CN101040601A - 卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法 - Google Patents
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Abstract
卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法。本发明涉及通过两种组织培养技术路线实现卡瓦胡椒植株再生的技术和方法，其主要特征在于：克服了卡瓦胡椒无菌离体组织培养中的技术瓶颈——内生菌污染，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插进行繁殖的单一繁殖方法，通过芽繁芽、愈伤组织诱导丛生芽两条途径成功实现了卡瓦胡椒无菌、无毒苗植株的再生和快繁。本方法培养的卡瓦胡椒幼苗为无菌、无毒苗，每月繁殖指数达7－8，生根率达100％，移栽成活率为87.2％。这项技术的发明和成功应用具有十分重要的社会和经济效益，能够为商品化、工厂化大规模快速生产卡瓦胡椒无菌、无毒栽培苗提供技术支撑。
Description
[技术领域]
本发明涉及卡瓦胡椒离体组织培养的技术与方法，包括通过芽繁芽、愈伤组织诱导出芽两条途径成功实现了卡瓦胡椒无菌、无毒苗植株的再生和快繁。
[背景技术]
卡瓦胡椒(Piper Methysticum Forst.f)，俗称卡瓦，多年生胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper)灌木类植物，是一种著名的药用植物，主要分布于瓦努阿图、斐济、汤加、巴布亚—新几内亚及所罗门群岛等南平洋诸岛国，近年引入我国试种。
卡瓦胡椒在南太平洋诸岛国已有3000多年的药用、栽培历史。利用卡瓦胡椒根或根茎制备的饮料具有放松肌肉和情绪、恢复体力、促进睡眠、减轻痛苦的作用。药理成份分析表明，卡瓦胡椒根的主要药理成份包括卡瓦因、二氢卡瓦因、醉椒苦素、二氢醉椒苦素、羊高宁及去甲氧基高羊宁等α-吡喃酮衍生物，统称为卡瓦内酯。病理学实验和临床实验证实，卡瓦胡椒根可用于治疗精神抑郁症、神经衰弱、植物性神经紊乱等。
卡瓦胡椒具有只开花不结果的生物学特性，目前主要以扦插方式进行繁殖。扦插繁殖需要消耗大量的健康茎段，影响植株正常生长发育，长期扦插繁殖也导致种苗带菌、种苗内生菌严重，致使种苗退化。发展卡瓦胡椒离体组织培养的技术与方法，将为大规模、商品化生产卡瓦胡椒无菌\无毒种苗、大规模人工栽培卡瓦胡椒打下基础。
由于长期依靠扦插繁殖，卡瓦胡椒植株表面带菌、内生菌较为严重。如何有效克服内生菌污染问题已经成为发展卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法的关键。Taylor and Taufa于1998年进行了尝试，但没有成功。2001年Briskin等通过表面消毒、在培养基中添加抗生素等多种办法，也仅获得了卡瓦胡椒叶片、茎段的愈伤组织，至今未见有通过离体组织培养技术获得完整再生卡瓦胡椒植株的报道。
本发明成功克服了卡瓦胡椒离体组织培养中的技术瓶颈——内生菌污染问题，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插进行繁殖的单一繁殖方法，通过芽繁芽、愈伤组织诱导出芽两条途径成功实现了卡瓦胡椒无菌、无毒苗植株的再生和快繁。
[发明内容]
本发明克服了卡瓦胡椒离体组织培养中的技术瓶颈——内生菌污染，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插进行繁殖的单一繁殖方法，通过芽繁芽、愈伤组织诱导出芽两条途径成功实现了卡瓦胡椒无菌、无毒苗植株的再生和快繁。本发明技术方案：通过2种组织培养技术路线实现卡瓦胡椒植株再生的技术和方法。其技术路线、步骤及特征如下：
技术路线、步骤及特征1.采用含有休眠芽茎段→接种于休眠芽诱导培养基上诱导休眠芽发芽→切取生长一定时间和具有一定长度的幼嫩芽接种于诱导培养基→诱导不定芽发生→切取不定芽转入继代培养基中增植培养→不定芽转入生根培养基中诱导不定根发生→形成具有根、茎、叶的完整卡瓦胡椒苗→移植于营养杯→组培苗大田种植的方法。
技术路线、步骤、步骤及特征2.采用含有休眠芽茎段→接种于休眠芽诱导培养基上诱导休眠芽发芽→切取生长一定时间和具有一定长度的幼嫩芽接种于诱导培养基→诱导不定芽发生→切取不定芽叶片诱导愈伤组织发生→将愈伤组织转入不定芽诱导培养基诱导丛生芽→切取单个芽转入生根培养基中诱导不定根发生→形成具有根、茎、叶的完整卡瓦胡椒苗→移植于营养杯→组培苗大田种植的方法。
结果分析：
1、外植体消毒：流线型自来水冲洗12小时后，将切割成1cm长的茎段(带有1个休眠芽)置于70％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不断搅动处理10-15分钟，在培养基上培养10天，可见的污染率仅有41％，这说明这种表面消毒处理对卡瓦胡椒茎段表面泥砂、细菌及其真菌孢子去除均有一定的作用。由于内生菌污染，培养30天时，污染率接近100％。
2、内生菌的去除及无菌芽获得
由于长期扦插繁殖，卡瓦胡椒内生菌污染严重，是卡瓦胡椒离体组织培养的技术瓶颈。本研究通过选择一定生长时间、一定长度的芽尖(来自休眠芽)为次级外植体，成功克服了这一困难，得到了完全无菌的芽。我们的研究表明，选择生长15天、0.5mm的芽尖用作次级外植体进行芽繁芽，二次污染率可以降低到64％。
3、通过芽繁芽获得较高的繁殖系数
通过芽繁芽途径，卡瓦胡椒每月增殖系数达7-8。
4、利用无菌苗叶片为外植体获得胚性愈伤组织并诱导丛生芽
