CN108703073A - 南方红豆杉组织培养育苗方法 - Google Patents

南方红豆杉组织培养育苗方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种南方红豆杉组织培养育苗方法，其特征是，包括以下步骤：（1）外植体消毒；（2）愈伤组织诱导；（3）不定芽诱导；（4）当不定芽生长约2‑3cm高时，转入不定根诱导阶段，不定根诱导培养基为1/2MS培养基中加入浓度0.9‑0.95mg/L的NAA、0.1‑0.3mg/L的NAA、1‑2g/L的KH2PO4、50‑80mg/L肌醇和0.5‑1.0mg/L硫酸锌，最后加入浓度0.25‑0.3%的蔗糖和浓度0.5‑0.6%的琼脂；（5）将经不定根诱导后不定根长度达2‑4cm，试管苗高度达4‑6cm的幼苗转入壮苗培养基进行壮苗培养，壮苗培养基为MS培养基中加入浓度0.9‑0.95mg/L的NAA、0.1‑0.3mg/L的NAA、1‑2g/L的KH2PO4、0.2‑0.3mg/L的6‑BA和50‑80mg/L的谷氨酰胺，再加入浓度0.25‑0.3%的蔗糖和浓度0.5‑0.6%的琼脂；（6）幼苗驯化；（7）移栽。本发明所述南方红豆杉组织培养育苗方法，能够提高组培过程中生根培养的生根率，提高繁殖效率。

Description

南方红豆杉组织培养育苗方法
技术领域
本发明涉及一种南方红豆杉组织培养育苗方法，属于植物培养技术领域。
背景技术
红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物，红豆杉植物常规的繁殖方式主要为扦插和播种两种繁殖方式。但红豆杉种子种皮厚，处于深休眠状态，自然状态下经两冬一夏才能萌发，天然更新能力弱，使得播种繁殖的难度较大。扦插枝条也由于生根条件苛刻，造成生根率较低，扦插成活在率低。因此采用传统的繁殖方式难以满足红豆杉的规模化生产。
目前，公开号为CN1454465A的中国专利申请公开了一种红豆杉种苗组织培养基及其种苗繁育方法，它包括营业所剂、生长促进剂、稳定剂、微量元素配制而成。并将红豆杉母体树的嫩扦枝、或嫩枝（芽）叶经机械粉碎后的组织细胞浆加入上述培养基中进行组培。这种培养方法未经消毒，将嫩枝或嫩芽机械粉碎后，部分细胞被搅碎，未经消毒残留的细菌在恒温培养的过程中，以破碎细胞为母体增殖，对培养基造成污染。
公开号为CN107094625A的中国专利申请公开了一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，步骤为选取外植体，将外植体置于培养基之前，对外植体进行消毒处理；所选取的外植体中，导管尚未发育成熟，为活细胞，能够分裂增殖，其木薄臂组织对外植体难以起到阻碍分裂的作用。将外植体消毒能够有效去除外植体表面的细菌，减小细菌污染培养基的可能性；同时，不对外植体进行搅拌碎的操作，能够减少破碎细胞的数量，以便降低细菌污染外植体的可能性，在后期的培养中，细菌的数量少，难以对培养基中的外植体起到污染、损害的作用，以利于外植体正常增殖。但这种培养方法中生根培养过程获得的组培苗的生根率为50%，存在生根率较低的问题。这种情况有可能是因为消毒不够彻底或者生根培养的条件或培养基造成的，因而有必要进一步改进红豆杉组培种苗过程中的消毒、生根培养过程。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种南方红豆杉组织培养育苗方法，能够提高组培过程中生根培养的生根率，提高繁殖效率。
按照本发明提供的技术方案，所述南方红豆杉组织培养育苗方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）外植体准备：选择树龄5-10年的南方红豆杉作为母树，从母株上剪取当年生细嫩枝条作为外植体，将枝条切成0.5-0.7cm长的小段；
（2）外植体处理：将外植体在超净工作台上用70-75%酒精消毒40-50s，倒去酒精，用无菌水冲洗干净，再用0.1%的HgCl2溶液并滴入两滴吐温80消毒12-15min，消毒后用无菌水冲洗5-6次；
（3）愈伤组织诱导：将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基的配方如下：在基本培养基MS中加入0.5-0.55mg/L生长激素6-BA和0.9-1mg/L 2，4-D，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂；接种后暗培养2-3天后转入光培养，培养温度25-27℃，光照强度1600lx-1800lx，光照时间12-13h/d；根据愈伤组织的诱导情况及时进行继代培养；
（4）不定芽诱导：当愈伤组织继代6-7次时，转入不定芽诱导阶段，不定芽诱导培养基为基本培养基MS中加入浓度0.09-0.095mg/L的细胞分裂素ZT和1-3mg/L 2IP，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%；
