CN103891613A - 一种绿风藤茶品种复壮的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绿风藤茶品种复壮的组培快速繁殖方法，其步骤：A)外植体的选取与灭菌：取绿风藤茶幼嫩枝条的茎尖，经表面灭菌后备用；B）将灭菌后的绿风藤茶幼嫩枝条的茎尖进行初代培养：在无菌条件下将经表面灭菌后的外植体接种在初代培养基中，转接到诱导分化丛芽的培养基中；C)增殖培养：在无菌条件下将丛芽切成单株接入增殖培养基中进行增殖培养；D)壮苗培养；E)生根培养：将壮苗培养的丛生苗切成单株后，接种在生根培养基中进行生根培养；F)移栽：将生根组培苗移栽于基质中，培育1~2个月至成苗。方法易行，操作简便，有效地防止了外植体接种污染率，接种成功率达85%以上，生根整齐，苗壮，成活率高，适用于绿风藤茶苗的商业生产。
Description
技术领域
本发明属于植物茎尖脱毒以达到品种复壮的组培快繁技术领域，更具体涉及一种绿风藤茶品种复壮的组培快速繁殖方法。
背景技术
藤茶为葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄属（Ampe | opsis Michaux）药食两用的木质藤本植物显齿蛇葡萄（A.grossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang），富含黄酮（二氢杨梅素）、氨基酸、多糖、多酚、维生素等多种有效成分。现代药理学与生物活性研究表明，藤茶具有抗肿瘤及免疫调节、抗氧化、降血糖、降血脂等多种生物活性。绿凤藤茶（A.grossedentata CV , lufeng , )是郑小江等经过多年选育的无性系，2003年12月通过湖北省恩施州农作物品种审(认)定小组审(认)定和湖北省农作物品种审定委员会备案为推广品种，所含多糖、总氨基酸、维生素等都极显著高于显齿蛇葡萄，是大量应用于医药、保健、功能性饮食品工业的优质原料。目前，恩施州绿凤藤茶的种植面积已达8000余亩，并产生了较好的经济效益。近年来，由于藤茶种植时间较长且种苗均采用扦插的方式得到，其品种退化较为严重，使藤茶的产量及品质均有所下降。
感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点（约0.1～1.0mm区域）则几乎不含或含病毒很少。这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大则不能保证完全除去病毒。茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗的最广泛最重要的一个途径。
通过绿风藤茶茎尖的组织培养得到了一种绿风藤茶品种复壮的组培快繁技术，并确定了进行组织培养的几个培养基的最佳方案。通过大量繁殖，其成活率达85%以上，且性状稳定。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种绿风藤茶品种复壮的组培快速繁殖方法，方法易行，操作简便，有效地防止了外植体接种污染率，接种成功率达85%以上；提出的绿风藤茶品种复壮的优化培养基针对性强、适用性好，组培苗、丛生芽及芽增值系数高，生根整齐，苗壮，成活率高，适用于绿风藤茶苗的商业生产。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种绿风藤茶品种复壮的组培快速繁殖方法，其步骤是：
A) 外植体的选取与灭菌：取健壮的绿风藤茶幼嫩枝条的茎尖，经表面灭菌后备用。外植体的选取与灭菌为当年新萌发嫩枝的茎尖，剪掉嫩枝的叶片和卷须，切成长0.4-0.6cm带顶芽茎段，用洗洁精浸泡5~10 min后，用毛笔轻轻地刷洗干净，流水冲洗2-4h，移至超净工作台上，用70%（体积比）的酒精震荡清洗28-32S，无菌水洗2-4次，再放入质量（g）与体积(mL)之比为0.1%的升汞溶液中震荡消毒6-8min，无菌水冲洗4-6次后，在解剖镜下切下0.4-0.6mm的茎尖，接种到初代培养基上；所述的洗洁精为普通的立白洗洁精（家里洗菜洗碗用的洗洁精均可）。