以获得的无菌苗叶片为外植体，通过诱导胚性愈伤组织，继而诱导丛生芽途径也获得了较高的繁殖系数，最高达4.5。
5、高生根率：将获得的无菌芽切割，转至催根培养基，获得了最高的生根效率，可达100％。
6、较高的移栽成活率：正常条件下生长的小苗在移入大田前进行10-15天左右的驯化培养是必需的。根据本实验室对不同培养基质的配比试验，发现在砂∶石灰岩土∶椰糠＝1∶2∶1的基质中生长的小苗成活率高达87.2％。
本研究在国际上首次克服了卡瓦胡椒离体组织培养中的技术瓶颈——内生菌污染，打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插进行繁殖的单一繁殖方法，通过芽繁芽、愈伤组织诱导丛生芽两条途径成功实现了卡瓦胡椒无菌、无毒苗植株的再生和快繁。本方法培养的卡瓦胡椒幼苗为无菌、无毒苗，每月繁殖指数高达7-8，生根率100％，移栽成活率达到87％。通过此项研究，我们已掌握了从取样到移栽等一整套的操作技术，这项技术打破了卡瓦胡椒只能依靠扦插进行繁殖的单一繁殖方法，可以满足商品化、工厂化大规模快速生产卡瓦胡椒无菌、无毒栽培苗植株的要求，具有较大的商业应用前景。
[具体实施方式]
下面结合实施方式对本发明进行详细说明：
1、材料来源：以从库克等南太平洋岛国引种、种植于中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室温室的卡瓦胡椒(Piper MethysticumForst.f)一年生茎作为初始外植体。
2、方法：
(1)材料预处理及外植体消毒 ①预处理：取健康的一年生茎进行经预处理后，用流线型自来水冲洗过夜或不低于12小时；②外植体消毒：将初始外植体切割成1cm长的茎段外植体，每个外植体(茎段)带有1个休眠芽，用70％酒精处理30-60秒，0.1％升汞消毒10-15分钟，无菌水冲洗3-4次，每次5分钟。
(2)诱导休眠芽出芽
将消毒后的外植体接种于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小时光照/12小时黑暗条件下培养，光照强度为1500lx。
(3)切取初生芽及诱导丛生芽
切取生长15天、萌发的休眠芽尖端0.5mm芽尖为次级外植体，接种于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L诱导培养基(PH＝5.8)上诱导出芽。在此基础上，切取诱导出的芽接种于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L诱导培养基(PH＝5.8)培养基上，置于26-28℃、12小时光照/12小时黑暗、光照强度为1500lx条件下，以芽为基础诱导丛生芽。
(4)诱导愈伤组织及丛生芽
取芽繁芽途径获得的无菌苗叶片，接种于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基(pH＝5.8)上诱导愈伤组织，然后将生长良好的愈伤组织快接种于丛生芽诱导培养基MS+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小时光照/12小时黑暗、光照强度为1500lx条件下诱导愈伤组织出芽(丛生芽)。
(5)诱导生根
从丛生芽中切取生长良好的单个芽，接种于1/2MS+IBA0.75mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基(pH＝5.8)上，26-28℃、12小时光照/12小时黑暗、光照强度为1500lx条件下诱导生根。
(6)试管苗苗驯化及移栽
将生根苗置于自然光下经2-3天的炼苗后，洗去根上的琼脂，移栽于灭菌的基质(砂∶火山岩土∶椰糠＝1∶2∶1)中，26-28℃，每日光照培养12小时，强度为800lx，1-15天后移栽入大田。
附：相关数据与表格：
表一：休眠芽来源芽的生长时间与污染率之间的关系
(使用0.5-1.0mm长芽尖为外植体)
| 休眠芽来源芽的生长时间 | 10d | 15d | 20d | 25d |
| 二次污染率(％)芽尖死亡率(％)芽无污染率(％) | 56413 | 641026 | 9505 | 10000 |
表二：激素对芽增殖诱导的影响
| IAA(mg/L) | 6-BA(mg/L) | |||
| 0.1 | 0.5 | 1 | 1.5 | |
| 0.10.51.01.5 | 0000 | 07.6±0.43.4±0.32.8±0.4 | 05.5±0.35.8±0.42.3±0.3 | 02.3±0.44.2±0.22.7±0.4 |
表三：激素对愈伤组织诱导的影响(愈伤组织鲜重g)
| 6-BA(mg/L) | IAA(mg/L) | |||
| 0.05 | 0.1 | 0.5 | 1.0 | |
| 0.10.51.01.52.0 | 0240±10.5430±13.2720±20.2630±16.8 | 0290±9.6450±11.2680±23.8650±19.2 | 0270±11.4470±10.8490±11.7420±13.5 | 0120±15.2380±26.8260±19.2290±11.4 |
表四：4激素对愈伤组织诱导出芽的影响(芽数/每块愈伤组织)
| 6-BA(mg/L) | IAA(mg/L) | |||
| 0.05 | 0.1 | 0.5 | 1.0 | |
| 0.51.01.52.0 | 01.7±0.31.3±0.70 | 03.2±0.81.9±0.80 | 1.3±0.24.2±0.12.4±0.70 | 1.5±0.22.1±0.92.0±0.50 |
表五：不同浓度IBA对催根效果的影响.
