CN106613960B - 一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法 - Google Patents

一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106613960B
CN106613960B CN201610966616.3A CN201610966616A CN106613960B CN 106613960 B CN106613960 B CN 106613960B CN 201610966616 A CN201610966616 A CN 201610966616A CN 106613960 B CN106613960 B CN 106613960B
Authority
CN
China
Prior art keywords
grams
culture
milligrams
culture medium
protocorms
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610966616.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106613960A (zh
Inventor
曾宋君
何倍倍
吴坤林
郑枫
张建霞
张新华
马国华
段俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Botanical Garden of CAS
Original Assignee
South China Botanical Garden of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Botanical Garden of CAS filed Critical South China Botanical Garden of CAS
Priority to CN201610966616.3A priority Critical patent/CN106613960B/zh
Publication of CN106613960A publication Critical patent/CN106613960A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106613960B publication Critical patent/CN106613960B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法。本发明在对刚冒出分蘖芽的海伦兜兰进行一系列药剂处理及培养获得茎节拉长的分蘖芽，以分蘖芽的茎节为外植体，采用独特的培养基进行愈伤组织的诱导和增殖、类原球茎的诱导和增殖、类原球茎的分化和生根壮苗培养获得优质种苗的愈伤组织再生体系快速繁殖方法，能生产出大量的种苗供应市场并应用于迁地保护和自然回归，有利于海伦兜兰的资源保护和可持续利用。

Description

一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法。
背景技术：
海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)又称巧花兜兰，分布于我国广西西部和越南北部，观赏价值高。由于其生境的破坏和人工的过度采挖，其野生植物数量已极为稀少，被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)列入附录I而禁止交易，也被世界自然保护联盟(IUCN)红色名录中列为极危物种(CR)亟待保护，在中国也已被中国国家林业局列为极小种群野生植物需要重点保护。进行海伦兜兰的资源保护，繁殖足够多的种苗是关键。海伦兜兰的常规繁殖可采用分株，但繁殖速度慢，繁殖率低。无菌播种和组织培养能进行其快速繁殖，但无菌播种材料受季节性限制。而兜兰在组织培养时，由于外植体去污难、易褐化及增殖速度慢等原因，其组织培养难度极大。
发明内容：
本发明的目的是提供一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法，从而进行海伦兜兰的规模化繁殖。
本发明的海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、愈伤组织的诱导和增殖：取海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)的分蘖芽，切除叶片后进行消毒处理，将其切成带一个节的茎段，得到消毒后的外植体，然后将外植体接种到诱导培养基中培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，获得愈伤组织，然后将愈伤组织转移到增殖培养基上进行增殖培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，愈伤组织大量增殖；
所述的诱导培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH5.8～6.0；
所述的增殖培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；
b、类原球茎的诱导和增殖：将愈伤组织转移到类原球茎的诱导和增殖培养基上培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，获得类原球茎，然后将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖培养基上进行增殖培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，类原球茎大量增殖；所述的类原球茎的诱导和增殖培养基为：每升含有噻重氮苯基脲0.1～0.5毫克、激动素1.0～5.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；
c、类原球茎的分化：将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，类原球茎分化出不定芽，所述的分化培养基为：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH5.8～6.0；
d、生根壮苗培养：将不定芽切成单芽后转到生根壮苗培养基上培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯(lux)，光照时间12～16小时/天，获得完整植株，所述的生根壮苗培养基为：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、香蕉匀浆50～150克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖15～30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；
e、试管苗移栽：将完整植株在自然光下炼苗10～15天，然后取出植株洗净根部的培养基，移栽到植金石、松树皮和泥炭土按质量比2～3:2～3:1混合的栽培基质中培养获得海伦兜兰种苗。
所述的分蘖芽优选为茎节拉长的分蘖芽。