B）将灭菌后的绿风藤茶幼嫩枝条的茎尖进行初代培养：在无菌条件下将经表面灭菌后的外植体接种在初代培养基中，培养15~20d后，转接到诱导分化丛芽的培养基中；所述的初代培养基：WPM+6-BA1.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1+PVP2g.L-1 +25g.L-1蔗糖；或 MS+6-BA1.5 mg.L-1+NAA0.2 mg.L-1+ PVP2g.L-1+25g.L-1蔗糖；
C)增殖培养：在无菌条件下将丛芽切成单株接入增殖培养基中进行增殖培养，培养30~45天丛生芽可增殖出5~8倍；根据对幼苗数量的需求，每隔30~45d按同样方法进行幼苗再增殖培养；诱导丛生芽和芽增殖的培养基：MS+TDZ0.2mg.L-1+IAA0.1mg.L-1+25g.L-1蔗糖；或WPM+6-BA1.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1+25g.L-1蔗糖；
D)壮苗培养：将增殖培养的丛生芽转接到含低浓度植物生长调节物质的壮苗培养基中培养25~30d，可以改变植物体内源激素水平的平衡，从而有利于以后阶段的生根和移栽。所述的壮苗培养基：MS+6-BA1.0 mg.L-1+NAA0.1 mg.L-1+25g.L-1蔗糖；
E) 生根培养：将壮苗培养的丛生苗切成单株后，接种在生根培养基中进行生根培养，培养20~30d后，幼苗基部长出3~8条根；所述的生根培养基：1/2MS+ PP3330.2 mg.L-1+IBA0.2mg.L-1+20g.L-1蔗糖。
F) 移栽：将生根组培苗移栽于基质中，培育1~2个月至成苗。所述的移栽基质由草炭:蛭石按体积比1:3配制而成。
G）病毒检测：对茎尖成苗的植株进行移栽后, 随机抽取10株幼苗，用电子显微镜观察叶片的内部结构，未发现病毒粒子。
所述的外植体的选取与灭菌为当年新萌发嫩枝的茎尖，剪掉嫩枝的叶片和卷须，切成长0.5cm带顶芽茎段，用洗洁精浸泡5~10 min后，用毛笔轻轻地刷洗干净，流水冲洗3h左右，移至超净工作台上，用70%（体积比）的酒精震荡清洗30S左右，无菌水洗3次，再放入质量（g）与体积(mL)之比为0.1%的升汞溶液中震荡消毒7min，无菌水冲洗5次后，在解剖镜下切下0.5mm的茎尖，接种到初代培养基上；
所述的初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养等培养阶段的培养条件是：光照强度为40μmol.m-2.s-1，光照时间12h.d-1。其中初代培养的培养基pH6.0-6.5，培养温度为20~21℃，增殖培养、壮苗培养、生根培养等培养阶段的培养温度为23-25℃，培养基pH均为5.6-6。
所述的移栽基质由草炭:蛭石按体积比1:3配制而成。
通过绿风藤茶茎尖的组织培养得到了一种绿风藤茶品种复壮的组培快繁技术，并确定了进行组织培养的几个培养基的最佳方案。通过大量繁殖，其成活率达85%以上，且性状稳定。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
本发明方法简单，易于掌握。本方法中外植体采取洗涤剂浸泡预处理和流水冲洗，有效地防止了外植体接种污染率，接种成功率达85%以上；提出的绿风藤茶品种复壮的优化培养基针对性强、适用性好，组培苗、丛生芽及芽增值系数高，生根整齐，苗壮，成活率高，适用于绿风藤茶苗的商业生产；本方法所获得的绿风藤茶达到了品种复壮的目的，在产量及品质方面均有所提高。
具体实施方式
通过以下实施案例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1：
一种绿风藤茶品种复壮的组培快速繁殖方法，其步骤是：
1）外植体的选取与灭菌：
取100个健壮的绿风藤茶幼嫩枝条的茎尖，经表面灭菌后备用。
选取100个10或13或15cm新萌发的嫩枝，剪掉叶片和卷须，切成长0.5cm带顶芽茎段，用洗洁精浸泡5或8或10 min后，用毛笔轻轻地刷洗干净，流水冲洗3h左右，移至超净工作台上，用70%（体积比）的酒精震荡清洗30S左右，无菌水洗3或4或5次，再放入质量（g）与体积(mL)之比为0.1%的升汞溶液中震荡消毒7min，无菌水冲洗5次后，在解剖镜下切下0.5mm的茎尖，接种到初代培养基上；
