CN106577286A - 一种细叶青蒌藤组培快繁的方法 - Google Patents

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    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants

Abstract

一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，包括以下步骤：外植体选取、外植体消毒、繁殖培养、复壮、生根和炼苗一体化培养、试管苗移栽。本发明是通过植物组培快繁技术繁育细叶青蒌藤种苗，可以不受季节、基质和穗条等因素影响，常年生产，且在较短时间内繁育出大量可供大田栽培的细叶青蒌藤种苗，显著提高了细叶青蒌藤繁殖系数和种苗质量，满足生产上的需要。

Description

一种细叶青蒌藤组培快繁的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是指一种细叶青蒌藤组培快繁的方法。
背景技术
细叶青蒌藤[Piper kadsura(Choisy)Ohwi]为胡椒科植物，主产于我国福建、广东、海南、四川、云南和台湾等地，是我国常用大宗中药材，以根茎入药。细叶青蒌藤含有较多的挥发油，具有抗炎镇痛的药理活性，有祛风湿、通经络、止痹通的功效，用于风寒湿痹、肢节疼痛、经脉拘挛、屈伸不利，民间还广泛应用于药膳。
由于细叶青蒌藤具有良好的疗效，原料用量不断增加，市场供不应求。近年来，随着沙县小吃对细叶青蒌藤需求量不断增加，在经济利益的驱使下，药农枯竭性采挖野生资源，致使其处于濒危边缘。目前，细叶青蒌藤主要采用扦插繁殖，由于扦插繁殖受到季节、基质和穗条等因素影响，产量很不稳定，经常出现供不应求局面。鉴于细叶青蒌藤的良好疗效和药膳价值，为了更好地保护、开发和利用中药细叶青蒌藤资源，势必采用一种新的种苗快速繁殖途径。目前，尚未有公开过关于细叶青蒌藤的组培快繁方法。
发明内容
本发明提供一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，其主要目的在于克服现有细叶青蒌藤产量不稳定，经常供不应求的缺陷。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，包括以下步骤：
1)外植体选取：剪取半木质化的细叶青蒌藤藤条，于自来水下冲洗干净，之后将该藤条切成3～4cm的带一个节藤段；
2)外植体消毒：在无菌条件下用72～75%酒精消毒30～60秒，再用无菌水冲洗1～3次；之后用0.1%升汞消毒6～10分钟，再用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸将表面的水分吸干备用；
3)繁殖培养：将消毒后的带一个节藤段切除掉与消毒液接触的两端0.5～1.0cm部分，并把剩下的藤段接种在诱导培养基上获得新苗；将新苗叶片去除，切割成1～3cm带节的藤段，并将其平铺在繁殖固体培养基上表面，然后将该藤段中的1/2～2/3部分植入该繁殖固体培养基内部，接种好后放置在培养室内培养55～65天；
所述繁殖固体培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT） 0.5～2.0mg/L ，吲哚丁酸（IBA）0.05～0.1mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
4)复壮、生根和炼苗一体化培养：培养室培养完后，将繁殖获得的大量带1～3个节的新苗剪下，接种到复壮、生根和炼苗一体化培养基中，在组培室培养12～18天，根原基刚出现即转入温室大棚进行复壮、生根和炼苗一体化培养25～35天，获得植株健壮、根系发达的试管苗；
所述复壮、生根和炼苗一体化培养基的配方为：1/3MS基本培养基，吲哚丁酸（IBA）0.1～0.5mg/L，蔗糖20.0g/L，琼脂粉5.0g/L，活性炭1.0g/L；
5)试管苗移栽：在温室大棚内形成健壮完整植株后，取出试管苗，洗去其根部残留的琼脂，并用70%甲基托布津药液浸泡10～15分钟，之后将该试管苗捞起并滤干药液，移栽到育苗大棚。
进一步的，所述诱导培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT）1.0mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L。
进一步的，所述培养室的培养条件为：温度22～28℃，光照强度1500～2000lux，光照时间10小时/天。
进一步的，所述组培室的培养条件为：温度22～25℃，光照强度1500～2000lux，光照时间12小时/天。