所述的茎节拉长的分蘖芽是通过以下方法获得的：选择刚冒出分蘖芽的植株生长势强的海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)为母株，对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的500～800倍稀释水溶液并用其浇透基质，稍干后放入光照人工气候箱中进行暗/光交替培养，培养温度25℃～30℃，湿度75％～90％，光照度2000～3000勒克斯(lux)；培养过程中每3天浇一次水，每15天对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的500～700倍稀释水溶液或72％农用链霉素可溶性粉剂的3000～4000倍稀释水溶液一次，35％尅土菌可湿性粉剂的500～700倍稀释水溶液和72％农用链霉素可溶性粉剂的3000～4000倍稀释水溶液交替使用，获得3～4厘米长，具有3～4个节的分蘖芽，得到茎节拉长的分蘖芽。
优选，所述的暗/光交替培养具体为暗培养14～14.5天后光培养12～24小时，连续交替培养，每个周期15天。
步骤a所述的消毒处理具体为：在超净工作台上将切除叶片的分蘖芽用体积分数75％酒精浸泡10～30秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡5～10分钟，无菌水冲洗4～5次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒5～10分钟，无菌水冲洗4～5次。
MS培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看文献(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991.)；1/2MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/2，其余成份不变。所述的1/2MS培养基为液体培养基，不含有琼脂。
本发明通过获得茎节拉长的分蘖芽及消毒处理可以使消毒成功率为70％～80％，从而有效的解决了外植体去污难的难题。
本发明公开了一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法。本发明在对刚冒出分蘖芽的海伦兜兰进行一系列药剂处理及培养获得茎节拉长的分蘖芽，以分蘖芽的茎节为外植体，采用独特的培养基进行愈伤组织的诱导和增殖、类原球茎的诱导和增殖、类原球茎的分化和生根壮苗培养获得优质种苗的愈伤组织再生体系快速繁殖方法，能生产出大量的种苗供应市场并应用于迁地保护和自然回归，有利于海伦兜兰的资源保护和可持续利用。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
(1)外植体的获得和处理
选择刚冒出分蘖芽的植株生长势强的海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)为母株，在进入人工气候箱培养前对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的500倍稀释水溶液并用其浇透基质，稍干后放入光照人工气候箱，在花盆底部垫水盘防止水漏入光照人工气候箱。在光照人工气候箱中进行暗/光交替培养使分蘖芽的茎节拉长，具体时间模式为先暗培养14天后光培养24小时，持续交替培养90天，每个周期15天，共进行6个周期。培养过程中每3天浇一次水，每15天对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的500倍稀释水溶液或72％农用链霉素可溶性粉剂的3000倍稀释水溶液一次，35％尅土菌可湿性粉剂的500倍稀释水溶液和72％农用链霉素可溶性粉剂的3000倍稀释水溶液交替使用。培养温度25℃，湿度75％，光照度2000勒克斯(lux)。经过90天的培养后，海伦兜兰分蘖芽4厘米长，具有4个节。
(2)外植体消毒
将具有4个节的分蘖芽切除叶片，在超净工作台上用体积分数75％酒精浸泡10秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗5次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5次。然后将其切成带一个节的茎段，得到消毒后的外植体，接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导，培养温度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，所述的诱导培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)10.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)1.0毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)200毫克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8，其配制方法是将10.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、1.0毫克噻重氮苯基脲、200毫克磷酸二氢钠、30克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。消毒成功率80％。
(3)愈伤组织的诱导和增殖
外植体在诱导培养基上培养2个月能形成愈伤组织。然后将愈伤组织转移到增殖培养基上进行增殖培养，培养温度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，继代周期2个月，增殖率3倍。所述的增殖培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)10.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)1.0毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)200毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8，其配制方法是将10.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、1.0毫克噻重氮苯基脲、200毫克磷酸二氢钠、200毫升椰子汁、2克蛋白胨、30克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(4)类原球茎的诱导和增殖
将愈伤组织转移到类原球茎的诱导和增殖培养基上培养，培养温度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，2个月能诱导出类原球茎，然后将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖培养基上进行增殖培养，培养温度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，继代周期2个月，增殖率3倍。所述的类原球茎的诱导和增殖培养基为：每升含有噻重氮苯基脲(TDZ)0.5毫克、激动素(KT)5.0毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)200毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8，其配制方法是将0.5毫克噻重氮苯基脲、5.0毫克激动素、200毫克磷酸二氢钠、200毫升椰子汁、2克蛋白胨、30克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(5)类原球茎的分化