| IBA(mg/L) | 生根芽的比率 | 根的数量 | 平均根长(mm) |
| 0.00.050.10.50.751.01.25 | 10.0±3.315±3.745±5.374.5±4.810010084.2±3.4 | 2.0±0.34.4±0.56.9±0.910.5±0.811.8±1.712.5±1.32.7±0.6 | 1.3±0.62.7±0.72.5±1.14.4±1.34.9±0.94.5±0.73.8±0.8 |
附图说明：卡瓦胡椒离体组织培养的技术与方法。A.诱导休眠芽出芽；B.诱导芽增殖；C.诱导愈伤组织；D.诱导丛生芽；E.催根；F.组培苗完整植株。
Claims (8)
1.卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法，即通过2种组织培养技术路线实现卡瓦胡椒植株再生的技术和方法。其技术路线、步骤及特征如下：
技术路线、步骤及特征1.采用含有休眠芽茎段→接种于休眠芽诱导培养基上诱导休眠芽发芽→切取生长一定时间和具有一定长度的幼嫩芽接种于诱导培养基→诱导不定芽发生→切取不定芽转入继代培养基中增殖培养→不定芽转入生根培养基中诱导不定根发生→形成具有根、茎、叶的完整卡瓦胡椒苗→移植于营养杯→组培苗大田种植的方法。
技术路线、步骤、步骤及特征2.采用含有休眠芽茎段→接种于休眠芽诱导培养基上诱导休眠芽发芽→切取生长一定时间和具有一定长度的幼嫩芽接种于诱导培养基→诱导不定芽发生→切取不定芽叶片诱导愈伤组织发生→将愈伤组织转入不定芽诱导培养基诱导丛生芽→切取单个芽转入生根培养基中诱导不定根发生→形成具有根、茎、叶的完整卡瓦胡椒苗→移植于营养杯→组培苗大田种植的方法。
2.根据权利要求1所述的卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法，其特征在于利用一年生、带有休眠芽的健康卡瓦胡椒茎为初始外植体。
3.根据权利要求1所述的卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法，其特征在于对初始外植体进行预处理，方法为：用流线型自来水常温条件下冲洗12小时。
4.根据权利要求1所述的卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法，其特征在于将预处理后的初始外植体即带有休眠芽的茎，切割成带有一个休眠芽、约1cm长的茎段作为外植体。然后，将外植体接种于MS+BA 0.5mg/L+IAA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+7g/L琼脂培养基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小时光照/12小时黑暗条件下培养，光照强度为1500lx。
5.根据权利要求1所述的卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法，其特征在于：切取生长15天、萌发的休眠芽尖端0.5-1mm芽尖为次级外植体，接种于MS+BA0.5mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L诱导培养基(PH＝5.8)上诱导出芽。在此基础上，切取诱导出的芽接种于MS+BA 0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L诱导培养基(PH＝5.8)培养基上，置于26-28C、12小时光照/12小时黑暗、光照强度为1500lx条件下，诱导芽繁芽。
6.根据权利要求1所述的卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法，其特征在于：取芽繁芽途径获得的无菌苗叶片，接种于MS+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基(pH＝5.8)上诱导愈伤组织，然后将生长良好的愈伤组织快接种于丛生芽诱导培养基MS+BA1.0mg/L+IAA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基(pH＝5.8)上，置于26-28℃、12小时光照/12小时黑暗、光照强度为1500lx条件下诱导愈伤组织出芽(丛生芽)。
7.根据权利要求1所述的卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法，其特征在于：将权利要求5和6获得的芽，进行催根培养，步骤为：将繁殖芽接种于1/2MS+IBA0.75mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L培养基(pH＝5.8)上，26-28℃、12小时光照/12小时黑暗、光照强度为1500lx条件下诱导生根。
8.根据权利要求1所述，其特征在于所述的卡瓦胡椒离体组织培养技术与方法，试管苗驯化及移栽步骤为：生根苗经2-3天的自然光炼苗后，洗去根上的琼脂，移栽于灭菌的基质(砂∶火山岩土∶椰糠＝1∶2∶1)中，26-28℃，每日光照培养12小时，强度为800lx，20天后移栽入大田。
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