CN107094625B - 一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其技术方案要点是步骤为选取外植体，将外植体置于培养基中进行培养，选取外植体后，再将外植体置于培养基内之前，对外植体进行消毒处理；所选取的外植体中，导管尚未发育成熟，为活细胞，能够分裂增殖，其木薄壁组织对外植体的难以起到阻碍分裂的作用。将外植体消毒能够有效去除外植体表面的细菌，减小细菌污染培养基的可能性；同时，不对外植体进行搅碎的操作，能够减少破碎细胞的数量，以便降低细菌污染外植体的可能性，在后期的培养中，细菌的数量少，难以对培养基中的外植体起到污染、损害的作用，以利于外植体正常增殖，提高了实验成功的可能性，利于大批量商业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及植物培养，特别涉及一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法。
背景技术
红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物。紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物,也是惟一可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。但是紫杉醇在红豆杉植物中含量很低，因此市场上对于红豆杉的需求很高。
红豆杉植物常规的繁殖方式主要为扦插和播种两种繁殖方式。但红豆杉种子种皮厚，处于深休眠状态，自然状态下经两冬一夏才能萌发，天然更新能力弱，使得播种繁殖的难度较大；同时扦插枝条也由于生根条件苛刻，造成生根率较低，扦插成活率低。因此采用传统的繁殖方式难易满足红豆杉的规模化生产。
目前，公开号为CN1454465A的中国专利公开了一种红豆杉种苗组织培养基及其种苗繁育方法，它包括营养剂、生长促进剂、稳定剂、微量元素配制而成。并将红豆杉母体树的嫩扦枝、或嫩枝（芽）叶经机械粉碎后的组织细胞浆加入上述培养基中进行组培。
这种培养方法未经消毒，将嫩枝或嫩芽机械粉碎后，部分细胞被搅碎，未经消毒残留的细菌在恒温培养的过程中，以破碎细胞为母体增殖，对培养基造成污染。
发明内容
本发明的一目的是提供一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其具有减少对培养基的污染的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，步骤为：选取外植体，对外植体进行表面消毒，接种到启动培养基中并给以合适的环境条件进行启动培养，转接到增殖培养基中并给以合适的培养条件进行腋芽增殖培养，对增殖腋芽进行分割并转接到壮苗培养基中给以合适培养条件进行壮苗培养，将经过壮苗培养的无根组培苗接种到生根培养基中并给予合适的培养条件进行生根诱导，所剪取的外植体保留有外植体的高增殖能力；
筛选剪取外植体包括如下步骤：
S1：选取外植体并对外植体消毒所需的苗木个体为生长年限为3～4年之间的健壮苗木个体，该苗木无病虫害、无机械损伤、无叶片畸形；
S2：选取苗木个体于春季自然萌发的嫩梢，所述嫩梢中木质素低于20%，所述嫩梢中的导管分子处于发育初期，为活细胞状态；
S3：所选取的嫩梢长度在5cm至10cm之间；
S4：所述嫩梢生长于靠近苗木个体主干处的叶片呈螺旋状排列的枝条上；
消毒处理包括如下步骤：
S1：采用酒精棉擦拭外植体表面；
S2:剪取擦拭过的外植体，所述外植体带有叶片、嫩芽；
S3：将剪取的外植体置于流水下冲洗0.5h～1h；
S4：将冲洗后的外植体置于超净工作台中，采用医用酒精消毒10～60S；
S5：将采用酒精消毒后的外植体采用无菌水冲洗2～4遍；
S6：将冲洗后的外植体采用漂白水消毒30 min ～60min，所述漂白水由一份体积的商品漂白水添加四份体积的无菌水勾兑配置而成；
S7：将漂白水消毒后的外植体采用无菌水冲洗3～4次。
通过采用上述技术方案，所选取的外植体中，导管尚未发育成熟，为活细胞，能够分裂增殖，其木薄壁组织对外植体的难以起到阻碍分裂的作用。将外植体消毒能够有效去除外植体表面的细菌，减小细菌污染培养基的可能性；同时，不对外植体进行搅碎的操作，能够减少破碎细胞的数量，以便降低细菌污染外植体的可能性，在后期的培养中，细菌的数量少，难以对培养基中的外植体起到污染、损害的作用，以利于外植体正常增殖，提高了实验成功的可能性，以便得到更高的生根率、成活率，便于批量生产。