将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，1个月能分化出不定芽，所述的分化培养基为：每升含有萘乙酸(NAA)2.0毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)200毫克、椰子汁200毫升、蛋白胨2克、活性炭(AC)2.0克、蔗糖30克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8，其配制方法是将2.0毫克萘乙酸、200毫克磷酸二氢钠、200毫升椰子汁、2克蛋白胨、2.0克活性炭、30克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(6)生根壮苗培养
将1厘米不定芽切成单芽后转到生根壮苗培养基上培养，培养温度24℃，光照度1500勒克斯(lux)，光照时间12小时/天，3个月能形成3厘米高的完整植株，所述的生根壮苗培养基为：每升含有萘乙酸(NAA)1.0毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、香蕉匀浆50克、活性炭(AC)1.0克、蔗糖15克、琼脂6克，其余为1/2MS培养基，pH5.8，其配制方法是将1.0毫克萘乙酸、150毫克磷酸二氢钠、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、50克香蕉匀浆、1.0克活性炭、15克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(7)试管苗移栽
将具3厘米高完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗15天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，采用2.7寸白色塑料杯移栽，一盆种10株。栽培基质为植金石(日本进口)、松树皮和泥炭土(以色列进口)按质量比3:2:1混合均匀。保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90％以上。一年后要以3株种植为1盆。松树皮需用沸水煮30分钟后用自来水浸泡24小时后再用自来水冲洗5次再使用，植金石需用自来水冲洗后再使用。
实施例2：
(1)外植体的获得和处理
选择刚冒出分蘖芽的植株生长势强的海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)为母株，在进入人工气候箱培养前对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的600倍稀释水溶液并用其浇透基质，稍干后放入光照人工气候箱，在花盆底部垫水盘防止水漏入光照人工气候箱。在光照人工气候箱中进行暗/光交替培养使分蘖芽的茎节拉长，具体时间模式为先暗培养14天12小时后光培养12小时，持续交替培养90天，每个周期15天，共进行6个周期。培养过程中每3天浇一次水，每15天对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的600倍稀释水溶液或72％农用链霉素可溶性粉剂的3500倍稀释水溶液一次，35％尅土菌可湿性粉剂的600倍稀释水溶液和72％农用链霉素可溶性粉剂的3500倍稀释水溶液交替使用。培养温度28℃，湿度80％，光照度2500勒克斯(lux)。经过90天的培养后，海伦兜兰分蘖芽3.5厘米长，平均具有3.5个节。
(2)外植体消毒
将具有3～4个节的分蘖芽切除叶片，在超净工作台上用体积分数75％酒精浸泡20秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡8分钟，无菌水冲洗5次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒8分钟，无菌水冲洗5次。然后将其切成带一个节的茎段，得到消毒后的外植体，接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，所述的诱导培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)5.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)0.5毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)180毫克、蔗糖30克、琼脂6.5克，其余为1/2MS培养基，pH 5.9，其配制方法是将5.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、0.5毫克噻重氮苯基脲、180毫克磷酸二氢钠、30克蔗糖和6.5克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。消毒成功率75％。
(3)愈伤组织的诱导和增殖
外植体在诱导培养基上培养75天左右能形成愈伤组织。然后将愈伤组织转到增殖培养基上进行增殖培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，继代周期75天，增殖率2.5倍。
所述的增殖培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)5.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)0.5毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)180毫克、椰子汁150毫升、蛋白胨1.5克、蔗糖30克、琼脂6.5克，其余为1/2MS培养基，pH 5.9，其配制方法是将5.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、0.5毫克噻重氮苯基脲、180毫克磷酸二氢钠、150毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、30克蔗糖和6.5克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(4)类原球茎的诱导和增殖
将愈伤组织转移到类原球茎的诱导和增殖培养基上培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，75天能诱导出类原球茎，然后将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖培养基上进行增殖培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，继代周期75天，增殖率2.5倍。
