CN107372117A - 南方红豆杉愈伤组织诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种南方红豆杉愈伤组织诱导方法，其特征是：包括以下步骤：（1）选择当年生南方红豆杉嫩枝；（2）愈伤组织诱导用培养基的基本成分采用B5培养基的微量元素、有机物和铁盐，每升愈伤组织诱导用培养基中加入蔗糖25～30g、植物凝胶2～2.5g、生长素NAA 1mg、2,4‑D 1mg、细胞分裂素KT 0.1mg，酸碱度调节至5.6～5.8；（3）对南方红豆杉嫩枝进行消毒处理；（4）将南方红豆杉嫩枝切成小段，并切取部分针叶，嫩枝切段用作外植体，接种在愈伤组织诱导用培养基上；（5）将接种好的愈伤组织诱导用培养基放置于培养室中培养。本发明能够快速繁育大量的愈伤组织，为南方红豆杉育苗提供充足的资源，有效解决紫杉醇生产药源的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种南方红豆杉愈伤组织诱导方法，属于植物种植技术领域。
背景技术
红豆杉属于裸子植物，主要分布于我国的云南、四川、西藏和东北，是一类具有重要开发价值的树木，它产生的紫杉醇通过临床实验被认为是广谱的抗癌药物。自然状态下，紫杉醇的含量极低，仅占树皮干重的十万分之一，靠自然资源解决这一问题十分困难。近年来，通过人们的不断努力，筛选出了一批含量较高的单株，虽然可以通过播种育苗和扦插繁殖进行规模生产，但短期内无法获得足够的种子和枝条，因此利用植物组织培养的多次继代性，可以在短时间内获得生产所需要的植物原料，有效解决紫杉醇生产药源的问题。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种南方红豆杉愈伤组织诱导方法，能够快速繁育大量的愈伤组织，为南方红豆杉育苗提供充足的资源，有效解决紫杉醇生产药源的问题。
按照本发明提供的技术方案，所述南方红豆杉愈伤组织诱导方法，其特征是：，包括以下步骤：
（1）材料选择：选择当年生的南方红豆杉嫩枝；
（2）愈伤组织诱导用培养基：
愈伤组织诱导用培养基的基本成分采用B5培养基的微量元素、有机物和铁盐，每升愈伤组织诱导用培养基中加入蔗糖25～30g、植物凝胶2～2.5g、生长素NAA 1mg、2,4-D 1mg、细胞分裂素KT 0.1mg，酸碱度调节至5.6～5.8，配置好的培养基用培养瓶分装，经高温、高压灭菌后备用；
（3）材料消毒：对步骤（1）所述的南方红豆杉嫩枝进行消毒处理；
（4）接种：
将南方红豆杉嫩枝取出，用无菌滤纸吸去南方红豆杉嫩枝表面的水分，将南方红豆杉嫩枝切成小段，并切取部分针叶，嫩枝切段用作外植体，接种在愈伤组织诱导用培养基上，接种时要让嫩枝的植物学近地端接触培养基；
（5）愈伤组织诱导：
将步骤（4）中接种好的愈伤组织诱导用培养基放置于培养室中培养，温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间10～12h/d；红豆杉嫩枝和针叶在培养基上2-3周后即开始形成愈伤组织，约4-5周愈伤组织直径可达1-2cm。
进一步的，所述步骤（1）中南方红豆杉嫩枝的取材时间为每年的7-8月。