进一步的，所述温室大棚的培养条件为：温度20～28℃，相对湿度30～50%，采用自然光，遮光度85～90%。
进一步的，所述育苗大棚的培育条件为：相对湿度85～100%，温度20～30℃，遮光度75～85%。
1/3MS基本培养基为大量元素减为三分一的MS基本培养基，其提供了 N、P、K 等无机营养元素，以满足其植株生长的基本需求。
6-糠基氨基嘌呤（KT）：一种化学物质，分子式是 C10H9N5O；其具有促进细胞分裂和组织分化；诱导芽的分化，解除顶端优势；延缓蛋白质和叶绿素降解，有保鲜和防衰作用；延缓离层形成，增加坐果等作用。主要用于组织培养，与生长素配合促进细胞分裂，诱导愈伤组织及组织分化。
吲哚丁酸（IBA）：主要用于插条生根，可诱导根原体的形成，促进细胞分化和分裂，有利于新根生成和维管束系统的分化，促进插条不定根的形成，广泛应用于树木、花卉的扦插生根：也可促进部分组培苗的增殖。
和现有技术相比，本发明产生的有益效果在于:
1、本发明是通过植物组培快繁技术繁育细叶青蒌藤种苗，可以不受季节、基质和穗条等因素影响，常年生产，且在较短时间内繁育出大量可供大田栽培的细叶青蒌藤种苗，显著提高了细叶青蒌藤繁殖系数和种苗质量，满足生产上的需要。
2、本发明是通过繁殖培养和复壮、生根和炼苗一体化培养两步培养法进行细叶青蒌藤规模化生产，减少培养步骤，缩短了培养时间，降低了生产成本，提高了细叶青蒌藤组培苗生产效率。
3、本发明在复壮、生根和炼苗一体化培养基上获得植株健壮、根系发达试管苗，移栽到育苗大棚后成活率在98%以上。
具体实施方式
下面说明本发明的具体实施方式。
一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，包括以下步骤：
步骤一
外植体选取：剪取半木质化的细叶青蒌藤藤条，于自来水下冲洗干净，之后将该藤条切成3～4cm的带一个节藤段。
步骤二
外植体消毒：在无菌条件下用72～75%酒精消毒30～60秒，再用无菌水冲洗1～3次；之后用0.1%升汞消毒6～10分钟，再用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸将表面的水分吸干备用。
步骤三
繁殖培养：将消毒后的带一个节藤段切除掉与消毒液接触的两端0.5～1.0cm部分，并把剩下的藤段接种在诱导培养基上获得新苗，这是由于消毒时，消毒液会感染该藤段两端的伤口，因此需要切除，避免其腐烂；将新苗叶片去除，切割成1～3cm带节的藤段，并将其平铺在繁殖固体培养基上表面，然后将该藤段中的1/2～2/3部分植入该繁殖固体培养基内部，剩下的1/3～1/2部分留在繁殖固体培养基上表面，接种好后放置在培养室内培养55～65天，培养完后每个节可获得带1～3个节的新苗。
其中，诱导培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT）1.0mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
繁殖固体培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT） 0.5～2.0mg/L ，吲哚丁酸（IBA）0.05～0.1mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
培养室的培养条件为：温度22～28℃，光照强度1500～2000lux，光照时间10小时/天。
步骤四
复壮、生根和炼苗一体化培养：培养室培养完后，将繁殖获得的大量带1～3个节的新苗剪下，接种到复壮、生根和炼苗一体化培养基中，在组培室培养12～18天，根原基刚出现即转入温室大棚进行复壮、生根和炼苗一体化培养25～35天，获得植株健壮、根系发达的试管苗。
其中，复壮、生根和炼苗一体化培养基的配方为：1/3MS基本培养基，吲哚丁酸（IBA）0.1～0.5mg/L，蔗糖20.0g/L，琼脂粉5.0g/L，活性炭1.0g/L；
组培室的培养条件为：温度22～25℃，光照强度1500～2000lux，光照时间12小时/天；
温室大棚的培养条件为：温度20～28℃，相对湿度30～50%，采用自然光，遮光度85～90%。
步骤五
试管苗移栽：在温室大棚内形成健壮完整植株后，取出试管苗，洗去其根部残留的琼脂，并用70%甲基托布津药液浸泡10～15分钟，之后将该试管苗捞起并滤干药液，移栽到育苗大棚。
其中，育苗大棚的培育条件为：相对湿度85～100%，温度20～30℃，遮光度75～85%。
