全进行光合作用情况下增加碳源供应，诱导细胞及时进行光合作用，促进叶片展开、变绿，有效降低了腋芽玻璃化和基部愈伤组织化，为继代增殖培养提供了强壮的组培茎段。
3.本发明的试管苗生根方法主要采用试管内暗培养诱根处理，这是黄花远志组织培养茎段诱导根的必要条件，且暗培养达到一定的天数才能发生根原基，但暗培养时间不能太长，否则影响叶片的光合作用功能叶抑制了根系发生。暗培养诱根处理后再进行扦插生根培养，诱导根系直接从皮层长出，茎段基部不发生愈伤组织，且具主根与不定根，根系发达，完成茎段组织培养快繁形成完整植株且成苗率高、造林成活率高，而组织培养生根多是通过诱导愈伤组织再形成须根，导致组培苗移栽时，由于愈伤组织变褐使得根系与茎段之间产生离层、直至死亡，影响了试管苗的移栽成活率，这是黄花远志组织培养难以实现工厂化育苗的瓶颈所在。本发明所述的方法成功克服以上瓶颈，生根率高达95％以上，商品苗成苗率90％左右，实现种苗工厂化生产。
4.本发明采用茎段微小器官诱导腋芽萌发，以芽繁芽，增殖系数达3.5-4.5，既保持母本原有的优良性状和纯度，又可在较短时间内培育出大量苗木，极大地提高了黄花远志的繁殖系数，为该物种的引种驯化、资源保存和商业开发利用提供了有效的繁殖方法。
5.与现有的组织培养相比，本发明提供的黄花远志茎段组织培养方法，约定外植体采集条件及不采用流水冲洗，有效降低了外源杂菌的污染，为后续组织培养获得健壮腋芽及增殖培养奠定了物质基础。
总之，本发明具有生产方法操作性强、缩短育苗周期、提高成苗率与造林成活率、种苗整齐等特点，具有广阔的应用前景和显著的社会经济效益。
具体实施方式
下面结合具体实施方式和具体实施例对本发明进一步阐述。
本发明的B5培养基的基本组成如下表所述：
1/2B5培养基是将上述大量元素和微量元素减半，其他成分不变配制得到。
(一)具体实施方式
黄花远志茎段组培高成苗率培育方法包括以下步骤：
(1)采集及消毒外植体：采集黄花远志的带有尚未萌发腋芽的半木质化枝条，去除叶片，切取至少带1个节间茎段作为外植体，并对其进行消毒；
(2)诱导培养获得腋芽：切去上述经消毒的无菌外植体的与消毒剂接触的两端部，留下具至少1个节间的茎段，接着将茎段的形态学下端斜插于诱导腋芽萌发的腋芽诱导培养基上进行腋芽诱导培养15-20天，
腋芽诱导培养条件为：温度20±2℃、无光照的黑暗条件；
通过以上的处理，隐形腋芽萌发伸长，有的叶片展开。
(3)壮苗培养获得强壮茎段：切割下经步骤(2)诱导培养的腋芽并转移至强壮腋芽生长的壮苗培养基中进行强壮腋芽生长培养15-20天，
强壮腋芽生长培养条件为：光照强度2000-2500lx、光照时间10-12h/d，温度25±2℃，
通过以上的处理，萌发的腋芽伸长、叶片平展。
(4)继代增殖获得组培茎段：将经步骤(3)获得的健壮茎段转接至继代增殖培养基中进行丛生芽的增殖培养25-35天；
丛生芽的增殖培养条件为：温度20-26℃，光照时间10-12h/d，光照强度2000-2500lx；
通过以上的处理，诱导丛生芽，平均增殖系数为3.5-4.5。
(5)诱根培养获得诱根处理茎段：将经步骤(4)产生的丛生芽从基部切割分离出成单芽，然后将高度大于等于3厘米的丛生芽转入诱根培养基中进行生根处理，
生根处理条件为：25±2℃温度条件下全黑暗培养7-10天，然后再进行光照培养25-35天，光照时间8-10h/d、光照强度2000-2500lx；
通过以上的处理，约85％以上的茎段基部膨大，获得诱根处理茎段。
(6)试管外生根：将经步骤(5)获得的诱根处理茎段进行加强光照培养3-5天，待茎段叶片浓绿、茎节粗壮的茎段，后将诱根处理茎段放入扦插苗床中进行试管外生根处理，然后均匀喷水，使诱根处理茎段和扦插苗床中的扦插基质接触紧密，
试管外生根条件为：遮阳网下具散射光、光照强度4000-5000lx，