所述的类原球茎的诱导和增殖培养基为：每升含有噻重氮苯基脲(TDZ)0.3毫克、激动素(KT)3.0毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)180毫克、椰子汁150毫升、蛋白胨1.5克、蔗糖30克、琼脂6.5克，其余为1/2MS培养基，pH 5.9，其配制方法是将0.3毫克噻重氮苯基脲、3.0毫克激动素、180毫克磷酸二氢钠、150毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、30克蔗糖和6.5克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(5)类原球茎的分化
将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，45天能分化出不定芽，所述的分化培养基为：每升含有萘乙酸(NAA)1.5毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)180毫克、椰子汁180毫升、蛋白胨1.5克、活性炭(AC)1.5克、蔗糖30克、琼脂6.5克，其余为1/2MS培养基，pH 5.9，其配制方法是将1.5毫克萘乙酸、180毫克磷酸二氢钠、180毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、1.5克活性炭、30克蔗糖和6.5克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(6)生根壮苗培养
将1.5厘米不定芽切成单芽后转到生根壮苗培养基上培养，培养温度28℃，光照度1800勒克斯(lux)，光照时间14小时/天，75天能形成4厘米高的完整植株，所述的生根壮苗培养基为：每升含有萘乙酸(NAA)1.5毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)180毫克、椰子汁180毫升、蛋白胨1.5克、香蕉匀浆100克、活性炭1.5克、蔗糖20克、琼脂6.5克，其余为1/2MS培养基，pH5.9，其配制方法是将1.5毫克萘乙酸、180毫克磷酸二氢钠、180毫升椰子汁、1.5克蛋白胨、100克香蕉匀浆、1.5克活性炭、20克蔗糖和6.5克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(7)试管苗移栽
将具4厘米高完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗12天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，采用2.7寸白色塑料杯移栽，一盆种9株。栽培基质为植金石(日本进口)、松树皮和泥炭土(以色列进口)按质量比2:2:1混合均匀。保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90％以上。一年后要以3株种植为1盆。松树皮需用沸水煮45分钟后用自来水浸泡36小时后再用自来水冲洗4次再使用，植金石需用自来水冲洗后再使用。
实施例3:
(1)外植体的获得和处理
选择刚冒出分蘖芽的植株生长势强的海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)为母株，在进入人工气候箱培养前对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的800倍稀释水溶液并用其浇透基质，稍干后放入光照人工气候箱，在花盆底部垫水盘防止水漏入光照人工气候箱。在光照人工气候箱中进行暗/光交替培养使分蘖芽的茎节拉长，具体时间模式为先暗培养14天6小时后光培养18小时，持续交替培养90天，每个周期15天，共进行6个周期。培养过程中每3天浇一次水，每15天对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的700倍稀释水溶液或72％农用链霉素可溶性粉剂的4000倍稀释水溶液一次，35％尅土菌可湿性粉剂的700倍稀释水溶液和72％农用链霉素可溶性粉剂的4000倍稀释水溶液交替使用。培养温度30℃，湿度90％，光照度3000勒克斯(lux)。经过90天的培养后，海伦兜兰分蘖芽3厘米长，具有3个节。
(2)外植体消毒
将具有3个节的分蘖芽切除叶片，在超净工作台上用体积分数75％酒精浸泡10秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗4次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒5分钟，无菌水冲洗4次。然后将其切成带一个节的茎段，得到消毒后的外植体，接种到诱导培养基中进行愈伤组织诱导，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，所述的诱导培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)0.1毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)150毫克、蔗糖30克、琼脂7克，其余为1/2MS培养基，pH6.0，其配制方法是将1.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、0.1毫克噻重氮苯基脲、150毫克磷酸二氢钠、30克蔗糖和7克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。消毒成功率70％。
(3)愈伤组织的诱导和增殖
外植体在诱导培养基中培养3个月能形成愈伤组织，然后将愈伤组织转移到增殖培养基上进行增殖培养，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，继代周期3个月，增殖率2倍。所述的增殖培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1.0毫克、噻重氮苯基脲(TDZ)0.1毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、蔗糖30克、琼脂7克，其余为1/2MS培养基，pH6.0，其配制方法是将1.0毫克2,4-二氯苯氧乙酸、0.1毫克噻重氮苯基脲、150毫克磷酸二氢钠、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、30克蔗糖和7克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(4)类原球茎的诱导和增殖
将愈伤组织转移到类原球茎的诱导和增殖培养基上培养，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，3个月能诱导出类原球茎，然后将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖培养基上进行增殖培养，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，继代周期3个月，增殖率2倍。所述的类原球茎的诱导和增殖培养基为：每升含有噻重氮苯基脲(TDZ)0.1毫克、激动素(KT)1.0毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、蔗糖30克、琼脂7克，其余为1/2MS培养基，pH6.0，其配制方法是将0.1毫克噻重氮苯基脲、1.0毫克激动素、150毫克磷酸二氢钠、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、30克蔗糖和7克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(5)类原球茎的分化