本发明通过植物组培快繁技术繁育细叶青蒌藤种苗，可以不受季节、基质和穗条等因素影响，常年生产，且在较短时间内繁育出大量可供大田栽培的细叶青蒌藤种苗，显著提高了细叶青蒌藤繁殖系数和种苗质量，满足生产上的需要；并且通过繁殖培养和复壮、生根和炼苗一体化培养两步培养法进行细叶青蒌藤规模化生产，减少培养步骤，缩短了培养时间，降低了生产成本，提高了细叶青蒌藤组培苗生产效率；在复壮、生根和炼苗一体化培养基上获得植株健壮、根系发达试管苗，移栽到育苗大棚后成活率在98%以上。
实施例一
步骤一
外植体选取：剪取半木质化的细叶青蒌藤藤条，于自来水下冲洗干净，之后将该藤条切成3～4cm的带一个节藤段。
步骤二
外植体消毒：在无菌条件下用72～75%酒精消毒30～60秒，再用无菌水冲洗1～3次；之后用0.1%升汞消毒6～10分钟，再用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸将表面的水分吸干备用。
步骤三
繁殖培养：将消毒后的带一个节藤段切除掉与消毒液接触的两端0.5～1.0cm部分，并把剩下的藤段接种在诱导培养基上获得新苗；将新苗叶片去除，切割成1～3cm带节的藤段，并将其平铺在繁殖固体培养基上表面，然后将该藤段中的1/2～2/3部分植入该繁殖固体培养基内部，接种好后放置在培养室内培养55天，培养完后每个节可获得带1～3个节的新苗。
其中，诱导培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT）1.0mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
繁殖固体培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT） 0.5mg/L ，吲哚丁酸（IBA）0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
培养室的培养条件为：温度22～28℃，光照强度1500～2000lux，光照时间10小时/天。
步骤四
复壮、生根和炼苗一体化培养：培养室培养完后，将繁殖获得的大量带1～3个节的新苗剪下，接种到复壮、生根和炼苗一体化培养基中，在组培室培养12天，根原基刚出现即转入温室大棚进行复壮、生根和炼苗一体化培养25天，获得植株健壮、根系发达的试管苗。
其中，复壮、生根和炼苗一体化培养基的配方为：1/3MS基本培养基，吲哚丁酸（IBA）0.1mg/L，蔗糖20.0g/L，琼脂粉5.0g/L，活性炭1.0g/L；
组培室的培养条件为：温度22～25℃，光照强度1500～2000lux，光照时间12小时/天；
温室大棚的培养条件为：温度20～28℃，相对湿度30～50%，采用自然光，遮光度85～90%。
步骤五
试管苗移栽：在温室大棚内形成健壮完整植株后，将组培瓶瓶盖打开，取出50瓶试管苗，每瓶10株，共500株，洗去根部残留的琼脂后统计生根植株500株，生根率100%，并用70%甲基托布津药液浸泡10～15分钟，之后将该试管苗捞起并滤干药液，移栽到育苗大棚，经统计成活植株491株，成活率98.2%。
实施例二
步骤一
外植体选取：剪取半木质化的细叶青蒌藤藤条，于自来水下冲洗干净，之后将该藤条切成3～4cm的带一个节藤段。
步骤二
外植体消毒：在无菌条件下用72～75%酒精消毒30～60秒，再用无菌水冲洗1～3次；之后用0.1%升汞消毒6～10分钟，再用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸将表面的水分吸干备用。
步骤三
繁殖培养：将消毒后的带一个节藤段切除掉与消毒液接触的两端0.5～1.0cm部分，并把剩下的藤段接种在诱导培养基上获得新苗；将新苗叶片去除，切割成1～3cm带节的藤段，并将其平铺在繁殖固体培养基上表面，然后将该藤段中的1/2～2/3部分植入该繁殖固体培养基内部，接种好后放置在培养室内培养60天，培养完后每个节可获得带1～3个节的新苗。
其中，诱导培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT）1.0mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
繁殖固体培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT） 1.0mg/L ，吲哚丁酸（IBA）0.07mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
培养室的培养条件为：温度22～28℃，光照强度1500～2000lux，光照时间10小时/天。
步骤四
复壮、生根和炼苗一体化培养：培养室培养完后，将繁殖获得的大量带1～3个节的新苗剪下，接种到复壮、生根和炼苗一体化培养基中，在组培室培养15天，根原基刚出现即转入温室大棚进行复壮、生根和炼苗一体化培养30天，获得植株健壮、根系发达的试管苗。