进一步的，所述步骤（3）中材料消毒的具体过程为：将南方红豆杉嫩枝放入加有含有洗洁精的自来水中浸泡10～15分钟，洗洁精的重量百分浓度为0.01～0.02%，浸泡过程中保持搅动，浸泡结束后用自来水冲洗10分钟以上；再将南方红豆杉嫩枝转入一干净的容器中，随后转入超净工作台上进行无菌操作；首先往容器中加入浓度为70～75%的酒精，加入量为嫩枝体积的10倍以上，浸泡杀菌30～60秒，倒掉酒精，用无菌蒸馏水漂洗一次；再将南方红豆杉嫩枝转入已高压消毒的容器中，加入嫩枝体积10～15倍的升汞溶液，升汞溶液的浓度为0.1～0.15%，浸泡杀菌5～8分钟，浸泡过程中保持摇动，以使升汞溶液与南方红豆杉嫩枝充分接触；倒掉升汞溶液，用无菌蒸馏水冲洗4～6次，每次1～2分钟，以彻底除去升汞。
进一步的，所述步骤（4）中，南方红豆杉嫩枝切成0.5～0.8cm的小段。
本发明所述的南方红豆杉愈伤组织诱导方法，采用的愈伤组织诱导用培养基中添加的成分能够快速繁育大量的愈伤组织，4-5周后愈伤组织诱导率即达到90%以上，从而为南方红豆杉育苗提供充足的资源，有效解决紫杉醇生产药源的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例一：一种南方红豆杉愈伤组织诱导方法，包括以下步骤：
（1）材料选择：
较为适宜的组培外植体为当年生的南方红豆杉嫩枝，取材时间为每年的7-8月；
（2）愈伤组织诱导用培养基：
愈伤组织诱导用培养基的基本成分采用B5培养基的微量元素、有机物和铁盐，每升愈伤组织诱导用培养基中加入蔗糖25g、植物凝胶2g、生长素NAA 1mg、2,4-D 1mg、细胞分裂素KT 0.1mg，酸碱度调节至5.6，配置好的培养基用培养瓶分装，经高温、高压灭菌后备用；
（3）材料消毒：
取步骤（1）中所述的南方红豆杉嫩枝放入加有含有洗洁精的自来水中浸泡10分钟，洗洁精的重量百分浓度为0.01%，浸泡过程中需经常搅动，浸泡结束后用自来水冲洗10分钟以上；再将南方红豆杉嫩枝转入一干净的三角瓶中，随后转入超净工作台上进行无菌操作；首先往三角瓶中加入浓度为70%的酒精，加入量应为嫩枝体积的10倍以上，浸泡杀菌30秒，倒掉酒精，用无菌蒸馏水漂洗一次；再将南方红豆杉嫩枝转入事先已高压消毒的三角瓶中，加入嫩枝体积10倍的升汞溶液，升汞溶液的浓度为0.1%，浸泡杀菌5分钟，浸泡过程中要不断摇动，以使升汞溶液与南方红豆杉嫩枝充分接触；倒掉升汞溶液，用无菌蒸馏水冲洗4次，每次1分钟，以彻底除去升汞；
（4）接种：
将南方红豆杉嫩枝从三角瓶中分批取出，用无菌滤纸吸去南方红豆杉嫩枝表面的水分，将南方红豆杉嫩枝切成0.5cm的小段，并切取部分针叶，嫩枝切段用作外植体，接种在愈伤组织诱导用培养基上，接种时要让嫩枝的植物学近地端接触培养基；
（5）愈伤组织诱导：
将步骤（4）中接种好的愈伤组织诱导用培养基放置于培养室中培养，温度25±2℃，光照强度1500lx，光照时间10h/d；红豆杉嫩枝和针叶在培养基上2周后即开始形成愈伤组织，约4周愈伤组织直径可达1-2cm，愈伤组织诱导率达到90%以上。愈伤组织开始时为灰白色，随着愈伤组织的增大，先期形成的愈伤组织颜色由灰白色变为棕色，这可能预示着愈伤组织在逐渐发生褐变，因此要及时给予注意，保持较低的培养温度和经常更换培养基。
实施例二：一种南方红豆杉愈伤组织诱导方法，包括以下步骤：
（1）材料选择：
较为适宜的组培外植体为当年生的南方红豆杉嫩枝，取材时间为每年的7-8月；
（2）愈伤组织诱导用培养基：
愈伤组织诱导用培养基的基本成分采用B5培养基的微量元素、有机物和铁盐，每升愈伤组织诱导用培养基中加入蔗糖30g、植物凝胶2.5g、生长素NAA 1mg、2,4-D 1mg、细胞分裂素KT 0.1mg，酸碱度调节至5.8，配置好的培养基用培养瓶分装，经高温、高压灭菌后备用；