试管外生根管理条件为：控制扦插苗床的白天和夜晚温度分别为25℃-30℃和20℃-25℃，空气湿度保持在85-90％，10天后喷淋1000倍多菌灵溶液1次，开始渐减加强光照并逐渐减小空气湿度，直至完全去掉保护措施，15天后喷施0.05％磷酸二氢钾溶液1次，当苗高大于等于8厘米时，即可。
进一步地，所述的腋芽诱导培养基为：在1/2 B5培养基中加入浓度为1.5-2.0mg/L的NAA、浓度为0.5-0.8g/L的活性炭、浓度为8-12g/L的蔗糖和浓度为7.0-7.8g/L的琼脂，控制pH为5.5-6.5。
使用该腋芽诱导培养基及培养方法，有以下优点：初代培养采用降低了铵盐浓度的1/2B5培养基，适合生长缓慢、对无机盐浓度要求比较低的黄花倒水莲的生长，同时大大减少了铵盐对黄花倒水莲的抑制作用，有利于腋芽的萌发；第三，接种后的外植体置于黑暗、低温条件下，能有效降低外植体的污染率与褐变率，提高培养成功率。
进一步地，所述的壮苗培养基为：1/2B5培养基中加入浓度为0.3-0.5mg/L的NAA、浓度为0.5-0.8mg/L的6-BA、浓度为20-30mg/L的壳聚糖、浓度为20g/L的蔗糖和浓度为7.0-7.8g/L的琼脂，控制上述壮苗培养基的pH为5.5-6.5。
在腋芽萌发后迅速更换培养基并转入提高温度的光照条件下培养，该培养基降低了生长素NAA的浓度、提高了蔗糖使用量，能有效减缓已萌发腋芽的迅速生长，在腋芽叶片尚未完全进行光合作用情况下增加碳源供应，诱导细胞进行光合作用，叶片展开、变绿，避免腋芽玻璃化和基部愈伤组织化，为继代增殖培养提供了强壮的组培茎段。
进一步地，所述的继代增殖培养基为：B5培养基中加入浓度为0.3-0.5mg/L的NAA、浓度为2.7-3.5mg/L的6-BA、浓度为0.5-1.0g/L的胰蛋白胨、浓度为20g/L的蔗糖和浓度为6.5-7.3g/L的琼脂，控制该继代增殖培养基的pH为5.5-6.5。
在培养基中添加胰蛋白胨，能加快细胞壁形成，促进细胞分裂增殖，提高增殖倍数形成丛生芽，实现增殖培养的目的。
进一步地，所述的诱根培养基为：B5培养基中加入浓度为0.5-0.8mg/L的NAA、浓度为0.5g/L的活性炭、浓度为20g/L的蔗糖和浓度为6.7-7.5g/L的琼脂粉，调节该诱根培养基的pH值为5.8-6.5。
进一步地，步骤(5)时，将高度低于3厘米的单芽切成带节茎段并将该带节茎段转入步骤(4)的继代增殖培养基，按照步骤(4)的继代增殖培养的方法继续培养。
进一步地，所述的扦插苗床从下至上依次铺设有3-5厘米的黄壤土层和4-6厘米的扦插层，所述的扦插层的扦插基质由泥炭与河沙以1.5-1.8︰0.5-0.8混合均匀制成；为防止杂菌滋生，当扦插苗床铺好后用稀释600-700倍的多菌灵药液喷透，再用和生根处理茎段粗度相仿的玻璃棒在扦插苗床上按株行距为5厘米×8厘米、插孔深度为1.5-2.5厘米进行插孔，扦插前插孔可以保证组织培养茎段基部不磨损，从而可以防止基部褐化影响根的正常生长。
进一步地，步骤(1)，所述的外植体取自连续3天以上晴天、保持不浇水的露天栽培植株，剪成带1个节间的茎段前，用质量浓度为75％的酒精棉球搽拭外植体2遍以上，剪成带1个节间的茎段后，用质量浓度为0.1％的二氧化氯浸泡处理12-20分钟，并用无菌水冲洗2-3遍，保存于干燥的无菌瓶中。
(二)具体实施例
实例1
(1)外植体采集与消毒：于连续5天晴天、前一天保持不浇水，剪取黄花倒水莲带有尚未萌发腋芽的半木质化枝条，去除叶片，切取带节茎段作为外植体，用质量浓度为75％的酒精棉球搽拭茎段外植体2遍，再置于超净工作台上，剪成带1个节间的茎段，用质量浓度为0.1％的二氧化氯浸泡处理12min，无菌水冲洗2遍，保存于干燥的无菌瓶中。
