CN115589947A

CN115589947A - 一种蒿柳组培快繁的方法及其应用

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Publication number: CN115589947A
Application number: CN202211295118.2A
Authority: CN
Inventors: 宋敏; 彭向永; 刘俊祥; 王文宇; 赵利清; 刘庆伟; 吴亚茹; 张馨
Original assignee: Qufu Normal University
Current assignee: Qufu Normal University
Priority date: 2022-10-21
Filing date: 2022-10-21
Publication date: 2023-01-13

Abstract

本发明属于植物组培技术领域，公开了一种蒿柳组培快繁的方法及其应用。该方法包括材料预培养：将剪取的当年生健康茎段扦插在营养土中培养；外植体消毒：将经培养萌发的嫩芽，在消毒试剂中进行消毒；启动培养：利用筛选的启动培养基进行增殖培养；丛生芽诱导增殖培养：利用筛选的丛芽诱导培养基促进无菌芽的愈伤组织生长，增加丛芽诱导的分化系数；生根培养：利用筛选的生根培养基进行生根培养；炼苗和移栽：利用筛选的移栽基质进行炼苗和移栽，得到蒿柳组培苗。本发明突破了蒿柳组培繁殖技术瓶颈，在人工控制的条件下实现周年生产，有助于蒿柳脱毒苗培育和标准化生产，并为柳属植物的外植体再生研究奠定了基础。

Description

一种蒿柳组培快繁的方法及其应用

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，尤其涉及一种蒿柳组培快繁的方法及其应用。

背景技术

全世界柳树共有520多种，其中我国发现260种左右，按植物类型可分为乔木、灌木及匍匐类，既有分布在干旱沙漠中的沙柳，也有生长在沼泽地的筐柳、杞柳。它们的繁殖方式、生长动态、适应能力及生态特点均具有明显的种间差异。蒿柳(SalixviminalisE.L.Wolf)属杨柳科(Salicaceae)柳属(Salix)灌木，高可达10米，树皮灰绿色，枝无毛，叶线状披针形，正面暗绿色，无毛或稍有短柔毛，背面布密丝状长毛，有银色光泽，叶柄有丝状毛，分布在中国北方的黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北等地，朝鲜、日本、西伯利亚、欧洲地区也有分布。蒿柳是阳性树种，适应性强、极耐水湿，多生于海拔300-600米溪流及河流两岸，可作为护岸树种和沼泽地带的先锋树种；蒿柳叶营养丰富，是饲养柞蚕的优良饲料；枝条和茎皮纤维发达，可编筐等；树生长快速、轮伐期短、方便矮林作业、绿期长，在园林绿化、能源林建设、土壤和水体净化、吸附剂制备等方面均具有广阔的应用前景。

柳树的外植体再生体系研究是至今未被攻克的难题，大大限制了分子育种技术在该物种上的应用。对于蒿柳而言，目前生产上多采用剪取自然生长枝条进行扦插繁殖，无公开的蒿柳组织培养快繁育苗的报道，导致蒿柳优良新品系的繁育效率低，获得苗木整齐度差，不利于生产上的快速推广。由于缺乏有效的无菌培养体系，限制了生物技术手段在蒿柳新品种培育中的应用。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)现有技术中蒿柳苗木的繁育效率比较低，不利于生产上优良苗木的快速推广。

(2)现有技术在蒿柳组培繁殖技术上存在技术瓶颈，不能实现苗木的周年生产和脱毒苗的培育，而且标准化生产条件不能满足。

发明内容

为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种蒿柳组培快繁的方法及其应用。

所述技术方案如下：一种蒿柳组培快繁的方法包括以下步骤：

S1，材料预培养：将剪取休眠植株的当年生健康茎段扦插在营养土中培养；

S2，外植体消毒：将经步骤S1培养萌发的嫩芽，在消毒试剂中进行消毒；

S3，启动培养：利用筛选的启动培养基进行启动培养；

S4，丛生芽诱导增殖培养：利用筛选的丛芽诱导培养基促进无菌芽的愈伤组织生长，增加丛芽诱导的分化系数；

S5，生根培养：利用筛选的生根培养基进行生根培养；

S6，炼苗和移栽：利用筛选的移栽基质进行炼苗和移栽，得到蒿柳组培苗。

在一个实施例中，在步骤S1前，采集蒿柳休眠植株的当年生健康茎段，所述当年生健康茎段为落叶后进入休眠期采集的蒿柳当年生无花芽的健康枝条，枝条直径大于3.0mm，将茎段15-20cm，下端留斜口，上端留平口进行修剪。