其中，复壮、生根和炼苗一体化培养基的配方为：1/3MS基本培养基，吲哚丁酸（IBA）0.3mg/L，蔗糖20.0g/L，琼脂粉5.0g/L，活性炭1.0g/L；
组培室的培养条件为：温度22～25℃，光照强度1500～2000lux，光照时间12小时/天；
温室大棚的培养条件为：温度20～28℃，相对湿度30～50%，采用自然光，遮光度85～90%。
步骤五
试管苗移栽：在温室大棚内形成健壮完整植株后，将组培瓶瓶盖打开，取出50瓶试管苗，每瓶10株，共500株，洗去根部残留的琼脂后统计生根植株500株，生根率100%，并用70%甲基托布津药液浸泡10～15分钟，之后将该试管苗捞起并滤干药液，移栽到育苗大棚，经统计成活植株493株，成活率98.6%。
实施例三
步骤一
外植体选取：剪取半木质化的细叶青蒌藤藤条，于自来水下冲洗干净，之后将该藤条切成3～4cm的带一个节藤段。
步骤二
外植体消毒：在无菌条件下用72～75%酒精消毒30～60秒，再用无菌水冲洗1～3次；之后用0.1%升汞消毒6～10分钟，再用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸将表面的水分吸干备用。
步骤三
繁殖培养：将消毒后的带一个节藤段切除掉与消毒液接触的两端0.5～1.0cm部分，并把剩下的藤段接种在诱导培养基上获得新苗；将新苗叶片去除，切割成1～3cm带节的藤段，并将其平铺在繁殖固体培养基上表面，然后将该藤段中的1/2～2/3部分植入该繁殖固体培养基内部，接种好后放置在培养室内培养60天，培养完后每个节可获得带1～3个节的新苗。
其中，诱导培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT）1.0mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
繁殖固体培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT） 1.5mg/L ，吲哚丁酸（IBA）0.08mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
培养室的培养条件为：温度22～28℃，光照强度1500～2000lux，光照时间10小时/天。
步骤四
复壮、生根和炼苗一体化培养：培养室培养完后，将繁殖获得的大量带1～3个节的新苗剪下，接种到复壮、生根和炼苗一体化培养基中，在组培室培养15天，根原基刚出现即转入温室大棚进行复壮、生根和炼苗一体化培养30天，获得植株健壮、根系发达的试管苗。
其中，复壮、生根和炼苗一体化培养基的配方为：1/3MS基本培养基，吲哚丁酸（IBA）0.4mg/L，蔗糖20.0g/L，琼脂粉5.0g/L，活性炭1.0g/L；
组培室的培养条件为：温度22～25℃，光照强度1500～2000lux，光照时间12小时/天；
温室大棚的培养条件为：温度20～28℃，相对湿度30～50%，采用自然光，遮光度85～90%。
步骤五
试管苗移栽：在温室大棚内形成健壮完整植株后，将组培瓶瓶盖打开，取出50瓶试管苗，每瓶10株，共500株，洗去根部残留的琼脂后统计生根植株500株，生根率100%，并用70%甲基托布津药液浸泡10～15分钟，之后将该试管苗捞起并滤干药液，移栽到育苗大棚，经统计成活植株494株，成活率98.8%。
实施例四
步骤一
外植体选取：剪取半木质化的细叶青蒌藤藤条，于自来水下冲洗干净，之后将该藤条切成3～4cm的带一个节藤段。
步骤二
外植体消毒：在无菌条件下用72～75%酒精消毒30～60秒，再用无菌水冲洗1～3次；之后用0.1%升汞消毒6～10分钟，再用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸将表面的水分吸干备用。
步骤三
繁殖培养：将消毒后的带一个节藤段切除掉与消毒液接触的两端0.5～1.0cm部分，并把剩下的藤段接种在诱导培养基上获得新苗；将新苗叶片去除，切割成1～3cm带节的藤段，并将其平铺在繁殖固体培养基上表面，然后将该藤段中的1/2～2/3部分植入该繁殖固体培养基内部，接种好后放置在培养室内培养65天，培养完后每个节可获得带1～3个节的新苗。
其中，诱导培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT）1.0mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
繁殖固体培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT）2.0mg/L ，吲哚丁酸（IBA）0.1mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