(2)诱导培养获得腋芽：用无菌镊子夹取上述经消毒的无菌外植体，切去两端接触消毒剂部分，留下1.0cm长、具1个节间的茎段，将其形态学下端斜插于诱导腋芽萌发的固体培养基上，置于温度25±3℃、无光照的黑暗条件下诱导黄花远志茎段萌发腋芽，诱导培养15天，隐形腋芽萌发伸长，有的叶片展开。其中腋芽诱导培养基为：1/2B5+NAA1.5mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖10g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.5。
(3)壮苗培养获得强壮茎段：选择经过诱导培养的无污染的外植体转移至强壮腋芽生长的培养基中，并置于光照条件下，培养条件为：光照强度2000lx、光照时间10h/天，温度23℃，培养17天，萌发的腋芽伸长、叶片平展。其中壮苗培养基为1/2B5+NAA0.3mg/L+6-BA0.5mg/L+壳聚糖20mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L，pH为5.5。
(4)继代增殖获得组培茎段：将诱导出生长健壮的腋芽切下，转接至继代增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为：温度20℃，光照时间10h/d，光照强度2000lx，增殖培养30天，诱导丛生芽，平均每个芽增殖4.2个。增殖培养基为：B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 2.7mg/L+胰蛋白胨0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂6.5g/L，pH为5.5。
(5)诱根培养获得诱根处理茎段：将增殖培养诱导产生的丛生芽从基部切割分离成单芽，高度低于2cm的单芽切成带节茎段转入继代增殖培养基，按照继代增殖培养的方法继续培养。高度2cm及以上的芽转入生根培养基中进行生根培养，培养条件为温度23℃，光照时间8h/d，光照强度2000lx，培养30天，试管苗基部长出白色根系，生根率平均达93％。诱根培养基为B5+NAA 0.5mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉6.7g/L，调节pH值5.8。
(6)试管外生根处理：将获得的生根处理茎段移出培养室加强光照培养，置于遮阳网下具散射光、光照强度4000lx的地方，3天后茎段叶片浓绿、茎节粗壮即可用于试管外生根。试管外生根前需洗净茎段基部培养基，放入已插好孔的扦插基质中，用喷壶均匀喷水，使组织培养茎段和扦插基质接触紧密。
所述扦插基质按照泥炭与河沙以1.5︰0.8混合均匀，扦插苗床底部先铺上黄壤土3cm-5cm厚度，黄壤土上铺混匀的扦插基质约5cm左右做为扦插层；为防止杂菌滋生，铺好后用600倍的多菌灵药液喷透，再用和生根处理茎段粗度相仿的玻璃棒在扦插苗床上按株行距5cm×8cm的进行插孔，插孔深度为2cm左右。扦插前插孔可以保证组织培养茎段基部不磨损，从而可以防止基部褐化影响根的正常生长。
(7)试管外生根管理
扦插苗床的白天和夜晚温度分别为25℃和20℃，空气湿度保持在85，10天后喷淋1000倍多菌灵溶液1次，开始加强光照并逐渐减小空气湿度，直至完全去掉保护措施。15天后喷施0.05％磷酸二氢钾溶液1次，直至苗高8cm及以上时，即可出圃种植或销售。
实例2
(1)外植体采集与消毒：于连续5天晴天、前一天保持不浇水，剪取黄花倒水莲带有尚未萌发腋芽的半木质化枝条，去除叶片，切取带节茎段作为外植体，用质量浓度为75％的酒精棉球搽拭茎段外植体2遍，再置于超净工作台上，剪成带1个节间的茎段，用质量浓度为0.1％的二氧化氯浸泡处理20min，无菌水冲洗3遍，保存于干燥的无菌瓶中。