将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，2个月能分化出不定芽，所述的分化培养基为：每升含有萘乙酸(NAA)1.0毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、活性炭(AC)1.0克、蔗糖30克、琼脂7克，其余为1/2MS培养基，pH6.0，其配制方法是将1.0毫克萘乙酸、150毫克磷酸二氢钠、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、1.0克活性炭、30克蔗糖和7克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(6)生根壮苗培养
将2厘米不定芽切成单芽后转到生根壮苗培养基上培养，培养温度30℃，光照度2000勒克斯(lux)，光照时间16小时/天，3个月能形成3厘米高的完整植株，所述的生根壮苗培养基为：每升含有萘乙酸(NAA)1.0毫克、磷酸二氢钠(NaH2PO4)150毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1克、香蕉匀浆50克、活性炭1.0克、蔗糖30克、琼脂7克，其余为1/2MS培养基，pH 6.0，其配制方法是将1.0毫克萘乙酸、150毫克磷酸二氢钠、100毫升椰子汁、1克蛋白胨、50克香蕉匀浆、1.0克活性炭、30克蔗糖和7克琼脂，加到少量1/2MS培养基(液体)中，然后用1/2MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
(7)试管苗移栽
将具3厘米高完整植株从培养瓶转移到具自然光的温室中炼苗15天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，采用2.7寸白色塑料杯移栽，一盆种8株。栽培基质为植金石(日本进口)、松树皮和泥炭土(以色列进口)按质量比2:3:1混合均匀。保持适当通风和足够的湿度，移栽的成活率均可达90％以上。一年后要以3株种植为1盆。松树皮需用沸水煮60分钟后用自来水浸泡24小时后再用自来水冲洗3次再使用，植金石需用自来水冲洗后再使用。

Claims (3)

1.一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、愈伤组织的诱导和增殖：取海伦兜兰(Paphiopedilum helenaeAver.)的分蘖芽，切除叶片后进行消毒处理，将其切成带一个节的茎段，得到消毒后的外植体，然后将外植体接种到诱导培养基中培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，获得愈伤组织，然后将愈伤组织转移到增殖培养基上进行增殖培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，愈伤组织大量增殖；所述的分蘖芽为茎节拉长的分蘖芽；
所述的诱导培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；
所述的增殖培养基为：每升含有2,4-二氯苯氧乙酸1.0～10.0毫克、噻重氮苯基脲0.1～1.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；
b、类原球茎的诱导和增殖：将愈伤组织转移到类原球茎的诱导和增殖培养基上培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，获得类原球茎，然后将类原球茎接种到新的类原球茎的诱导和增殖培养基上进行增殖培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，类原球茎大量增殖；所述的类原球茎的诱导和增殖培养基为：每升含有噻重氮苯基脲0.1～0.5毫克、激动素1.0～5.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；
c、类原球茎的分化：将类原球茎接种到分化培养基上培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，类原球茎分化出不定芽，所述的分化培养基为：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8～6.0；
d、生根壮苗培养：将不定芽切成单芽后转到生根壮苗培养基上培养，培养温度24℃～30℃，光照度1500～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，获得完整植株，所述的生根壮苗培养基为：每升含有萘乙酸1.0～2.0毫克、磷酸二氢钠150～200毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、香蕉匀浆50～150克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖15～30克、琼脂6～7克，其余为1/2MS培养基，pH 5.8-6.0；
e、试管苗移栽：将完整植株在自然光下炼苗10～15天，然后取出植株洗净根部的培养基，移栽到植金石、松树皮和泥炭土按质量比2～3:2～3:1混合的栽培基质中培养获得海伦兜兰种苗；
所述的茎节拉长的分蘖芽是通过以下方法获得的：选择刚冒出分蘖芽的植株生长势强的海伦兜兰(Paphiopedilum helenae Aver.)为母株，对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的500～800倍稀释水溶液并用其浇透基质，稍干后放入光照人工气候箱中进行暗/光交替培养，培养温度25℃～30℃，湿度75％～90％，光照度2000～3000勒克斯；培养过程中每3天浇一次水，每15天对叶面喷施35％尅土菌可湿性粉剂的500～700倍稀释水溶液或72％农用链霉素可溶性粉剂的3000～4000倍稀释水溶液一次，35％尅土菌可湿性粉剂的500～700倍稀释水溶液和72％农用链霉素可溶性粉剂的3000～4000倍稀释水溶液交替使用，获得3～4厘米长，具有3～4个节的分蘖芽，得到茎节拉长的分蘖芽。
2.根据权利要求1所述的海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法，其特征在于，所述的暗/光交替培养具体为暗培养14～14.5天后光培养12～24小时，连续交替培养，每个周期15天。
3.根据权利要求1或2所述的海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法，其特征在于，步骤a所述的消毒处理具体为：在超净工作台上将切除叶片的分蘖芽用体积分数75％酒精浸泡10～30秒后，用0.5％有效氯的次氯酸溶液浸泡5～10分钟，无菌水冲洗4～5次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒5～10分钟，无菌水冲洗4～5次。