培养室的培养条件为：温度22～28℃，光照强度1500～2000lux，光照时间10小时/天。
步骤四
复壮、生根和炼苗一体化培养：培养室培养完后，将繁殖获得的大量带1～3个节的新苗剪下，接种到复壮、生根和炼苗一体化培养基中，在组培室培养18天，根原基刚出现即转入温室大棚进行复壮、生根和炼苗一体化培养35天，获得植株健壮、根系发达的试管苗。
其中，复壮、生根和炼苗一体化培养基的配方为：1/3MS基本培养基，吲哚丁酸（IBA）0.5mg/L，蔗糖20.0g/L，琼脂粉5.0g/L，活性炭1.0g/L；
组培室的培养条件为：温度22～25℃，光照强度1500～2000lux，光照时间12小时/天；
温室大棚的培养条件为：温度20～28℃，相对湿度30～50%，采用自然光，遮光度85～90%。
步骤五
试管苗移栽：在温室大棚内形成健壮完整植株后，将组培瓶瓶盖打开，取出50瓶试管苗，每瓶10株，共500株，洗去根部残留的琼脂后统计生根植株500株，生根率100%，并用70%甲基托布津药液浸泡10～15分钟，之后将该试管苗捞起并滤干药液，移栽到育苗大棚，经统计成活植株495株，成活率99%。
上述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (6)

1.一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1) 外植体选取：剪取半木质化的细叶青蒌藤藤条，于自来水下冲洗干净，之后将该藤条切成3～4cm的带一个节藤段；
2) 外植体消毒：在无菌条件下用72～75%酒精消毒30～60秒，再用无菌水冲洗1～3次；之后用0.1%升汞消毒6～10分钟，再用无菌水冲洗3～5次，最后用无菌滤纸将表面的水分吸干备用；
3) 繁殖培养：将消毒后的带一个节藤段切除掉与消毒液接触的两端0.5～1.0cm部分，并把剩下的藤段接种在诱导培养基上获得新苗；将新苗叶片去除，切割成1～3cm带节的藤段，并将其平铺在繁殖固体培养基上表面，然后将该藤段中的1/2～2/3部分植入该繁殖固体培养基内部，接种好后放置在培养室内培养55～65天,所述繁殖固体培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT） 0.5～2.0mg/L ，吲哚丁酸（IBA）0.05～0.1mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L；
4) 复壮、生根和炼苗一体化培养：培养室培养完后，将繁殖获得的大量带1～3个节的新苗剪下，接种到复壮、生根和炼苗一体化培养基中，在组培室培养12～18天，根原基刚出现即转入温室大棚进行复壮、生根和炼苗一体化培养25～35天，获得植株健壮、根系发达的试管苗,所述复壮、生根和炼苗一体化培养基的配方为：1/3MS基本培养基，吲哚丁酸（IBA）0.1～0.5mg/L，蔗糖20.0g/L，琼脂粉5.0g/L，活性炭1.0g/L；
5) 试管苗移栽：在温室大棚内形成健壮完整植株后，取出试管苗，洗去其根部残留的琼脂，并用70%甲基托布津药液浸泡10～15分钟，之后将该试管苗捞起并滤干药液，移栽到育苗大棚。
2.如权利要求1所述一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，其特征在于：所述诱导培养基的配方为：1/3MS基本培养基，6-糠基氨基嘌呤（KT）1.0mg/L，吲哚丁酸（IBA）0.05mg/L，蔗糖30.0g/L，琼脂粉5.0g/L。
3.如权利要求1所述一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，其特征在于：所述培养室的培养条件为：温度22～28℃，光照强度1500～2000lux，光照时间10小时/天。
4.如权利要求1所述一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，其特征在于：所述组培室的培养条件为：温度22～25℃，光照强度1500～2000lux，光照时间12小时/天。
5.如权利要求1所述一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，其特征在于：所述温室大棚的培养条件为：温度20～28℃，相对湿度30～50%，采用自然光，遮光度85～90%。
6.如权利要求1所述一种细叶青蒌藤组培快繁的方法，其特征在于：所述育苗大棚的培育条件为：相对湿度85～100%，温度20～30℃，遮光度75～85%。
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