在一个实施例中，在步骤S1中，剪取的当年生健康茎段扦插在装有营养土的培养容器中，在培养室中预培养2-3周，每个枝条保留2-3个腋芽，至新萌发新芽长度2-3cm；

营养土成分按体积比为草炭土：黏土＝1:1；培养室温度25±1℃，湿度55-65％，光照时间14-16h，光照强度2000-2500Lux。

在一个实施例中，在步骤S2中，剪取萌发的2-3cm嫩芽，用0.1％的洗洁精水浸泡3min，再用自来水冲洗干净，流水冲洗浸泡1.5-2小时，转入超净工作台上，用10％次氯酸钠浸泡3-5min，最后用无菌水冲洗4-6次。

在一个实施例中，在步骤S3中，所述启动培养基以MS培养基为基本培养基，具体为：MS+6-BA0.5-1.0mg/L+GA₃0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L,pH＝5.8-6.5。

在一个实施例中，在步骤S4中，所述丛生芽诱导增殖培养基，以WPM为基本培养基，具体为：

WPM+6-BA1.0-3.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH＝5.2-5.8。

在一个实施例中，在步骤S5中，所述生根培养基，以1/2MS培养基为基本培养基，具体为：1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，

在一个实施例中，所述生根培养基pH＝5.5-5.8。

所述产生根的完整植株为在生根培养基上培养25天后的材料。

在一个实施例中，在步骤S6中，将经步骤S6生根培养得到的完整植株载入移栽基质中，温度20-28℃，自湿度50-60％；所述移栽基质按体积比为草炭土：珍珠岩＝3:1。

本发明的另一目的在于提供一种所述蒿柳组培快繁的方法在柳属植物组培快繁上的应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：

第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：

本发明提供一种蒿柳茎段组培快繁的方法，采集蒿柳当年生健康茎段，依次进行材料预培养，外植体消毒，启动培养，丛生芽诱导增殖培养、生根培养以及炼苗和移栽，得到蒿柳组培苗。

本发明突破了蒿柳组培繁殖技术瓶颈，在人工控制的条件下实现周年生产，有助于蒿柳脱毒苗培育和标准化生产，并为柳属植物的外植体再生研究奠定了基础。

第二、把技术方案看作一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：

本发明还提供所述蒿柳组培快繁的方法在蒿柳繁殖中的应用和现有的蒿柳的苗木繁殖方法相比，本发明的方法具有如下优点：本发明的方法可以在人工控制的条件下，一年内繁育成上百万株成品和脱毒苗木，极大地提高了蒿柳苗木的繁育效率和标准化水平。

第三、作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：

(1)利用本发明的技术方案可快速扩繁优良蒿柳品系，在短期内获得大量标准化的苗木。以每株无菌苗的分化系数为5-6，每30-40天转接继代1次计算，1株无菌苗1年内最少可生产195,3125株苗木。苗木成本约0.1元/株，总成本20万元，出售价格约0.5元/株，毛收入100万元，利润80万元。

(2)目前生产上多采用剪取自然生长枝条进行扦插繁殖，这种方法虽然操作简单，但受限于优良品系的枝条量少，一年仅能扦插1次，繁殖速度慢，不利于优良品系的快速推广。目前，无公开的蒿柳组织培养快繁育苗的报道，本发明方案填补了国内外空白。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理；

图1是本发明实施例提供的蒿柳组培快繁的方法流程图；

图2是本发明实施例提供的材料预培养后接种污染率统计示意图；

图3是本发明实施例提供的当年生枝条直径对接种成活率的影响示意图；

图4是本发明实施例提供的外植体消毒方式示意图；

图5是本发明实施例提供的启动培养基筛选示意图；

图6是本发明实施例提供的丛芽诱导增殖培养基筛选示意图；

图7是本发明实施例提供的生根培养基筛选示意图；

图8是本发明实施例提供的移栽基质对组培苗成活率的影响示意图；

图9(a)是本发明实施例提供的启动培养效果图；

图9(b)是本发明实施例提供的增殖培养效果图一；

图9(c)是本发明实施例提供的增殖培养效果图二；

图9(d)是本发明实施例提供的增殖培养效果图三；

图9(e)是本发明实施例提供的生根效果图；

图9(f)是本发明实施例提供的移栽效果图；

图10是本发明实施例提供的“林蒿1号”优良品系的组培繁殖应用效果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一、解释说明实施例：