（5）不定根诱导：当不定芽生长约2-3cm高时，转入不定根诱导阶段，不定根诱导培养基为1/2MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、50-80mg/L肌醇和0.5-1.0mg/L硫酸锌，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（6）壮苗培养：将经步骤（5）不定根诱导后不定根长度达2-4cm，试管苗高度达4-6cm的幼苗转入壮苗培养基进行壮苗培养，壮苗培养基为MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、0.2-0.3mg/L的6-BA和50-80mg/L的谷氨酰胺，再加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（7）幼苗驯化：当不定根长度达5-6cm，试管苗6-7cm高时，开始驯化；打开试管盖，在室内培养架上摆放2-3天后，将根基部的培养基清洗干净，并用1000倍多菌灵浸泡5-10min后流水冲洗，不要弄伤幼嫩的不定根；
（8）移栽：将驯化后的小苗移栽入基质，移栽后保持苗床温度25-28℃，光照强度6000-8000lx，相对湿度80%-90%。
进一步的，所述步骤（8）移栽基质的配方为河砂、泥炭、珍珠岩和锯木屑，比例为8:2:1:1，保证种植基质的pH值为6-6.5，均匀混合后经阳光曝晒3-5天；放入移栽苗床，厚度20-25cm；将驯化后的小苗移栽入基质前用浓度0.5%的高锰酸钾消毒基质。
进一步的，所述步骤（8）移栽后的前30天，幼苗未长出新根前，不进行施肥，保持相对湿度为80-90%；当试管苗移栽60-70天后，高度约8-9cm时，每隔一周使用全价叶面肥补充养份一次。
本发明所述南方红豆杉组织培养育苗方法，能够提高组培过程中生根培养的生根率，提高繁殖效率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一：一种南方红豆杉组织培养育苗方法，包括以下步骤：
（1）外植体准备：选择树龄5-10年的南方红豆杉作为母树，从母株上剪取当年生细嫩枝条作为外植体，将枝条切成0.5-0.7cm长的小段；
（2）外植体处理：将外植体在超净工作台上用70-75%酒精消毒40-50s，倒去酒精，用无菌水冲洗干净，再用0.1%的HgCl2溶液并滴入两滴吐温80消毒12-15min，消毒后用无菌水冲洗5-6次；
（3）愈伤组织诱导：将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基的配方如下：在基本培养基MS中加入0.5-0.55mg/L生长激素6-BA和0.9-1mg/L 2，4-D，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂；接种后暗培养2-3天后转入光培养，培养温度25-27℃，光照强度1600lx-1800lx，光照时间12-13h/d；根据愈伤组织的诱导情况及时进行继代培养；
（4）不定芽诱导：当愈伤组织继代6-7次时，转入不定芽诱导阶段，不定芽诱导培养基为基本培养基MS中加入浓度0.09-0.095mg/L的细胞分裂素ZT和1-3mg/L 2IP，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%；
（5）不定根诱导：当不定芽生长约2-3cm高时，转入不定根诱导阶段，不定根诱导培养基为1/2MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、50-80mg/L肌醇和0.5-1.0mg/L硫酸锌，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（6）壮苗培养：将经步骤（5）不定根诱导后不定根长度达2-4cm，试管苗高度达4-6cm的幼苗转入壮苗培养基进行壮苗培养，壮苗培养基为MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、0.2-0.3mg/L的6-BA和50-80mg/L的谷氨酰胺，再加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（7）幼苗驯化：当不定根长度达5-6cm，试管苗6-7cm高时，开始驯化；打开试管盖，在室内培养架上摆放2-3天后，将根基部的培养基清洗干净，并用1000倍多菌灵浸泡5-10min后流水冲洗，不要弄伤幼嫩的不定根；
（8）移栽：准备好移栽基质，基质配方为河砂、泥炭、珍珠岩和锯木屑，比例为8:2:1:1，保证种植基质的pH值为6-6.5，均匀混合后经阳光曝晒3-5天；放入移栽苗床，厚度20-25cm；将驯化后的小苗移栽入基质，移栽之前用浓度0.5%的高锰酸钾消毒基质，移栽后保持苗床温度25-28℃，光照强度6000-8000lx，相对湿度80%-90%；
（9）移栽后管理：
移栽后的前30天，幼苗未长出新根前，不可施肥，需保持较高的湿度（相对湿度80-90%）；当试管苗移栽60-70天后，高度约8-9cm时，每隔一周使用全价叶面肥补充养份一次。
