CN116098058B - 一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置，包括透明的真空箱和箱盖，所述真空箱内设有放置板，所述放置板的板面上设有多个凹槽，所述放置板上方设有过滤网板，所述过滤网板上方设有针尖板，所述针尖板的下板面上设有多个针尖，所述过滤网板与针尖板之间的两端用弹簧连接，所述箱盖上方穿插有第一螺旋杆和第二螺旋杆，所述第一螺旋杆的下端穿过针尖板与过滤网板固定连接，所述第二螺旋杆的下端与针尖板固定连接，所述箱体侧面还设有注液口，所述真空箱上还设有连接管，所述连接管与真空压缩泵相连接；本发明结构简单，设计新颖，通过该加倍的装置可以同时对多个柳树茎尖进行处理，而且操作起来也简单便捷。

Description

一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置和方法

技术领域

本发明涉及染色体加倍技术领域，具体为一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置和方法。

背景技术

柳树为杨柳科柳属和钻天柳属树种的统称，种质资源丰富，全球有500种以上，仅我国就有257种，柳树具有多种倍性，2、3、4、5、6、8、10、12倍体都有一定的分布，多倍体柳树许多表型性状会明显优于二倍体，具体表现为器官变大、品质优良、生长旺盛、抗逆性强等。因此较二倍体柳树有更高的经济、生态和社会价值，开发潜力巨大。由于柳树自然多倍体品种有限，通过人工诱导产生多倍体对培育具有优良性状的柳树意义重大。传统的诱导方法一般采用秋水仙素浸泡法，加倍成功率不到10％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置和方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置，包括透明的真空箱和箱盖，所述真空箱内设有放置板，所述放置板的板面上设有多个凹槽，所述放置板上方设有过滤网板，所述过滤网板上方设有针尖板，所述针尖板的下板面上设有多个针尖，所述过滤网板与针尖板之间的两端用弹簧连接。

所述箱盖上方穿插有第一螺旋杆和第二螺旋杆，所述第一螺旋杆的下端穿过针尖板与过滤网板固定连接，所述第二螺旋杆的下端与针尖板固定连接，所述箱体侧面还设有注液口。

所述真空箱上还设有连接管，所述连接管与真空压缩泵相连接。

优选的，所述凹槽是直径为5mm的半圆。

优选的，所述过滤网板的孔径为2mm。

优选的，所述针尖长1-1.5cm，直径为0.3-0.5mm，且横距与凹槽对齐，竖距2-3mm。

优选的，所述真空箱上设有刻度线。

优选的，一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的方法，通过采用刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置进行如下步骤：

步骤一：取柳树当年生茎尖，去掉所有叶片后消毒；

步骤二：将茎尖先用次氯酸钠溶液浸泡，然后将材料立即转移到无菌水中浸泡，如此反复浸泡清洗，用无菌滤纸将表面的水吸干；

步骤三：扎孔，将消毒后的茎尖放在放置板上，通过第一螺旋杆使过滤网板下压对柳树茎尖进行固定，然后通过第二螺旋杆进一步下压针尖板进行扎孔，保证每根茎尖扎10个孔以上；

步骤四：注液，从注液口向真空箱内注加倍诱导液，随后旋转第二螺旋杆使针尖板远离过滤网板，该加倍诱导液现配现用，避免过长时间放置降解；

步骤五：封孔隙，用密封胶将盖板与第一螺旋杆和第二螺旋杆之间孔隙封堵，以及注液口封住；

步骤六：抽真空，打开真空压缩泵抽真空，直至真空泵不明显工作为止；

步骤七：静置，抽真空后静置30-40分钟为宜；

步骤八：培养，将诱导处理好的茎尖材料随诱导液一起转移至锥形瓶中，用封口膜密封好，放置到25℃摇床中，150rpm培养12h，将培养好的材料立即转移到无菌水中浸泡，并反复浸泡清洗，用无菌滤纸将表面的水吸干，材料竖直插入固体生根培养基，并保证在温度25℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为16小时红光与白光，8小时黑暗条件下培养。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明结构简单，设计新颖，通过该加倍的装置可以同时对多个柳树茎尖进行处理，而且操作起来也简单便捷，通过采用该装置来刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍，利用真空压力进行充分渗透，提高诱导液对材料的处理效率，其加倍成功率超过40％。