实施例1

如图1所示，本发明实施例提供蒿柳组培快繁的方法，采集落叶后进入休眠期的蒿柳当年生健康茎段，依次进行：

S101，材料预培养：减少外植体休眠芽带菌，提高灭菌效果。

S102，外植体消毒：合适的消毒试剂种类、浓度、组合和消毒时间，可避免消毒不彻底污染率过高或消毒过度导致材料死亡。

S103，启动培养：选择合适的启动培养基激素浓度配比，可以使外植体快速启动生长，叶片展开，叶色浓绿，生长状态佳，利于继续增殖培养。

S104，丛生芽诱导增殖培养：选择合适的丛芽诱导培养基激素浓度配比，可以促进无菌芽的愈伤组织生长，增加丛芽诱导的分化系数，提高无菌苗的生产量。

S105，生根培养：选择合适的生根培养基激素浓度配比，可以增加生根数量，促进根的伸长，利于移栽。

S106，炼苗和移栽：选择合适的移栽基质类型和配比，利于根系呼吸，提高移栽植株的成活率。得到蒿柳组培苗。

实施例2

基于实施例1记载的蒿柳组培快繁的方法，进一步优选地，所述采集蒿柳当年生健康茎段，为落叶后进入休眠期采集的蒿柳当年生无花芽的健康枝条，枝条直径大于3.0mm，将茎段剪成15-20cm长茎段，下端留斜口，上端留平口。

实施例3

基于实施例1记载的蒿柳组培快繁的方法，进一步优选地，所述步骤S101材料预培养中，为将剪好的蒿柳当年生茎段，扦插在装有营养土的培养容器中，在培养室中预培养2-3周，每个枝条保留2-3个腋芽，至新萌发新芽长度2-3cm。营养土成分配比为草炭土：黏土＝1:1，培养容器为内径15cm，高20cm圆形塑料花盆。培养室温度25±1℃，湿度55-65％，光照时间14-16h，光照强度2000-2500Lux。

实施例4

基于实施例1记载的蒿柳组培快繁的方法，进一步优选地，所述步骤S102外植体消毒中，为剪取萌发的2-3cm嫩芽，先用0.1％的洗洁精水浸泡3min，接着用自来水冲洗干净，流水冲洗浸泡1.5-2小时，转入超净工作台上，用10％次氯酸钠浸泡3-5min，最后用无菌水冲洗4-6次。

实施例5

基于实施例1记载的蒿柳组培快繁的方法，进一步优选地，所述步骤S103启动培养中，为消毒完毕后，用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，将切口处剪去接种在配制好的启动培养基中，使嫩芽启动生长，萌发新芽，并展开叶片。

所述启动培养基是以MS培养基为基本培养基，含有0.5-1.0mg/L(终浓度，下同)的6-BA(6-苄基氨基嘌呤，benzylaminmopurine)，0.5-1.0mg/L的GA₃(赤霉素，gibberellin)，即MS+6-BA0.5-1.0mg/L+GA₃0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L,pH＝5.8-6.5。

所述萌发新芽是指接种培养25天后，培养基上生长的材料。展开叶片为在启动培养基上培养30天后的材料。

实施例6

基于实施例1记载的蒿柳组培快繁的方法，进一步优选地，所述步骤S104丛生芽诱导增殖培养中，为将启动生长的萌发新芽转接到丛生芽诱导增殖培养基上，培养至产生愈伤组织并继续分化增殖大量不定芽。

所述丛生芽诱导增殖培养基，是以WPM为基本培养基，含有1.0-3.0mg/L的6-BA，1.0mg/L的GA₃，即WPM+6-BA1.0-3.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L,pH＝5.2-5.8。

所述产生愈伤组织为培养25天后的材料。

所述产生不定芽为培养40天后的材料。

实施例7

基于实施例1记载的蒿柳组培快繁的方法，进一步优选地，所述步骤S105生根培养中，为将诱导获得的株高大于1.5cm丛生不定芽接种到生根培养基上培养至产生根的完整植株，根长3-5cm并带有毛细根。