进一步设置：根据权利要求1所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：将消毒后的外植体置于芽诱导培养基中启动培养，启动培养包括如下步骤：
S1：将消毒后的外植体上部分叶片切除，切除部分为叶片总量的2\3；
S2:将除叶后的外植体切成段状，每一段的长度限制在1 cm ～2cm；
S3：将切段后的外植体置于芽诱导培养基中，并置于22～25℃室温下培养；
S4：培养室中设置光照条件，光照强度范围为1500LUX～2500LUX；
S5：培养室中设置光照条件，光照周期为16小时光照，8小时暗培养；
S6：外植体在恒温培养室中启动培养4周～8周，腋芽萌发。
通过采用上述技术方案，在允许范围内，将叶片切除越多，外植体上用于叶片生长的能耗越少，所省能量能够提供给分裂增殖中的细胞，使其具有充分的养分。留下部分叶片后，这些留下的叶片能够进行光合作用提供养分。20℃～28℃的恒温为植物生长最合适的温度，便于细胞生长。光照的周期性既能够实现植物的光合作用，也能够实现植物的呼吸作用，使植物正常生长，降低植物的死亡率，利于批量生产。
进一步设置：所述芽诱导培养基的成分配比如下：
WPM 2.7g/L
2IP 1.0～3.5 mg/L
蔗糖 15～45g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
所述芽诱导培养基的溶剂采用水，所述芽诱导培养基的PH值为5.50～6.00；
通过采用上述技术方案，蔗糖为主要营养来源，琼脂起到固定的作用，使培养基整体结构稳固，利于植物在培养基中正常生长、利于后期批量成活、批量生产。
进一步设置：对已经过启动培养的外植体进行增殖培养，增殖培养包括如下步骤：
S1：将腋芽接种至固体增殖培养基中，并置于22～25℃室温下培养；
S2：将接种至增殖培养基中的腋芽置于黑暗条件下进行暗培养40h～60h，然后再给予光照；
S3：对暗培养后的腋芽给光，光强范围为1500～3000LUX，光照周期为光照16小时，暗培养8小时；
S4：将腋芽增殖培养4周～8周；获得团芽；
S5：每4～8周将增殖得到的团芽分割为单个芽；
S6：将分割得到的单个芽重新接种于固体增殖培养基中。
通过采用上述技术方案，腋芽具有高增殖性，将整团腋芽放置于培养基中培养，能够尽量保持腋芽的原本的生长状态，相较于切开或搅碎的操作，对外植体的损害更小。当腋芽增殖到团芽时，团芽中的细胞种类已经变多，易发生细胞变态，向成熟植株发展，此时将单个芽重新接种后，能够继续使用增殖能力最高的部分，达到高效增殖的目的；高效增殖后，成活数量随之变多，以达到批量生产的目的。
进一步设置：所述固体增殖培养基的成分配比如下：
WPM 2.7g/L
2IP 1.0～3.5mg/L
ZT 1.5～4.0mg/L
蔗糖 20～30g/L
琼脂 5.0～7.0g/L
所述固体增殖培养基的PH值为5.50～6.00。
通过采用上述技术方案，2IP为异戊烯基腺嘌呤核苷，在生物试剂中，采用该浓度的配方，能够使腋芽的增殖过程人为可控，增殖倍率为3～4倍，且芽体健壮，玻璃化率低于0.1%。
进一步设置：对增殖得到的团芽进行壮苗培养，壮苗培养包括如下步骤：
S1：将增殖培养所得的团芽分割后转移至壮苗培养基中；
S2：对分割后的团芽提供光照，光强范围为2000 LUX ～3000LUX，光照周期为光照16小时，暗培养8小时；
S3：将分割后的团芽置于10℃～30℃的环境中；
S4：将分割后的团芽培养5周～7周，得到生长高度为3cm的无根组培苗。
通过采用上述技术方案，分割后的团芽具有高增殖能力，且团芽中细胞种类多，此时细胞的状态已经确定，细胞能够开始生长，直至团芽长成完整植株，得到组培苗。培养5周及以上后，组培苗的生长状态趋于稳定，不易发生死苗等现象，利于植物后期批量成活、批量生产。
进一步设置：所述壮苗培养基的成分配比如下：
1/2WPM 1.35g/L
蔗糖 20～30g/L
琼脂 5.0～7.0g/L
活性炭 0.5～1.0g/L
所述壮苗培养基的PH值为5.50～6.00。
通过采用上述技术方案，该配方能够尽量保障团芽在长成组培苗的过程中保持稳定生长，活性炭的添加起到了吸附能力，使得培养基中的环境更整洁，利于植物在培养基中正常生长、利于后期批量成活、批量生产。