本发明中，红豆杉外植体在培养之前经过消毒，能够避免消毒不彻底造成的细菌污染；另外，本发明中采用的不定根诱导培养在能够促进组培苗的生根，在不定根长度达2-4cm，试管苗高度达4-6cm后转至壮苗培养基，进一步保证不定根的生长，采用这种方式能够有效提高组培苗的生根率（一般可达60-80%），保证得到的组培苗生根较为强壮，提高幼苗的成活率。
实施例二：一种南方红豆杉组织培养育苗方法，包括以下步骤：
（1）外植体准备：选择树龄5-10年的南方红豆杉作为母树，从母株上剪取当年生细嫩枝条作为外植体，将枝条切成0.5-0.7cm长的小段；
（2）外植体处理：将外植体在超净工作台上用70-75%酒精消毒40-50s，倒去酒精，用无菌水冲洗干净，再用0.1%的HgCl2溶液并滴入两滴吐温80消毒12-15min，消毒后用无菌水冲洗5-6次；
（3）愈伤组织诱导：将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基的配方如下：在基本培养基MS中加入0.5-0.55mg/L生长激素6-BA和0.9-1mg/L 2，4-D，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂；接种后暗培养2-3天后转入光培养，培养温度25-27℃，光照强度1600lx-1800lx，光照时间12-13h/d；根据愈伤组织的诱导情况及时进行继代培养；
（4）不定芽诱导：当愈伤组织继代6-7次时，转入不定芽诱导阶段，不定芽诱导培养基为基本培养基MS中加入浓度0.09-0.095mg/L的细胞分裂素ZT和1-3mg/L 2IP，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%；
（5）不定根诱导：当不定芽生长约2-3cm高时，转入不定根诱导阶段，不定根诱导培养基为1/2MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、50-80mg/L肌醇和0.5-1.0mg/L硫酸锌，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（6）壮苗培养：将经步骤（5）不定根诱导后不定根长度达2-4cm，试管苗高度达4-6cm的幼苗转入壮苗培养基进行壮苗培养，壮苗培养基为MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、0.2-0.3mg/L的6-BA和50-80mg/L的谷氨酰胺，再加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（7）幼苗驯化：当不定根长度达5-6cm，试管苗6-7cm高时，开始驯化；打开试管盖，在室内培养架上摆放2-3天后，将根基部的培养基清洗干净，并用1000倍多菌灵浸泡5-10min后流水冲洗，不要弄伤幼嫩的不定根；
（8）移栽：准备好移栽基质，基质配方为河砂、泥炭、珍珠岩和锯木屑，比例为8:2:1:1，保证种植基质的pH值为6-6.5，均匀混合后经阳光曝晒3-5天；放入移栽苗床，厚度20-25cm；将驯化后的小苗移栽入基质，移栽之前用浓度0.5%的高锰酸钾消毒基质，移栽后保持苗床温度25-28℃，光照强度6000-8000lx，相对湿度80%-90%；
（9）移栽后管理：
移栽后的前30天，幼苗未长出新根前，不可施肥，需保持较高的湿度（相对湿度80-90%）；当试管苗移栽60-70天后，高度约8-9cm时，每隔一周使用全价叶面肥补充养份一次。
实施例三：一种南方红豆杉组织培养育苗方法，包括以下步骤：
（1）外植体准备：选择树龄5-10年的南方红豆杉作为母树，从母株上剪取当年生细嫩枝条作为外植体，将枝条切成0.5-0.7cm长的小段；
（2）外植体处理：将外植体在超净工作台上用70-75%酒精消毒40-50s，倒去酒精，用无菌水冲洗干净，再用0.1%的HgCl2溶液并滴入两滴吐温80消毒12-15min，消毒后用无菌水冲洗5-6次；
（3）愈伤组织诱导：将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基的配方如下：在基本培养基MS中加入0.5-0.55mg/L生长激素6-BA和0.9-1mg/L 2，4-D，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂；接种后暗培养2-3天后转入光培养，培养温度25-27℃，光照强度1600lx-1800lx，光照时间12-13h/d；根据愈伤组织的诱导情况及时进行继代培养；
（4）不定芽诱导：当愈伤组织继代6-7次时，转入不定芽诱导阶段，不定芽诱导培养基为基本培养基MS中加入浓度0.09-0.095mg/L的细胞分裂素ZT和1-3mg/L 2IP，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%；