(2)诱导培养获得腋芽：用无菌镊子夹取上述经消毒的无菌外植体，切去两端接触消毒剂部分，留下1.0cm长、具1个节间的茎段，将其形态学下端斜插于诱导腋芽萌发的固体培养基上，置于温度28℃、无光照的黑暗条件下诱导黄花远志茎段萌发腋芽，诱导培养15天，隐形腋芽萌发伸长，有的叶片展开。其中腋芽诱导培养基为：1/2B5+NAA 2.0mg/L+活性炭0.8g/L+蔗糖10g/L+琼脂7.8g/L，pH为6.5。
(3)壮苗培养获得强壮茎段：选择经过诱导培养的无污染的外植体转移至强壮腋芽生长的培养基中，并置于光照条件下，培养条件为：光照强度2500lx、光照时间12h/天，温度27℃，培养17天，萌发的腋芽伸长、叶片平展。其中壮苗培养基为1/2B5+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.8mg/L+壳聚糖30mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.8g/L，pH为6.5。
(4)继代增殖获得组培茎段：将诱导出生长健壮的腋芽切下，转接至继代增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为：温度26℃，光照时间12h/d，光照强度2500lx，增殖培养30天，诱导丛生芽，平均每个芽增殖4.2个。增殖培养基为：B5+NAA 0.5mg/L+6-BA3.5mg/L+胰蛋白胨1.0g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.3g/L，pH为6.5。
(5)诱根培养获得诱根处理茎段：将增殖培养诱导产生的丛生芽从基部切割分离成单芽，高度低于2cm的单芽切成带节茎段转入继代增殖培养基，按照继代增殖培养的方法继续培养。高度2cm及以上的芽转入生根培养基中进行生根培养，培养条件为温度27℃，光照时间10h/d，光照强度2500lx，培养30天，试管苗基部长出白色根系，生根率平均达93％。诱根培养基为B5+NAA 0.8mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉7.5g/L，调节pH值6.5。
(6)试管外生根处理：将获得的生根处理茎段移出培养室加强光照培养，置于遮阳网下具散射光、光照强度5000lx的地方，5天后茎段叶片浓绿、茎节粗壮即可用于试管外生根。试管外生根前需洗净茎段基部培养基，放入已插好孔的扦插基质中，用喷壶均匀喷水，使组织培养茎段和扦插基质接触紧密。
所述扦插基质按照泥炭与河沙以1.8︰0.5混合均匀，扦插苗床底部先铺上黄壤土3cm-5cm厚度，黄壤土上铺混匀的扦插基质约5cm左右做为扦插层；为防止杂菌滋生，铺好后用700倍的多菌灵药液喷透，再用和生根处理茎段粗度相仿的玻璃棒在扦插苗床上按株行距5cm×8cm的进行插孔，插孔深度为2cm左右。扦插前插孔可以保证组织培养茎段基部不磨损，从而可以防止基部褐化影响根的正常生长。
(7)试管外生根管理
扦插苗床的白天和夜晚温度分别为30℃和20℃，空气湿度保持在90％，10天后喷淋1000倍多菌灵溶液1次，开始加强光照并逐渐减小空气湿度，直至完全去掉保护措施。15天后喷施0.05％磷酸二氢钾溶液1次，直至苗高8cm及以上时，即可出圃种植或销售。
实例3
(1)外植体采集与消毒：于连续5天晴天、前一天保持不浇水，剪取黄花倒水莲带有尚未萌发腋芽的半木质化枝条，去除叶片，切取带节茎段作为外植体，用质量浓度为75％的酒精棉球搽拭茎段外植体2遍，再置于超净工作台上，剪成带1个节间的茎段，用质量浓度为0.1％的二氧化氯浸泡处理18min，无菌水冲洗2遍，保存于干燥的无菌瓶中。
(2)诱导培养获得腋芽：用无菌镊子夹取上述经消毒的无菌外植体，切去两端接触消毒剂部分，留下1.0cm长、具1个节间的茎段，将其形态学下端斜插于诱导腋芽萌发的固体培养基上，置于温度25℃、无光照的黑暗条件下诱导黄花远志茎段萌发腋芽，诱导培养15天，隐形腋芽萌发伸长，有的叶片展开。其中腋芽诱导培养基为：1/2B5+NAA 1.7mg/L+活性炭0.7g/L+蔗糖10g/L+琼脂7.5g/L，pH为6.0。