2）培养基的配制：
(l)初代培养基：WPM+6-BA1.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1+PVP2g.L-1+25g.L-1蔗糖；pH6.0或6.1或6.2或6.3或6.4或6.5，培养温度为20或21℃
(2)诱导丛生芽和芽增殖的培养基：MS+TDZ0.2mg.L-1+IAA0.1mg.L-1+25g.L-1蔗糖；
(3)壮苗培养基：MS+6-BA1.0 mg.L-1+NAA0.1 mg.L-1+25g.L-1蔗糖；
(4)生根培养基：1/2MS+PP3330.2 mg.L-1+IBA0.2mg.L-1+20g.L-1蔗糖。
上述培养基均附加 0.7g.L-1琼脂，光照强度为40μmol.m-2.s-1，光照时间12h.d-1。其中培养基(1)Ph5.5或5.7或5.9或6或6.1或6.2，培养温度为20或21℃，其他培养基pH均为5.8，温度为21或22或23或24或25或29℃。
3)初代培养：在无菌条件下将经表面灭菌后的外植体接种在初代培养基中，培养15或16或17或18或19或20d后，成活率为95%，转接到诱导分化丛芽的培养基中；
4)增殖培养：在无菌条件下将丛芽切成单株接入增殖培养基中进行增殖培养，在培养条件下培养30或33或36或39或42或45d增殖出丛生芽，芽的增值倍数可达5或6或7或8倍。根据对幼苗数量的需求，每隔30或32或35或38或41或43或45d按同样方法进行幼苗再增殖培养；
5)壮苗培养：初代培养和增殖培养过程中，由于高浓度细胞分裂素的影响，芽的生长受到了抑制，在含有较高浓度的细胞分裂素的增殖阶段后紧接着进行低浓度细胞分裂素或不含细胞分裂素的壮苗阶段培养，可以改变植物体内源激素水平的平衡，从而有利于以后阶段的生根和移栽。将增殖培养的丛生芽转接到壮苗培养基中培养25或26或27或28或29或30d；
6) 生根培养：将壮苗培养的丛生苗切成单株后，接种在生根培养基中进行生根培养，培养20或22或24或26或28或30d后，幼苗基部长出3或5或7或8条根，生根率达92%。获得生根苗475株；
7) 移栽：将生根组培苗移栽于基质中，培育1或2个月至成苗，获得健壮植株406株。
8）病毒检测：对茎尖成苗的植株进行移栽后, 随机抽取10株幼苗，用电子显微镜观察叶片的内部结构，未发现病毒粒子。
实施例2：
一种绿风藤茶品种复壮的组培快速繁殖方法，其步骤是：
1）外植体的选取与灭菌：
取100个健壮的绿风藤茶幼嫩枝条的茎尖，经表面灭菌后备用。
选取100个10或12或14或15cm新萌发的嫩枝，剪掉叶片和卷须，切成长0.5cm带顶芽茎段，用洗洁精浸泡5或7或10 min后，用毛笔轻轻地刷洗干净，流水冲洗3h左右，移至超净工作台上，用70%的酒精震荡清洗30S左右，无菌水洗3或4或5次，再放入0.1%的升汞溶液中震荡消毒7min，无菌水冲洗5次后，在解剖镜下切下0.5mm的茎尖，接种到初代培养基上；
2）培养基的配制：
(l)初代培养基：MS+6-BA1.5 mg.L-1+NAA0.2 mg.L-1+ PVP2g.L-1+25g.L-1蔗糖；
(2)诱导丛生芽的培养基：WPM+6-BA1.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1+25g.L-1蔗糖；
(3)壮苗培养基：MS+6-BA1.0 mg.L-1+NAA0.1 mg.L-1+25g.L-1蔗糖；
(4)生根培养基：1/2MS+PP3330.2 mg.L-1+IBA0.2mg.L-1+20g.L-1蔗糖。
上述培养基均附加 0.7g.L-1琼脂，光照强度为40μmol.m-2.s-1，光照时间12h.d-1。其中培养基(1)Ph5.6或5.9或6.2，培养温度为20或21℃，其他培养基pH均为5.8，温度为21或22或23或24或25℃。