所述生根培养基，是以1/2MS培养基为基本培养基，含有0.5mg/L的NAA(萘乙酸，1-Naphthaleneaceticacid)，0.5-1.0mg/L的IBA(吲哚丁酸，Indole-3-Butytricacid)，即1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L,pH＝5.5-5.8。

实施例8

基于实施例1记载的蒿柳组培快繁的方法，进一步优选地，所述步骤S106炼苗和移栽中，为将得到的产生根的完整植株连同培养瓶转入温室中，瓶盖旋开但不拿开的状态下锻炼3天；接着打开瓶盖，并向瓶中加入少量自来水没过培养基，锻炼3天；取出生根苗，自来水洗净根部培养基，利用500倍的多菌灵浸泡3分钟后载入基质中。所述温室为玻璃日光温室，温度20-28℃，自然光照，湿度50-60％。

所述基质为草炭土：珍珠岩＝3:1混合。

在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。

二、实验实施例相关效果的证据：

实验实施例1

材料预培养后接种污染率统计，如图2所示。

以预培养2周获得的新萌发新芽作为外植体经消毒后接种至培养基上，污染率仅为19.3％，而生产上常用的方法即直接将当年生枝条消毒灭菌后接种的污染率达到76.7％，二者相差近4倍，差异达到极显著水平(P<0.05)。这是由于在灭菌消毒时未能将当年生枝条休眠芽内部藏有细菌完全杀死，在适宜生长条件下新芽萌发，细菌随即暴露出来。

实验实施例2

当年生枝条直径对接种成活率的影响，如图3所示。

当年生枝条的直径影响接种成活率，直径小于0.3mm的枝条萌发出的新芽，经灭菌消毒后的成活率为47.7％，而直径大于0.3mm的枝条萌发的新芽接种成活率均达到了90％以上，差异显著(P<0.05)。这可能是枝条中储存的营养物质影响了新芽的生活状态。

实验实施例3

为了筛选最佳的外植体消毒方法，如图4所示，设计了4种不同的消毒方式：

方式1：70％酒精15s+10％次氯酸钠3-5min；

方式2：次氯酸钠3-5min；

方式3：70％酒精15s+0.1％升汞8-10min；

方式4：0.1％升汞8-10min。

施用消毒方式2后的外植体未污染成活率最高，达到了87％，显著高于其它三种消毒方式(P<0.05)。使用酒精可有效杀死休眠芽内部藏有的细菌，但酒精的穿透力强，在杀死细菌的同时，也可能对幼嫩的芽体造成伤害。升汞为重金属剧毒性试剂，可导致环境污染，虽然灭菌效果好，但吸附在材料表面后难易冲洗，会引起材料褐化而死亡。次氯酸钠杀菌能力中等，选择适当的消毒时间和浓度，可有效提高消毒效果，不会造成材料死亡。

实验实施例4

启动培养基筛选，如图5所示。

采用正交L₉(3⁴)设计，如表1所示。将27种浓度配比组合优化为9种组合，在9种不同浓度激素组合的MS培养基中，外植体生长速度及生长状态不同。在含有细胞分裂素6-BA和赤霉素GA₃但不含生长素NAA的MS培养基中(1-3号)，植株生长较快，其中在含有0.5-1.0mg·L^-1的6-BA和0.5-1.0mg·L^-1的GA₃的条件下生长最快，植株增高明显且叶片宽大舒展，叶色浓绿，植株状态佳。

表1启动培养基正交L₉(3⁴)筛选

实验实施例5

丛芽诱导增殖培养基筛选，如图6所示。

采用正交L₉(3⁴)设计，如表2所示，将27种浓度配比组合优化为9种组合，在9种不同浓度激素组合的WPM培养基中，外植体诱导增殖及生长状态不同。在含有细胞分裂素6-BA和赤霉素GA₃但不含生长素NAA的培养基中(1-3号)，植株生长较快，分化系数高，其中在含有1.0mg-3.0mg·L^-1的6-BA和1.0mg·L^-1的GA₃的条件下生长最快，植株增殖分化系数显著高于其它组合，且叶片宽大舒展，叶色浓绿，植株状态佳。

表2丛芽诱导增殖培养基正交L₉(3⁴)筛选

实验实施例6

生根培养基筛选，如图7所示。

采用正交L₉(3⁴)设计，如表3所示，将27种浓度配比组合优化为9种组合，在9种不同浓度激素组合的1/2MS培养基中，含有0.5mg·L^-1的NAA和0.5-1.0mg·L^-1的IBA的条件下生根最快，大于1cm的根达到了6个以上，植株生长状态显著高于其它组合。