(3)壮苗培养获得强壮茎段：选择经过诱导培养的无污染的外植体转移至强壮腋芽生长的培养基中，并置于光照条件下，培养条件为：光照强度2300lx、光照时间11h/天，温度25℃，培养17天，萌发的腋芽伸长、叶片平展。其中壮苗培养基为1/2B5+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.6mg/L+壳聚糖25mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.5g/L，pH为6.0。
(4)继代增殖获得组培茎段：将诱导出生长健壮的腋芽切下，转接至继代增殖培养基中进行增殖培养，培养条件为：温度23℃，光照时间11h/d，光照强度2200lx，增殖培养30天，诱导丛生芽，平均每个芽增殖4.2个。增殖培养基为：B5+NAA 0.4mg/L+6-BA 3.0mg/L+胰蛋白胨0.7g/L+蔗糖20g/L+琼脂7.0g/L，pH为6.0。
(5)诱根培养获得诱根处理茎段：将增殖培养诱导产生的丛生芽从基部切割分离成单芽，高度低于2cm的单芽切成带节茎段转入继代增殖培养基，按照继代增殖培养的方法继续培养。高度2cm及以上的芽转入生根培养基中进行生根培养，培养条件为温度25℃，光照时间9h/d，光照强度2200lx，培养30天，试管苗基部长出白色根系，生根率平均达93％。诱根培养基为B5+NAA 0.7mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖20g/L+琼脂粉7.0g/L，调节pH值6.0。
(6)试管外生根处理：将获得的生根处理茎段移出培养室加强光照培养，置于遮阳网下具散射光、光照强度4500lx的地方，4天后茎段叶片浓绿、茎节粗壮即可用于试管外生根。试管外生根前需洗净茎段基部培养基，放入已插好孔的扦插基质中，用喷壶均匀喷水，使组织培养茎段和扦插基质接触紧密。
所述扦插基质按照泥炭与河沙以1.5︰0.5混合均匀，扦插苗床底部先铺上黄壤土3cm-5cm厚度，黄壤土上铺混匀的扦插基质约5cm左右做为扦插层；为防止杂菌滋生，铺好后用650倍的多菌灵药液喷透，再用和生根处理茎段粗度相仿的玻璃棒在扦插苗床上按株行距5cm×8cm的进行插孔，插孔深度为2cm左右。扦插前插孔可以保证组织培养茎段基部不磨损，从而可以防止基部褐化影响根的正常生长。
(7)试管外生根管理
扦插苗床的白天和夜晚温度分别为30℃和25℃，空气湿度保持在87％，10天后喷淋1000倍多菌灵溶液1次，开始加强光照并逐渐减小空气湿度，直至完全去掉保护措施。15天后喷施0.05％磷酸二氢钾溶液1次，直至苗高8cm及以上时，即可出圃种植或销售。
上述实施例的生根率及主根发根率如下表所示：
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | |
| 生根率 | 98％ | 98％ | 95％ |
| 主根发根率 | 90％ | 93％ | 89％ |
从上表得知，本发明的生根率高达95％以上，主根发根率在90％左右，能实现种苗工厂化生产。
Claims (4)
1.黄花远志茎段组培高成苗率培育方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)采集及消毒外植体：采集黄花远志的带有尚未萌发腋芽的半木质化枝条，去除叶片，切取至少带1个节间茎段作为外植体，并对其进行消毒，之后放入无菌瓶中；
(2)诱导培养获得腋芽：切去上述经消毒的无菌外植体与消毒剂接触的两端部，留下具有至少1个节间的茎段，接着将茎段的形态学下端斜插于诱导腋芽萌发的腋芽诱导培养基上进行腋芽诱导培养15-20天，
腋芽诱导培养条件为：温度18-22℃、无光照的黑暗条件；