3)初代培养：在无菌条件下将经表面灭菌后的外植体接种在初代培养基中，培养15或17或18或20d后，成活率为87%，转接到诱导分化丛芽的培养基中；
4)增殖培养：在无菌条件下将丛芽切成单株接入增殖培养基中进行增殖培养，在培养条件下培养30或32或36或38或42或45d增殖出丛生芽，芽的增值倍数可达3或4或5倍。根据对幼苗数量的需求，每隔30或34或38或43或45d按同样方法进行幼苗再增殖培养；
5)壮苗培养：初代培养和增殖培养过程中，由于高浓度细胞分裂素的影响，芽的生长受到了抑制，在含有较高浓度的细胞分裂素的增殖阶段后紧接着进行低浓度细胞分裂素或不含细胞分裂素的壮苗阶段培养，可以改变植物体内源激素水平的平衡，从而有利于以后阶段的生根和移栽。将增殖培养的丛生芽转接到壮苗培养基中培养25或7或29或30d；
6) 生根培养：将壮苗培养的丛生苗切成单株后，接种在生根培养基中进行生根培养，培养20或24或28或30d后，幼苗基部长出3或4或5或6或7或8条根，生根率达90%。获得生根苗438株；
7) 移栽：将生根组培苗移栽于基质中，培育1或2个月（33或38或45或50或55天）至成苗，获得健壮植株377株。
8）病毒检测：对茎尖成苗的植株进行移栽后, 随机抽取10株幼苗，用电子显微镜观察叶片的内部结构，未发现病毒粒子。
Claims (2)
1.一种绿风藤茶品种复壮的组培快速繁殖方法，其步骤是：
A) 外植体的选取与灭菌：取绿风藤茶幼嫩枝条的茎尖，经表面灭菌后备用，外植体的选取与灭菌为当年新萌发嫩枝的茎尖，剪掉嫩枝的叶片和卷须，切成长0.4-0.6cm带顶芽茎段，用洗洁精浸泡5~10 min后，刷洗干净，流水冲洗2-4h，移至超净工作台上，用70%体积比的酒精震荡清洗28-32S，无菌水洗2-4次，再放入质量与体积之比为0.1%的升汞溶液中震荡消毒6-8min，无菌水冲洗4-6次后，在解剖镜下切下0.4-0.6mm的茎尖，接种到初代培养基上；
B）将灭菌后的绿风藤茶幼嫩枝条的茎尖进行初代培养：在无菌条件下将经表面灭菌后的外植体接种在初代培养基中，培养15~20d后，转接到诱导分化丛芽的培养基中；所述的初代培养基：WPM+6-BA1.5mg.L-1+NAA0.2mg.L-1+PVP2g.L-1 +25g.L-1蔗糖；或 MS+6-BA1.5 mg.L-1+NAA0.2 mg.L-1+ PVP2g.L-1+25g.L-1蔗糖；
C)增殖培养：在无菌条件下将丛芽切成单株接入增殖培养基中进行增殖培养，培养30~45天丛生芽可增殖出5~8倍；根据对幼苗数量，每隔30~45d按同样方法进行幼苗再增殖培养；诱导丛生芽和芽增殖的培养基：MS+TDZ0.2mg.L-1+IAA0.1mg.L-1+25g.L-1蔗糖；
D)壮苗培养：初代培养和增殖培养过程中，将增殖培养的丛生芽转接到壮苗培养基中培养25~30d；所述的壮苗培养基：MS+6-BA1.0 mg.L-1+NAA0.1 mg.L-1+25g.L-1蔗糖；
E) 生根培养：将壮苗培养的丛生苗切成单株后，接种在生根培养基中进行生根培养，培养20~30d后，幼苗基部长出3~8条根；所述的生根培养基：1/2MS+ PP3330.2 mg.L-1+IBA0.2mg.L-1+20g.L-1蔗糖；
F) 移栽：将生根组培苗移栽于基质中，培育1~2个月至成苗，所述的移栽基质由草炭:蛭石按体积比1:3配制而成。
2.根据权利要求1所述的一种绿风藤茶品种复壮的组培快速繁殖方法，其特征在于：所述的初代培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养的培养条件是，光照强度为40μmol.m-2.s-1，光照时间12h.d-1，其中初代培养的培养基pH6.0-6.5，培养温度为20~21℃，增殖培养、壮苗培养、生根培养培养阶段的培养温度为23-25℃，培养基pH为5.6-6。
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| CN103891613B (zh) | 2016-04-20 |
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