附图说明

图1为本发明结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”“前端”、“后端”、“两端”、“一端”、“另一端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在发明中的具体含义。

请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置，包括透明的真空箱1和箱盖2，所述真空箱1内设有放置板3，所述放置板3的板面上设有多个凹槽31，所述凹槽31是直径为5mm的半圆，用于放置柳树茎尖。

所述箱盖2上方穿插有第一螺旋杆42和第二螺旋杆52，所述第一螺旋杆42的下端穿过针尖板5与过滤网板4固定连接，所述过滤网板4位于放置板3上方，当第一螺旋杆带动过滤网板4下压可以对柳树茎尖起到固定作用，所述过滤网板4的孔径为2mm，便于针尖穿过。

所述第二螺旋杆52的下端与针尖板5固定连接，所述针尖板5位于过滤网板4上方，所述针尖板5的下板面上设有多个针尖51，长1-1.5cm，直径为0.3-0.5mm，针尖向下，且横距与凹槽口对齐，竖距2-3mm。用于给柳树茎尖扎孔，所述真空箱1上设有刻度线13，用于观测针扎的深度，所述过滤网板4与针尖板5之间的两端用弹簧41连接，便于压制扎孔后或针尖板及时复原，同时便于针尖层及时与柳树茎尖分离。

所述真空箱侧面还设有注液口21，用于装加倍诱导液，对材料进行诱导处理；上述加倍诱导液配方为：MS粉末4.8g，蔗糖30g，加超纯水定容至1L，配比后的溶液再进行高温灭菌，然后加入秋水仙素粉末1g，二甲基亚砜溶液20ml，充分混匀后避光静置。

所述真空箱1上还设有连接管11，所述连接管11与真空压缩泵12相连接，对柳树茎尖进行抽真空处理，抽真空前要密封所有真空箱上的孔隙。

本实施例中，一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的方法，通过采用刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置进行如下步骤：

步骤一：取柳树当年生茎尖约3.5cm长，去掉所有叶片后消毒；

步骤二：将茎尖先用6％次氯酸钠溶液浸泡60秒，然后将材料立即转移到无菌水中浸泡2分钟。如此反复浸泡清洗6次后，用无菌滤纸将表面的水吸干；

步骤三：扎孔，将消毒后的茎尖放在放置板上，通过第一螺旋杆使过滤网板下压对柳树茎尖进行固定，然后通过第二螺旋杆进一步下压针尖板进行扎孔，保证每根茎尖扎10个孔以上，从而可使诱导液均匀的渗透进枝条，提升诱导液进入枝条的量，有助于诱导成功；

步骤四：注液，从注液口向真空箱内注加倍诱导液，保证诱导液完全浸没茎尖即可，随后旋转第二螺旋杆使针尖板远离过滤网板，该加倍诱导液现配现用，避免过长时间放置降解，导致效果下降；

步骤五：封孔隙，用密封胶将盖板与第一螺旋杆和第二螺旋杆之间孔隙封堵，以及注液口封住；

步骤六：抽真空，打开真空压缩泵抽真空，直至真空泵不明显工作为止，利用真空压力将诱导液进行充分渗透，从而提升诱导产生多倍体的效率；

步骤七：静置，抽真空后静置，静置是为了让细胞从负压状态恢复正常状态，防止剧烈震荡导致细胞破碎，静置时间过短会影响诱导效率，过长则浪费实验的时间，因此30-40分钟为宜；

步骤八：培养，将诱导处理好的茎尖材料随诱导液一起转移至锥形瓶中，用封口膜密封好，放置到25℃摇床中，150rpm培养12h，通过摇床培养可以充分增加茎尖材料与诱导液的接触，以保证细胞活性，25℃为柳树最适生长温度，温度过高会导致细胞破碎；具体实验对比数据如表1所示；

表1：不同温度和不同时间下，茎尖材料加倍成功的几率

通过表1数据的比较下4h处理达不到效果，24h和48h处理加倍效果减弱，在25℃处理12h下，加倍成功率最高。

由于秋水仙素存在毒性，需要将培养好的材料立即转移到无菌水中浸泡2分钟，如此反复浸泡清洗6次，用无菌滤纸将表面的水吸干，这样在无菌水清洗后减弱后续生长过程中对细胞的毒害作用。