(3)壮苗培养获得强壮茎段：切割下经步骤(2)诱导培养的腋芽并转移至强壮腋芽生长的壮苗培养基中进行强壮腋芽生长培养15-20天成茎段，
强壮腋芽生长培养条件为：光照强度2000-2500lx、光照时间10-12h/d，温度23-27℃，
(4)继代增殖获得组培茎段：将经步骤(3)获得的强壮茎段转接至继代增殖培养基中进行丛生芽的增殖培养25-35天；
丛生芽的增殖培养条件为：温度20-26℃，光照时间10-12h/d，光照强度2000-2500lx；
(5)诱根培养获得诱根处理茎段：将经步骤(4)产生的丛生芽从基部切割分离出成单芽，然后将高度大于等于3厘米的单芽转入诱根培养基中进行生根处理成诱根处理茎段，
生根处理条件为：23-27℃温度条件下全黑暗培养7-10天，然后再进行光照培养25-35天，光照时间8-10h/d、光照强度2000-2500lx；
(6)试管外生根：将经步骤(5)获得的诱根处理茎段进行加强光照培养3-5天，之后将诱根处理茎段放入扦插苗床中进行试管外生根处理，然后均匀喷水，使诱根处理茎段和扦插苗床中的扦插基质接触紧密，之后进行试管外生根管理，直至苗高大于等于8厘米；
试管外生根条件为：遮阳网下具散射光、光照强度4000-5000lx，
试管外生根管理条件为：控制扦插苗床的白天和夜晚温度分别为20℃-30℃和20℃-25℃，空气湿度保持在85-90％，8-10天后用50％多菌灵可湿性粉剂800-1000倍液喷淋1次，开始逐渐加强光照、逐渐减小空气湿度，10-15天后喷施0.05％磷酸二氢钾溶液1次；
所述的腋芽诱导培养基为：在1/2B5培养基中加入浓度为1.5-2.0mg/L的NAA、浓度为0.5-0.8g/L的活性炭、浓度为8-12g/L的蔗糖和浓度为7.0-7.8g/L的琼脂，控制pH为5.5-6.5；
所述的壮苗培养基为：1/2B5培养基中加入浓度为0.3-0.5mg/L的NAA、浓度为0.5-0.8mg/L的6-BA、浓度为20-30mg/L的壳聚糖、浓度为20g/L的蔗糖和浓度为7.0-7.8g/L的琼脂，控制上述壮苗培养基的pH为5.5-6.5；
所述的继代增殖培养基为：B5培养基中加入浓度为0.3-0.5mg/L的NAA、浓度为2.7-3.5mg/L的6-BA、浓度为0.5-1.0g/L的胰蛋白胨、浓度为20g/L的蔗糖和浓度为6.5-7.3g/L的琼脂，控制该继代增殖培养基的pH为5.5-6.5；
所述的诱根培养基为：B5培养基中加入浓度为0.5-0.8mg/L的NAA、浓度为0.5g/L的活性炭、浓度为20g/L的蔗糖和浓度为6.7-7.5g/L的琼脂粉，调节该诱根培养基的pH值为5.8-6.5。
2.根据权利要求1所述的黄花远志茎段组培高成苗率培育方法，其特征在于：步骤(5)时，将高度低于3厘米的单芽切成带节茎段并将该带节茎段转入步骤(4)的继代增殖培养基，按照步骤(4)的继代增殖培养的方法继续培养。
3.根据权利要求1所述的黄花远志茎段组培高成苗率培育方法，其特征在于：所述的扦插苗床从下至上依次铺设有3-5厘米的黄壤土层和4-6厘米的扦插层，所述的扦插层的扦插基质由泥炭与河沙以1.5-1.8︰0.5-0.8混合均匀制成；当扦插苗床铺好后用稀释600-700倍的多菌灵药液喷透，再用与生根处理茎段粗度相配合的玻璃棒在扦插苗床上按株行距为5厘米×8厘米、插孔深度为1.5-2.5厘米进行插孔。
4.根据权利要求1所述的黄花远志茎段组培高成苗率培育方法，其特征在于：步骤(1)，所述的外植体取自连续5天以上晴天、且保持剪取前一天不浇水的露天栽培植株；剪成带1个节间的茎段前，用质量浓度为75％的酒精棉球搽拭外植体2遍以上，剪成带1个节间的茎段后，用质量浓度为0.1％的二氧化氯浸泡处理12-20分钟，并用无菌水冲洗2-3遍。
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