进一步设置：对组培苗进行生根培养，生根培养包括如下步骤：
S1：选取茎段高度为2cm～4cm的无根组培苗，切取茎段底部0.3cm～0.5cm的茎段，竖直插入生根培养基；
S2：对茎段提供光照，光强范围为2000 LUX ～3000LUX，光照周期为光照16小时，暗培养8小时；
S3：将茎段置于10～20℃的环境中；
S4：将茎段置于生根培养基中培养2周～6周；
S5：将茎段所处的环境替换为：20℃～30℃的环境，培养4周～8周，部分茎段获得生根培养组培苗。
通过采用上述技术方案，生根培养的过程中，需要茎段处的细胞变态增殖，且光照周期提供给植物呼吸作用和光合作用的时间，以便植物产生和储存能量。
作为本实施例中采用，所述生根培养基的成分配比如下：
WPM 2.7g/L
IBA 0.5～1.0mg/L
2,4-D 1.0～2.0 mg/L
AC 0.5～1.0g/L
蔗糖 15～30g/L
琼脂 5.0～7.0g/L
所述生根培养基的PH值为5.50～6.00。
通过采用上述技术方案，该配方能够促进植物产生的根与植物体结构相连，避免从愈伤组织上产生假性根，且生长出的根粗壮、无侧根，能够在移栽时降低损伤、快速成活，利于植物在培养基中正常生长、利于后期批量成活、批量生产。
一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，步骤为选取外植体，将外植体置于培养基中进行培养，其特征在于：筛选剪取外植体保留有外植体的高增殖能力，再将外植体置于培养基内之前，对外植体进行消毒处理；
消毒处理包括如下步骤：
S1：调制消毒液体，所述消毒液体设置为含有5%～10%浓度双氧水的无菌水；
S2：将外植体置于消毒液体中消毒10min～30min；
S3：采用无菌滤纸吸干外植体表面明水。
通过采用上述技术方案，能够有效去除外植体上大部分的细菌，吸干表面明水后，还能够减小明水将培养基内养分冲淡、影响培养基内百分比的可能性。这种操作方法能够有效提高实验对象的生根率、成活率，相较于科研的高成本培养，这种方法在确保低成本的同时，能够满足批量生产的要求，利于商业化大批量生产。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
实施例1：一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，依次为：选取外植体、对外植体进行消毒、将外植体置于培养基中进行培养。
外植体选取的步骤入下：
选择生长年限为3～4年苗木个体的春季自然萌发的未木质化的嫩梢，嫩梢取材长度为5～10cm，嫩梢中木质素低于20%，其内的导管分子处于发育初期，为活细胞状态；本实施例中选取靠近主干生长的叶子呈螺旋状排列的枝条为备用的外植体。
消毒方法包括如下步骤：
用酒精棉擦拭外植体表面灰尘，剪取的带叶枝条在流水下冲洗0.5～1小时，本实施例中采用1小时，然后转入超净工作台中用75%浓度的医用酒精溶液消毒10～60秒，本实施例中采用30秒，再用无菌水冲洗2～4遍，本实施例中采用3遍；之后用1:6的漂白水，本实施例中采用1:4的比例（漂白水为白猫牌超市购买所得，1:4的比例是指1份体积的白猫漂白水勾兑4份体积的无菌水），消毒30～60min，本实施例中采用40分钟；无菌水冲洗3～4次，本实施例中采用3次。
启动培养步骤如下：
消毒后的外植体将叶片切除一部分，本实施例中采用切除2/3，外植体切成1cm～2cm的节段，本实施例中采用1.5cm，接种到芽诱导培养基中，转入培养室进行培养。培养室温度为22℃～25℃，本实施例中采用25℃；光照强度为1500～2500LUX，本实施例中采用2000LUX。光周期12～20/8h，本实施例中采用16/8h，即16小时光照，8小时暗培养；进行启动培养4～8周，本实施例中采用6周，休眠腋芽萌发，启动培养完成；
启动培养基包括如下配比的组分(以水为溶剂，每升水中含有如下物质及浓度，下同)：
WPM 2.7g/L
2IP 1.0～3.5 mg/L
蔗糖 15～45g/L
琼脂 5.5～7.0g/L
PH值5.50～6.00，本实施例中采用5.90；
该配方能够快速打破腋芽休眠，促进腋芽萌发，同时能够有效避免愈伤组织的产生。
2IP来源于市售进口分装2IP（中文名“异戊烯基腺嘌呤核苷”药品，分析纯）,烈性细胞分裂素类物质；
增殖培养步骤如下：