最后将材料竖直插到固体生根培养基表面以下1.5cm，并在25℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为16小时红光与白光，(红光：白光＝1:1)，8小时黑暗条件下培养；

表2：在生长2个月内，不同光照强度和温度下，茎尖的伸长率

通过表2中比较茎的伸长量可知，在光照强度1500-2000Lux内，茎伸长率高于其他光照强度伸长率，并且温度设置为25℃时，生长效果最好。

测定：剪取培养成功的柳树茎尖新生叶，用流式细胞术进行染色体倍性的测定，通过与传统的秋水仙素浸泡法的新叶作为对照，对照后发现，本方法加倍后的新叶，其加倍成功率超过40％。

表3：传统浸泡法与本发明方法的对比

处理方式	温度	时间	加倍成功率
				传统浸泡法	25	12h	8.21％±1.63％
本发明方法	25	12h	64.26％±1.92％

综上所述，在同样的培养环境下，本发明采用的方法相比较于传统浸泡法来说，加倍后的新叶成功率超过40％。

本实施例中，固体培养基配方为：MS粉末4.8g，蔗糖30g，琼脂8g，超纯水1L，配比方法为：称取MS粉末4.8g，蔗糖30g，加水溶解后，用NaOH调PH至5.6，加入琼脂8g，加超纯水定容至1L，配比后的溶液121℃高温灭菌20min，本配方通过NaOH调PH至5.6，以促进细胞分裂诱导植株形成新芽，继而很好的促进植物发芽生根。

对于本领域技术人员而言，显然发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置，包括透明的真空箱1和箱盖2，其特征在于：所述真空箱1内设有放置板3，所述放置板3的板面上设有多个凹槽31，所述放置板3上方设有过滤网板4，所述过滤网板4上方设有针尖板5，所述针尖板5的下板面上设有多个针尖51，所述过滤网板4与针尖板5之间的两端用弹簧41连接，

所述箱盖2上方穿插有第一螺旋杆42和第二螺旋杆52，所述第一螺旋杆42的下端穿过针尖板5与过滤网板4固定连接，所述第二螺旋杆52的下端与针尖板5固定连接，

所述真空箱侧面还设有注液口21，

所述真空箱1上还设有连接管11，所述连接管11与真空压缩泵12相连接。

2.根据权利要求1所述的一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置，其特征在于：所述凹槽31是直径为5mm的半圆。

3.根据权利要求1所述的一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置，其特征在于：所述过滤网板4的孔径为2mm。

4.根据权利要求1所述的一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置，其特征在于：所述针尖51长1-1.5cm，直径为0.3-0.5mm，针尖横距与凹槽对齐，竖距2-3mm。

5.根据权利要求1所述的一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置，其特征在于：所述真空箱1上设有刻度线13。

6.一种刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的方法，其特征在于：通过采用权利要求1所述的刺孔抽真空诱导柳树染色体加倍的装置进行如下步骤：

步骤一：取柳树当年生茎尖，去掉所有叶片后消毒；

步骤二：将茎尖先用次氯酸钠溶液浸泡，然后将材料立即转移到无菌水中浸泡，如此反复浸泡清洗，用无菌滤纸将表面的水吸干；

步骤三：扎孔，将消毒后的茎尖放在放置板上，通过第一螺旋杆使过滤网板下压对柳树茎尖进行固定，然后通过第二螺旋杆进一步下压针尖板进行扎孔，保证每根茎尖扎10个孔以上；

步骤四：注液，从注液口向真空箱内注加倍诱导液，随后旋转第二螺旋杆使针尖板远离过滤网板，该加倍诱导液现配现用，避免过长时间放置降解；

步骤五：封孔隙，用密封胶将盖板与第一螺旋杆和第二螺旋杆之间孔隙封堵，以及注液口封住；

步骤六：抽真空，打开真空压缩泵抽真空，直至真空泵不明显工作为止；

步骤七：静置，抽真空后静置30-40分钟为宜；

步骤八：培养，将诱导处理好的茎尖材料随诱导液一起转移至锥形瓶中，用封口膜密封好，放置到25℃摇床中，150rpm培养12h，将培养好的材料立即转移到无菌水中浸泡，并反复浸泡清洗，用无菌滤纸将表面的水吸干，材料竖直插入固体生根培养基，并保证在温度25℃，光照强度为1500-2000lux，光照周期为16小时红光与白光，8小时黑暗条件下培养。