（3）材料消毒：
取步骤（1）中所述的南方红豆杉嫩枝放入加有含有洗洁精的自来水中浸泡15分钟，洗洁精的重量百分浓度为0.02%，浸泡过程中需经常搅动，浸泡结束后用自来水冲洗10分钟以上；再将南方红豆杉嫩枝转入一干净的三角瓶中，随后转入超净工作台上进行无菌操作；首先往三角瓶中加入浓度为75%的酒精，加入量应为嫩枝体积的10倍以上，浸泡杀菌60秒，倒掉酒精，用无菌蒸馏水漂洗一次；再将南方红豆杉嫩枝转入事先已高压消毒的三角瓶中，加入嫩枝体积15倍的升汞溶液，升汞溶液的浓度为0.15%，浸泡杀菌8分钟，浸泡过程中要不断摇动，以使升汞溶液与南方红豆杉嫩枝充分接触；倒掉升汞溶液，用无菌蒸馏水冲洗6次，每次2分钟，以彻底除去升汞；
（4）接种：
将南方红豆杉嫩枝从三角瓶中分批取出，用无菌滤纸吸去南方红豆杉嫩枝表面的水分，将南方红豆杉嫩枝切成0.8cm的小段，并切取部分针叶，嫩枝切段用作外植体，接种在愈伤组织诱导用培养基上，接种时要让嫩枝的植物学近地端接触培养基；
（5）愈伤组织诱导：
将步骤（4）中接种好的愈伤组织诱导用培养基放置于培养室中培养，温度25±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d；红豆杉嫩枝和针叶在培养基上3周后即开始形成愈伤组织，约5周愈伤组织直径可达2cm，愈伤组织诱导率达到90%以上。愈伤组织开始时为灰白色，随着愈伤组织的增大，先期形成的愈伤组织颜色由灰白色变为棕色，这可能预示着愈伤组织在逐渐发生褐变，因此要及时给予注意，保持较低的培养温度和经常更换培养基。
实施例三：一种南方红豆杉愈伤组织诱导方法，包括以下步骤：
（1）材料选择：
较为适宜的组培外植体为当年生的南方红豆杉嫩枝，取材时间为每年的7-8月；
（2）愈伤组织诱导用培养基：
愈伤组织诱导用培养基的基本成分采用B5培养基的微量元素、有机物和铁盐，每升愈伤组织诱导用培养基中加入蔗糖26g、植物凝胶2.2g、生长素NAA 1mg、2,4-D 1mg、细胞分裂素KT 0.1mg，酸碱度调节至5.7，配置好的培养基用培养瓶分装，经高温、高压灭菌后备用；
（3）材料消毒：
取步骤（1）中所述的南方红豆杉嫩枝放入加有含有洗洁精的自来水中浸泡12分钟，洗洁精的重量百分浓度为0.01%，浸泡过程中需经常搅动，浸泡结束后用自来水冲洗10分钟以上；再将南方红豆杉嫩枝转入一干净的三角瓶中，随后转入超净工作台上进行无菌操作；首先往三角瓶中加入浓度为70%的酒精，加入量应为嫩枝体积的10倍以上，浸泡杀菌45秒，倒掉酒精，用无菌蒸馏水漂洗一次；再将南方红豆杉嫩枝转入事先已高压消毒的三角瓶中，加入嫩枝体积12倍的升汞溶液，升汞溶液的浓度为0.12%，浸泡杀菌6分钟，浸泡过程中要不断摇动，以使升汞溶液与南方红豆杉嫩枝充分接触；倒掉升汞溶液，用无菌蒸馏水冲洗5次，每次1.5分钟，以彻底除去升汞；
（4）接种：
将南方红豆杉嫩枝从三角瓶中分批取出，用无菌滤纸吸去南方红豆杉嫩枝表面的水分，将南方红豆杉嫩枝切成0.6cm的小段，并切取部分针叶，嫩枝切段用作外植体，接种在愈伤组织诱导用培养基上，接种时要让嫩枝的植物学近地端接触培养基；
（5）愈伤组织诱导：
将步骤（4）中接种好的愈伤组织诱导用培养基放置于培养室中培养，温度25±2℃，光照强度1600lx，光照时间10h/d；红豆杉嫩枝和针叶在培养基上2.5周后即开始形成愈伤组织，约4周愈伤组织直径可达1-2cm，愈伤组织诱导率达到90%以上。愈伤组织开始时为灰白色，随着愈伤组织的增大，先期形成的愈伤组织颜色由灰白色变为棕色，这可能预示着愈伤组织在逐渐发生褐变，因此要及时给予注意，保持较低的培养温度和经常更换培养基。
Claims (4)
1.一种南方红豆杉愈伤组织诱导方法，其特征是：，包括以下步骤：
（1）材料选择：选择当年生的南方红豆杉嫩枝；
（2）愈伤组织诱导用培养基：
愈伤组织诱导用培养基的基本成分采用B5培养基的微量元素、有机物和铁盐，每升愈伤组织诱导用培养基中加入蔗糖25～30g、植物凝胶2～2.5g、生长素NAA 1mg、2,4-D 1mg、细胞分裂素KT 0.1mg，酸碱度调节至5.6～5.8，配置好的培养基用培养瓶分装，经高温、高压灭菌后备用；
（3）材料消毒：对步骤（1）所述的南方红豆杉嫩枝进行消毒处理；
（4）接种：
将南方红豆杉嫩枝取出，用无菌滤纸吸去南方红豆杉嫩枝表面的水分，将南方红豆杉嫩枝切成小段，并切取部分针叶，嫩枝切段用作外植体，接种在愈伤组织诱导用培养基上，接种时要让嫩枝的植物学近地端接触培养基；
（5）愈伤组织诱导：
将步骤（4）中接种好的愈伤组织诱导用培养基放置于培养室中培养，温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照时间10～12h/d；红豆杉嫩枝和针叶在培养基上2-3周后即开始形成愈伤组织，约4-5周愈伤组织直径可达1-2cm。
2.如权利要求1所述的南方红豆杉愈伤组织诱导方法，其特征是：所述步骤（1）中南方红豆杉嫩枝的取材时间为每年的7-8月。
3.如权利要求1所述的南方红豆杉愈伤组织诱导方法，其特征是：所述步骤（3）中材料消毒的具体过程为：将南方红豆杉嫩枝放入加有含有洗洁精的自来水中浸泡10～15分钟，洗洁精的重量百分浓度为0.01～0.02%，浸泡过程中保持搅动，浸泡结束后用自来水冲洗10分钟以上；再将南方红豆杉嫩枝转入一干净的容器中，随后转入超净工作台上进行无菌操作；首先往容器中加入浓度为70～75%的酒精，加入量为嫩枝体积的10倍以上，浸泡杀菌30～60秒，倒掉酒精，用无菌蒸馏水漂洗一次；再将南方红豆杉嫩枝转入已高压消毒的容器中，加入嫩枝体积10～15倍的升汞溶液，升汞溶液的浓度为0.1～0.15%，浸泡杀菌5～8分钟，浸泡过程中保持摇动，以使升汞溶液与南方红豆杉嫩枝充分接触；倒掉升汞溶液，用无菌蒸馏水冲洗4～6次，每次1～2分钟，以彻底除去升汞。
4.如权利要求1所述的南方红豆杉愈伤组织诱导方法，其特征是：所述步骤（4）中，南方红豆杉嫩枝切成0.5～0.8cm的小段。
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Cited By (2)
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| CN108703073A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-10-26 | 江苏红豆杉健康科技股份有限公司 | 南方红豆杉组织培养育苗方法 |
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| 姚晓等: "南方红豆杉愈伤组织培养及其紫杉烷二萜类成分的分析", 《中草药》 * |
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