将启动培养萌发的腋芽，接种于固体增殖培养基中，培养温度为22～25℃，本实施例中采用25℃，暗培养40～60小时，本实施例中采用48小时，然后给光照，光照强度范围为1500～3000LUX，本实施例中采用2000LUX，光周期为12～20/8h，本实施例中采用16/8h，即16小时光照，8小时暗培养；增殖培养4～8周，本实施例中采用6周，增殖倍率达3倍，获得增殖出的团芽，每4周将增殖出的团芽分割成单个芽，并重新接种于增殖培养基中，扩量增殖；
固体增殖培养基，包括如下配比的组分：
WPM 2.7g/L
2IP 1.0～3.5mg/L
ZT 1.5～4.0mg/L
蔗糖 20～30g/L
琼脂 5.0～7.0g/L
PH值为5.50～6.00，本实施例中采用5.90；
2IP来源于市售进口分装2IP药品，中文名为“异戊烯基腺嘌呤核苷”，分析纯，进口分装；
ZT来源于市售ZT药品，中文名为玉米素，分析纯，进口分装；
该配方能够保障腋芽增殖人为可控，增殖倍率为3～4倍，且芽体健壮，玻璃化率低于0.1%；
壮苗培养的步骤如下：
将在增殖培养基中增殖出的团芽，分割后转移到壮苗培养基中，光照2000～3000LUX，本实施例中采用2500LUX，光周期12～20/8h，本实施例中采用16/8h，，即16小时光照，8小时暗培养；培养环境温度范围为10～30℃，本实施例中采用20℃，培养5～7周，本实施例中采用6周，单个芽生长健壮，并且生长高度达到3cm，获得壮苗培养的无根组培苗；
壮苗培养基，包括如下配比的组分：
1/2WPM 1.35g/L
蔗糖 20～30g/L
琼脂 5.0～7.0g/L
活性炭 0.5～1.0g/L
PH值为5.50～6.00，本实施例中采用5.90；
生根培养的步骤如下：
将经过壮苗培养的组培苗，高度达到2～4cm，本实施例中采用3～4cm的茎段，切除茎段底部0.3～0.5mm的茎段，本实施例中的切除长度为0.3mm；茎段插入生根培养基8～10mm，且将茎段竖直插入，光照1000～3000LUX，本实施例中采用2000LUX，光周期12～20/8h，本实施例中采用16/8h，即16小时光照，8小时暗培养；环境温度为10～30℃，本实施例中采用18℃，培养2～6周，本实施例中采用4周；然后培养温度调整到20～30℃，本实施例中采用25℃，再培养4～8周，本实施例中采用6周；50%的植株具有有效健壮根1～3条，根长20～40mm，无侧根，即获得生根培养组培苗；生根率为50%。
生根培养基生包括如下配比的组分：
WPM 2.7g/L
IBA 0.5～1.0mg/L
2,4-D 1.0～2.0 mg/L
AC 0.5～1.0g/L
蔗糖 15～30g/L
琼脂 5.0～7.0g/L
PH值为5.50～6.00，本实施例中采用5.90；
IBA来源于市售进口分装IBA药品，中文名为吲哚丁酸，分析纯；
2,4-D来源于市售进口分装2,4-D药品，中文名为2,4-二氯苯氧乙酸，分析纯；
AC来源于市售进口分装AC药品，中文名为活性炭，其状态为超细粉末，材质为竹炭；
该配方能够促进植物产生的根与植物体结构相连，避免从愈伤组织上产生假性根，且生长出的根粗壮、无侧根，能够在移栽时降低损伤、快速成活。
实施例2：与实施例1的不同之处在于：本实施例中的消毒方法包括如下步骤：
采用双氧水或次氯酸钠消毒，消毒条件为：双氧水浓度为5%～10%，本实施例中的浓度采用5%；消毒时间为10～30分钟，本实施例中采用15分钟；次氯酸钠重量浓度为2%～15%，本实施例中采用5%，消毒时间为5～30分钟，本实施例中采用15分钟；再用无菌滤纸上吸干表面明水。
上述的实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (6)
1.一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：步骤为：筛选、剪取外植体，对外植体进行表面消毒，接种到启动培养基中进行启动培养，转接到增殖培养基中进行腋芽增殖培养，对增殖腋芽进行分割并转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，将经过壮苗培养的无根组培苗接种到生根培养基中进行生根培养，所剪取的外植体保留有外植体的高增殖能力；
筛选、剪取外植体包括如下步骤：
S1：选取外植体并对外植体消毒，所需的苗木个体为生长年限为3～4年之间的健壮苗木个体，该苗木无病虫害、无机械损伤、无叶片畸形；