CN201610966616.3A 2016-10-28 2016-10-28 一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法 Active CN106613960B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610966616.3A CN106613960B (zh) 2016-10-28 2016-10-28 一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610966616.3A CN106613960B (zh) 2016-10-28 2016-10-28 一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106613960A CN106613960A (zh) 2017-05-10
CN106613960B true CN106613960B (zh) 2019-06-14

Family

ID=58820912

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610966616.3A Active CN106613960B (zh) 2016-10-28 2016-10-28 一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106613960B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107980636A (zh) * 2017-12-21 2018-05-04 芜湖东源新农村开发股份有限公司 金线莲的组织培养方法
CN109168685B (zh) * 2018-08-08 2021-01-26 深圳市仙湖植物园管理处 长茎鹤顶兰扦插繁殖的方法及长茎鹤顶兰扦插繁殖基质
CN109937875B (zh) * 2019-03-12 2020-12-01 中国科学院华南植物园 一种通过叶丛芽进行兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法
CN116671438B (zh) * 2023-05-29 2024-05-21 广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所 一种延长海伦兜兰茎干进行快速育苗的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0800761A1 (en) * 1995-10-17 1997-10-15 Sapporo Breweries Ltd. Process for cloning paphiopedila
CN1541519A (zh) * 2003-11-06 2004-11-03 中国科学院华南植物研究所 兜兰的无菌播种和组织培养技术
CN105165629A (zh) * 2015-10-26 2015-12-23 临沂大学 一种虎斑兜兰组培快繁方法
CN105494103A (zh) * 2016-01-13 2016-04-20 中国科学院华南植物园 一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0800761A1 (en) * 1995-10-17 1997-10-15 Sapporo Breweries Ltd. Process for cloning paphiopedila
CN1541519A (zh) * 2003-11-06 2004-11-03 中国科学院华南植物研究所 兜兰的无菌播种和组织培养技术
CN105165629A (zh) * 2015-10-26 2015-12-23 临沂大学 一种虎斑兜兰组培快繁方法
CN105494103A (zh) * 2016-01-13 2016-04-20 中国科学院华南植物园 一种摩帝类兜兰优质种苗组织培养快速繁殖方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
In vitro propagation of Paphiopedilum hangianum Perner & Gruss;Songjun Zeng, et. al.;《Scientia Horticulturae》;20131231;第151卷;第147–156页，尤其是第2.1-2.9，第3.2-3.8节。 *
海伦兜兰的无菌播种与快速繁殖;胡琦敏等;《植物生理学报》;20160930;第52卷(第9期);第1443-1448页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106613960A (zh) 2017-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101822220B (zh) 一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法
CN105340747A (zh) 一种甘草无性快速繁殖方法
CN106561456B (zh) 一种海伦兜兰无菌播种快速繁殖方法
CN103704130B (zh) 一种春兰与大花蕙兰杂交种育苗的方法
CN103734014B (zh) 一种地枫皮的组织培养快速繁殖方法
CN106613960B (zh) 一种海伦兜兰愈伤组织再生体系快速繁殖方法
CN106718877B (zh) 一种红火炬郁金优质种苗快速繁殖方法
CN105993956A (zh) 一种茅苍术快速繁殖方法
CN104686338A (zh) 一种白芷花药离体培养技术
CN107667860A (zh) 一种山姜的组织培养繁殖方法
CN103891613A (zh) 一种绿风藤茶品种复壮的快速繁殖方法
CN103651141B (zh) 亳菊工厂化试管苗快繁的方法
CN105613287A (zh) 一种法斗木莲组织快繁育苗方法
CN107079817A (zh) 兜兰新品种“优优兜兰”组培快繁方法
CN109042330A (zh) 一种桃叶卫矛的组织培养方法
CN103548695B (zh) 一种岩黄连组织培养快速繁殖方法
CN105075860B (zh) 一种灯盏花组培育苗方法
CN108142281A (zh) 一种杜仲组织培养方法
CN106577280A (zh) 一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗
CN105519445A (zh) 一种猪笼草离体快繁方法
CN106069780B (zh) 一种采用白及块茎进行组培育种的技术
CN107873524A (zh) 一种珠芽蓼茎段组培快繁方法
CN112021139B (zh) 一种快速人工栽培冷杉属植物幼苗的方法
CN101496527B (zh) 一种弱病毒防治矮牵牛病毒病的方法
CN104542271A (zh) 一种芥菜无土栽培方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant