CN114521489B - 一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法，采用秋水仙素溶液处理柳树扦插苗，通过变温诱导的方式，使其产生多倍体，以培育具有优良性状的柳树，实现基因型改良；本发明通过用秋水仙素溶液处理柳树扦插苗，通过变温诱导的方式，使其产生多倍体，多倍体的柳树具体表现为器官变大、品质优良、生长旺盛、抗逆性强等；因此相对于二倍体柳树来说，具有更高的经济、生态和社会价值，开发潜力巨大。

Description

一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法

技术领域

本发明涉及染色体加倍技术领域，具体为一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法。

背景技术

柳树为杨柳科柳属和钻天柳属树种的统称，有灌木和乔木之分，种质资源丰富，全球有500种以上，仅我国就有257种，122变种，33变型。柳树是重要的园林观赏植物，许多品种具有适应性强、生长快、耐水湿、耐盐碱、耐污染、易成活、易繁殖等特点，同时对受污染土壤和水体有极强的修复功能，在建造生物燃料林、工业原料林、景观林、水源涵养林和水土保持林等方面都有广阔的应用前景。

柳树具有多种倍性，2、4、6、8、10、12倍体都有一定的分布，多倍体柳树表型许多性状会优于二倍体，具体表现为器官变大、品质优良、生长旺盛、抗逆性强等。因此较二倍体柳树有更高的经济、生态和社会价值，开发潜力巨大。由于柳树自然多倍体品种有限，柳树再生体系尚不成熟，通过人工诱导产生多倍体对培育具有优良性状的柳树意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法，采用秋水仙素溶液处理柳树扦插苗，通过变温诱导的方式，使其产生多倍体，以培育具有优良性状的柳树，实现树种改良；

具体步骤为：

（1）取样：取样时间为晚上7-8点，选择生长状态优良的二倍体柳树扦插苗，从主茎顶端剪取长度为2cm的嫩芽，并去除多余的叶片，在流水下冲洗5分钟；

（2）灭菌：将步骤（1）所得的嫩芽材料在超净工作台中先使用次氯酸钠溶液浸泡消毒20秒，再使用浓度为75%的酒精浸泡消毒20秒，消毒好的材料立即转移到无菌水中浸泡3分钟，如此反复浸泡清洗6次，并用无菌滤纸将表面的水吸干；

（3）加倍培养基培养：将步骤（2）中消毒好的柳树茎尖置于装有加倍培养基的锥形瓶中，茎尖浸没；；所采用的加倍培养基为现用现配，避免过长时间放置；

（4）变温诱导：将步骤（3）中装有培养基和柳树茎尖的锥形瓶用透气封口膜封好后放置4℃冰箱中低温避光静置培养4小时，随后立即转移到50-52℃的培养箱中高温避光静置培养2小时，最后将高温处理后的材料转移到25±2℃的摇床中以120rpm的转速避光培养24小时。

（5）培养：将步骤（4）中处理好的材料从加倍培养基中取出，放入无菌水中浸泡4分钟，如此反复浸泡清洗8次，用无菌滤纸吸干表面的水分，然后将茎尖的形态学下端竖直插入到装有增殖培养基的培养瓶中，插入深度为0.5-0.8cm，培养瓶用透明透气封口膜封住，即可进行培养，培养过程中培养瓶需要置于以下条件中进行培养：培养温度为25±2℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为16小时红光与白光，两者的光照比例为1:1，然后再是8小时黑暗。

（6）测定：培养20-25天后，剪取其新生叶，用流式细胞术进行染色体倍性的测定，测定过程以未加倍的材料的新叶作为对照，对照后发现，加倍后的新叶会出现两种情况，一种为二倍体和四倍体的嵌合体的材料，另一种为纯四倍体材料。

（7）纯化：将步骤（6）中测定结果为二倍体和四倍体的嵌合体的材料继续培养成植株，待其枝条直径达到5mm以上时，分别剪取不同部位枝条上的叶片上部进行倍性测定，当测定为四倍体时，取叶片下部，连同叶柄一起剪下，再进行扦插培养，即可获得纯四倍体植株。

优选的，所述步骤（2）中的次氯酸钠溶液中的氯含量为6-14%。

优选的，所述步骤（3）中的加倍培养基配方为：MS粉末4.8g，蔗糖30g，6-BA 1g，NAA5g，加超纯水定容至1L，配比后的溶液再进行高温灭菌，然后加入秋水仙素粉末2g，氨磷汀粉末10mg，充分溶解后避光静置。

优选的，所述步骤（5）中的增殖培养基包括以下成分：MS粉末4.8g，蔗糖30g，6-BA1g，NAA 5g，琼脂8g，加超纯水定容至1L，配比后的溶液再进行高温灭菌，冷却后备用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过用秋水仙素溶液处理柳树扦插苗，通过变温诱导的方式，使其产生多倍体，多倍体的柳树具体表现为器官变大、品质优良、生长旺盛、抗逆性强等；因此相对于二倍体柳树来说，具有更高的经济、生态和社会价值，开发潜力巨大。

附图说明

图1为本发明未加倍的二倍体杞柳对照；

图2为本发明加倍后二倍体和四倍体的嵌合体杞柳；

图3为本发明加倍后得到的四倍体杞柳；

图4为本发明对嵌合体纯化后得到的四倍体杞柳。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-4，本发明提供一种技术方案：一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法，其特征在于：采用秋水仙素溶液处理柳树扦插苗，通过变温诱导的方式，使其产生多倍体，以培育具有优良性状的柳树，实现树种改良；

具体步骤为：

（1）取样：取样时间为晚上7-8点，植物光合作用刚结束，有机物积累较多，此时选择生长状态优良的二倍体柳树扦插苗更有利于提高其成活率，从主茎顶端剪取长度为2cm的嫩芽，并去除多余的叶片，在流水下冲洗5分钟，水流冲洗不仅能够去除表面杂质，同时也能增加嫩芽的水份含量，使其保持活力，以确保取样样品的品质。

（2）灭菌：将步骤（1）中所得的嫩芽材料在超净工作台中先使用氯含量为6-14%的次氯酸钠溶液浸泡消毒20秒，再使用浓度为75%的酒精浸泡消毒20秒，消毒好的材料立即转移到无菌水中浸泡3分钟，如此反复浸泡清洗6次，然后将茎尖置于平铺的无菌滤纸上，用无菌滤纸覆盖轻柔反复多次擦拭，将茎尖表面的水吸干。

（3）加倍培养基培养：将步骤（2）中消毒好的柳树茎尖置于装入加倍培养基的锥形瓶中，茎尖浸没；

该加倍培养基配方为：MS粉末4.8g，蔗糖30g，6-BA 1g，NAA 5g，加超纯水定容至1L，将上述试剂称量好放入烧杯中，用超纯水溶解，磁力搅拌器搅拌均匀，用NaOH调PH至5.8，再定容到1L；

配比后的溶液在121℃条件下高温灭菌15-20min，待自然冷却至60℃以下，加入秋水仙素粉末2g，氨磷汀粉末10mg，然后轻轻摇晃后即可完全溶解，充分溶解后置于4℃避光静置保存，为了保持培养基中试剂活性，培养基应现用现配，避免过长时间放置。

（4）变温诱导：将步骤（3）中装有培养基和柳树茎尖的锥形瓶用透气封口膜封好后放置4℃冰箱中低温避光静置培养4小时，可有效促进茎尖的层积，提高诱导率，随后立即转移到50-52℃的培养箱中高温避光静置培养2小时，通过变温的方式（^△t≈50℃）可提高染色体加倍的诱导率，降低嵌合体的比例，最后将高温处理后的材料转移到25±2℃的摇床中以120rpm的转速避光培养24小时，使茎尖与培养基中的活性物质充分接触，大幅提高染色体加倍的诱导率；

不同变温处理方式下，染色体加倍的诱导率对比表格：

处理方式	总数量	嵌合体数量	嵌合体诱导率	四倍体数量	四倍体诱导率
						低温4h	96	0	0	0	0
高温2h	92	4	4.35%	3	3.26%
						秋水仙素24h	99	15	15.15%	5	5.05%
高温2h+秋水仙素24h	98	17	17.35%	7	7.14%
						低温4h+高温2h+秋水仙素24h	98	20	20.41%	10	10.2%

（5）培养：将步骤（4）中处理好的材料从加倍培养基中取出，放入无菌水中浸泡4分钟，如此反复浸泡清洗8次，然后将茎尖置于平铺的无菌滤纸上，用无菌滤纸覆盖轻柔反复多次擦拭，将茎尖表面的水吸干；然后将茎尖的形态学下端竖直插入到装有增殖培养基的培养瓶中，插入深度为0.5-0.8cm，培养瓶用透明透气封口膜封住，即可进行培养，培养过程中培养瓶需要置于以下条件中进行培养：培养温度为25±2℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为16小时红光与白光，两者的光照比例为1:1，采用白光和红光组合进行培养，其中红光可通过光敏色素调节顶端优势从而促进不定芽的生长，对增殖具有明显的促进作用，然后再是8小时黑暗；

其中，所述增殖培养基包括以下成分：MS粉末4.8g，蔗糖30g，6-BA 1g，NAA 5g，琼脂8g，加超纯水定容至1L，采用的6-BA是细胞分裂素，能够促进细胞分裂诱导植株形成新芽；NAA能够很好的促进植物发芽生根，配比后的溶液再进行高温灭菌，温度保持在121℃，灭菌时长在15-20min之间，冷却后备用。

（6）测定：培养20-25天后，剪取其新生叶，用流式细胞术进行染色体倍性的测定，具体测定方法如下：

a.样品采集及处理

取幼嫩的柳树无菌苗叶片约（3~4片），放入预冷的培养皿中，加入预冷的WPB裂解液700μl，用锋利刀片于冰上迅速将其剁碎；

b.细胞核悬浮液制备

向步骤a的培养皿中加入1400μl裂解液，反复吸打，避免产生气泡，以释放细胞核，用300目的尼龙网过滤到2ml离心管中，置4℃条件下孵育；

c.细胞核悬浮液染色

将步骤b获得的细胞核悬浮液置于4℃离心机中，以1000rpm/min的转速离心10min，弃上清，分别加PI染液（0.1mg/ml）和RNAseA（0.1mg/ml）各200μl，4℃条件下避光染色，时长为60min；

d.上机检测

将步骤c中已染色的细胞核悬浮液再次用300目的尼龙网进行过滤，吸取300μl于10ml离心管进行上机检测，检测数据用FlowJo软件进行分析；

测定过程以未加倍的材料的新叶作为对照，对照后发现，加倍后的新叶会出现两种情况，一种为二倍体和四倍体的嵌合体的材料，另一种为纯四倍体材料。

（7）纯化：将步骤（6）中测定结果为二倍体和四倍体的嵌合体的材料继续培养成植株，待其枝条直径达到5mm以上时，分别剪取不同部位枝条上的叶片上部进行倍性测定，当测定为四倍体时，取叶片下部，连同叶柄一起剪下，再在增殖培养基进行扦插培养，培养方式同步骤（5），即可获得纯四倍体植株。

综上所述，采用秋水仙素变温诱导加倍后的新叶会出现两种情况，一种为二倍体和四倍体的嵌合体的材料，另一种为纯四倍体材料，针对二倍体和四倍体的嵌合体的材料只需要再次进行培养即可提纯为纯四倍材料，不仅操作方便，而且还大大提高培育的精度，减少了失败品。

对于本领域技术人员而言，显然发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法，其特征在于：采用秋水仙素溶液处理柳树扦插苗，通过变温诱导的方式，使其产生多倍体，以培育具有优良性状的柳树，实现树种改良；

具体步骤为：

（1）取样：取样时间为晚上7-8点，选择生长状态优良的二倍体柳树扦插苗，从主茎顶端剪取长度为2cm的嫩芽，并去除多余的叶片，在流水下冲洗5分钟；

（2）灭菌：将步骤（1）中所得的嫩芽材料在超净工作台中先使用次氯酸钠溶液浸泡消毒20秒，再使用浓度为75%的酒精浸泡消毒20秒，消毒好的材料立即转移到无菌水中浸泡3分钟，如此反复浸泡清洗6次，并用无菌滤纸将表面的水吸干；

（3）加倍培养基培养制备：将步骤（2）中消毒好的柳树茎尖置于装有加倍培养基的锥形瓶中，茎尖浸没；所采用的加倍培养基为现用现配，避免过长时间放置；

所述步骤（3）中的加倍培养基配方为：MS粉末4.8g，蔗糖30g，6-BA 1g，NAA 5g，加超纯水定容至1L，配比后的溶液再进行高温灭菌，然后加入秋水仙素粉末2g，氨磷汀粉末10mg，充分溶解后避光静置；

（4）变温诱导：将步骤（3）中装有培养基和柳树茎尖的锥形瓶用透气封口膜封好后放置4℃冰箱中低温避光静置培养4小时，随后立即转移到50-52℃的培养箱中高温避光静置培养2小时，最后将高温处理后的材料转移到25±2℃的摇床中以120rpm的转速避光培养24小时；

（5）培养：将步骤（4）中处理好的材料从加倍培养基中取出，放入无菌水中浸泡4分钟，如此反复浸泡清洗8次，用无菌滤纸吸干表面的水分，然后将茎尖的形态学下端竖直插入到装有增殖培养基的培养瓶中，插入深度为0.5-0.8cm，培养瓶用透明透气封口膜封住，即可进行培养，培养过程中培养瓶需要置于以下条件中进行培养：培养温度为25±2℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为16小时红光与白光，两者的光照比例为1:1，然后再是8小时黑暗；

（6）测定：培养20-25天后，剪取其新生叶，用流式细胞术进行染色体倍性的测定，测定过程以未加倍的材料的新叶作为对照，对照后发现，加倍后的新叶会出现两种情况，一种为二倍体和四倍体的嵌合体的材料，另一种为纯四倍体材料；

（7）纯化：将步骤（6）中测定结果为二倍体和四倍体的嵌合体的材料继续培养成植株，待其枝条直径达到5mm以上时，分别剪取不同部位枝条上的叶片上部进行倍性测定，当测定为四倍体时，取叶片下部，连同叶柄一起剪下，再进行扦插培养，即可获得纯四倍体植株。

2.根据权利要求1所述的一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的次氯酸钠溶液中的氯含量为6-14%。

3.根据权利要求1所述的一种秋水仙素变温诱导柳树染色体加倍的方法，其特征在于：所述步骤（5）中的增殖培养基包括以下成分：MS粉末4.8g，蔗糖30g，6-BA 1g，NAA 5g，琼脂8g，加超纯水定容至1L，配比后的溶液再进行高温灭菌，冷却后备用。

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