S2：选取苗木个体于春季自然萌发的嫩梢，所述嫩梢中木质素低于20％，所述嫩梢中的导管分子处于发育初期，为活细胞状态；
S3：所选取的嫩梢长度在5cm至10cm之间；
S4：所述嫩梢生长于靠近苗木个体主干处的叶片呈螺旋状排列的枝条上；
将消毒后的外植体置于启动培养基中启动培养，启动培养包括如下步骤：
S1：将消毒后的外植体上部分叶片切除，切除部分为叶片总量的2/3；
S2:将除叶后的外植体切成段状，每一段的长度限制在1cm～2cm；
S3：将切段后的外植体置于启动培养基中，并置于22～25℃室温下培养；
S4：培养室中设置光照条件，光照强度范围为1500lux～2500lux；
S5：培养室中设置光照条件，光照周期为16小时光照，8小时暗培养；
S6：外植体在恒温培养室中启动培养4周～8周，腋芽萌发，
所述启动培养基的成分配比如下：
所述启动培养基的pH值为5.50～6.00；
所述增殖培养基的成分配比如下：
所述增殖培养基的pH值为5.50～6.00；
所述壮苗培养基的成分配比如下：
所述壮苗培养基的pH值为5.50～6.00；
所述生根培养基的成分配比如下：
所述生根培养基的pH值为5.50～6.00。
2.根据权利要求1所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：增殖培养包括如下步骤：
S1：将腋芽接种至增殖培养基中，并置于22～25℃室温下培养；
S2：将接种至增殖培养基中的腋芽置于黑暗条件下进行暗培养40h～60h，然后再给予光照；
S3：对暗培养后的腋芽给光，光强范围为1500～3000lux，光照周期为光照16小时，暗培养8小时；
S4：将腋芽增殖培养4周～8周，获得团芽；
S5：每4～8周将增殖得到的团芽分割为单个芽；
S6：将分割得到的单个芽重新接种于增殖培养基中。
3.根据权利要求1所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：壮苗培养包括如下步骤：
S1：将增殖培养所得的团芽分割后转移至壮苗培养基中；
S2：对分割后的团芽提供光照，光强范围为2000lux～3000lux，光照周期为光照16小时，暗培养8小时；
S3：将分割后的团芽置于10℃～30℃的环境中；
S4：将分割后的团芽培养5周～7周，得到生长高度为3cm的无根组培苗。
4.根据权利要求1所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：生根培养包括如下步骤：
S1：选取茎段高度为2cm～4cm的无根组培苗，切取茎段底部0.3cm～0.5cm的茎段，竖直插入生根培养基；
S2：对茎段提供光照，光强范围为2000lux～3000lux，光照周期为光照16小时，暗培养8小时；
S3：将茎段置于10～20℃的环境中；
S4：将茎段置于生根培养基中培养2周～6周；
S5：将茎段所处的环境替换为：20℃～30℃的环境，培养4周～8周，部分茎段获得生根培养组培苗。
5.根据权利要求1至4任一项所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：
消毒处理包括如下步骤：
S1：采用酒精棉擦拭外植体表面；
S2：剪取擦拭过的外植体，所述外植体带有叶片、嫩芽；
S3：将剪取的外植体置于流水下冲洗0.5h～1h；
S4：将冲洗后的外植体置于超净工作台中，采用医用酒精消毒10～60s；
S5：将采用酒精消毒后的外植体采用无菌水冲洗2～4遍；
S6：将冲洗后的外植体采用漂白水消毒30min～60min，所述漂白水由一份体积的商品漂白水添加四份体积的无菌水勾兑配制而成；
S7：将漂白水消毒后的外植体采用无菌水冲洗3～4次。
6.根据权利要求1至4任一项所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：
消毒处理包括如下步骤：
S1：调制消毒液体，所述消毒液体设置为含有5％～10％浓度双氧水的无菌水；
S2：将外植体置于消毒液体中消毒10min～30min；
S3：采用无菌滤纸吸干外植体表面明水。
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Citations (3)
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