（5）不定根诱导：当不定芽生长约2-3cm高时，转入不定根诱导阶段，不定根诱导培养基为1/2MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、50-80mg/L肌醇和0.5-1.0mg/L硫酸锌，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（6）壮苗培养：将经步骤（5）不定根诱导后不定根长度达2-4cm，试管苗高度达4-6cm的幼苗转入壮苗培养基进行壮苗培养，壮苗培养基为MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、0.2-0.3mg/L的6-BA和50-80mg/L的谷氨酰胺，再加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（7）幼苗驯化：当不定根长度达5-6cm，试管苗6-7cm高时，开始驯化；打开试管盖，在室内培养架上摆放2-3天后，将根基部的培养基清洗干净，并用1000倍多菌灵浸泡5-10min后流水冲洗，不要弄伤幼嫩的不定根；
（8）移栽：准备好移栽基质，基质配方为河砂、泥炭、珍珠岩和锯木屑，比例为8:2:1:1，保证种植基质的pH值为6-6.5，均匀混合后经阳光曝晒3-5天；放入移栽苗床，厚度20-25cm；将驯化后的小苗移栽入基质，移栽之前用浓度0.5%的高锰酸钾消毒基质，移栽后保持苗床温度25-28℃，光照强度6000-8000lx，相对湿度80%-90%；
（9）移栽后管理：
移栽后的前30天，幼苗未长出新根前，不可施肥，需保持较高的湿度（相对湿度80-90%）；当试管苗移栽60-70天后，高度约8-9cm时，每隔一周使用全价叶面肥补充养份一次。

Claims (3)

1.一种南方红豆杉组织培养育苗方法，其特征是，包括以下步骤：
（1）外植体准备：选择树龄5-10年的南方红豆杉作为母树，从母株上剪取当年生细嫩枝条作为外植体，将枝条切成0.5-0.7cm长的小段；
（2）外植体处理：将外植体在超净工作台上用70-75%酒精消毒40-50s，倒去酒精，用无菌水冲洗干净，再用0.1%的HgCl2溶液并滴入两滴吐温80消毒12-15min，消毒后用无菌水冲洗5-6次；
（3）愈伤组织诱导：将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基的配方如下：在基本培养基MS中加入0.5-0.55mg/L生长激素6-BA和0.9-1mg/L 2，4-D，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂；接种后暗培养2-3天后转入光培养，培养温度25-27℃，光照强度1600lx-1800lx，光照时间12-13h/d；根据愈伤组织的诱导情况及时进行继代培养；
（4）不定芽诱导：当愈伤组织继代6-7次时，转入不定芽诱导阶段，不定芽诱导培养基为基本培养基MS中加入浓度0.09-0.095mg/L的细胞分裂素ZT和1-3mg/L 2IP，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%；
（5）不定根诱导：当不定芽生长约2-3cm高时，转入不定根诱导阶段，不定根诱导培养基为1/2MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、50-80mg/L肌醇和0.5-1.0mg/L硫酸锌，最后加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（6）壮苗培养：将经步骤（5）不定根诱导后不定根长度达2-4cm，试管苗高度达4-6cm的幼苗转入壮苗培养基进行壮苗培养，壮苗培养基为MS培养基中加入浓度0.9-0.95mg/L的NAA、0.1-0.3mg/L的NAA、1-2g/L的KH2PO4、0.2-0.3mg/L的6-BA和50-80mg/L的谷氨酰胺，再加入浓度0.25-0.3%的蔗糖和浓度0.5-0.6%的琼脂，并调节pH值至5.6-6.0；
（7）幼苗驯化：当不定根长度达5-6cm，试管苗6-7cm高时，开始驯化；打开试管盖，在室内培养架上摆放2-3天后，将根基部的培养基清洗干净，并用1000倍多菌灵浸泡5-10min后流水冲洗，不要弄伤幼嫩的不定根；
（8）移栽：将驯化后的小苗移栽入基质，移栽后保持苗床温度25-28℃，光照强度6000-8000lx，相对湿度80%-90%。
2.如权利要求1所述的南方红豆杉组织培养育苗方法，其特征是：所述步骤（8）移栽基质的配方为河砂、泥炭、珍珠岩和锯木屑，比例为8:2:1:1，保证种植基质的pH值为6-6.5，均匀混合后经阳光曝晒3-5天；放入移栽苗床，厚度20-25cm；将驯化后的小苗移栽入基质前用浓度0.5%的高锰酸钾消毒基质。
3.如权利要求1所述的南方红豆杉组织培养育苗方法，其特征是：所述步骤（8）移栽后的前30天，幼苗未长出新根前，不进行施肥，保持相对湿度为80-90%；当试管苗移栽60-70天后，高度约8-9cm时，每隔一周使用全价叶面肥补充养份一次。
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