表3生根培养基正交L₉(3⁴)筛选

实验实施例7

移栽基质对组培苗成活率的影响，如图8所示。

移栽基质1：黏土；

移栽基质2：珍珠岩；

移栽基质3：草炭土；

移栽基质4：草炭土+黏土＝3:1；

移栽基质5：草炭土+珍珠岩＝3:1。

5种不同的移栽基质中，基质5即草炭土：珍珠岩＝3:1中移栽成活最好，达到了97.5％，基质1即单纯黏土移栽的成活率最低，可能是因为黏土透气性差且的营养成分低。

利用本发明技术进行蒿柳组培快繁的结果如图9(a)启动培养效果图，图9(b)增殖培养效果图一，图9(c)增殖培养效果图二，图9(d)增殖培养效果图三，图9(e)生根效果图以及图9(f)移栽效果图。

实验实施例8

如图10“林蒿1号”优良品系的组培繁殖应用效果图所示，利用本发明的技术进行蒿柳新品系“林蒿1号”的组培快繁，目前已建成1100平方的1600多株2年生组培苗采穗林，为蒿柳优良品系快速推广奠定了基础。

以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蒿柳组培快繁的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1，材料预培养：将剪取的当年生健康茎段扦插在营养土中培养；

S3，启动培养：利用选择的启动培养基进行启动培养；

S4，丛生芽诱导增殖培养：利用选择的丛芽诱导培养基促进无菌芽的愈伤组织生长，增加丛芽诱导的分化系数；

S5，生根培养：利用选择的生根培养基进行生根培养；

S6，炼苗和移栽：利用选择的移栽基质进行炼苗和移栽，得到蒿柳组培苗。

2.根据权利要求1所述的蒿柳组培快繁的方法，其特征在于，在步骤S1前，采集蒿柳当年生健康茎段，所述当年生健康茎段为落叶后进入休眠期采集的蒿柳当年生无花芽的健康枝条，枝条直径大于3.0mm，将15cm-20cm长的茎段，下端留斜口，上端留平口进行修剪。

3.根据权利要求1所述的蒿柳组培快繁的方法，其特征在于，在步骤S1中，剪取的当年生健康茎段扦插在装有营养土的培养容器中，在培养室中预培养2周-3周，每个枝条保留2个-3个腋芽，至新萌发新芽长度2cm-3cm；

营养土成分按体积比为草炭土：黏土＝1:1；培养室温度25±1℃，湿度55％-65％，光照时间14h-16h，光照强度2000Lux-2500Lux。

4.根据权利要求1所述的蒿柳组培快繁的方法，其特征在于，在步骤S2中，剪取萌发的2cm-3cm嫩芽，用0.1％的洗洁精水浸泡3min，再用自来水冲洗干净，流水冲洗浸泡1.5小时-2小时，转入超净工作台上，用10％次氯酸钠浸泡3min-5min，最后用无菌水冲洗4次-6次。

5.根据权利要求1所述的蒿柳组培快繁的方法，其特征在于，在步骤S3中，所述启动培养基以MS培养基为基本培养基，具体为：MS+6-BA0.5-1.0mg/L+GA₃0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH＝5.8-6.5。

6.根据权利要求1所述的蒿柳组培快繁的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述丛生芽诱导增殖培养基，以WPM为基本培养基，具体为：WPM+6-BA1.0-3.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L,pH＝5.2-5.8；

所述丛生芽诱导增殖培养基，以WPM为基本培养基，具体为：WPM+6-BA1.0-3.0mg/L+GA₃1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L，pH＝5.2-5.8。

7.根据权利要求1所述的蒿柳组培快繁的方法，其特征在于，在步骤S5中，所述生根培养基，以1/2MS培养基为基本培养基，具体为：1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5-1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。

8.根据权利要求7所述的蒿柳组培快繁的方法，其特征在于，所述生根培养基pH＝5.5-5.8；所述产生根的完整植株为在生根培养基上培养25天后的材料。

9.根据权利要求1所述的蒿柳组培快繁的方法，其特征在于，在步骤S6中，将经步骤S6生根培养得到的完整植株载入移栽基质中，温度20℃-28℃，湿度50％-60％；所述移栽基质按体积比为草炭土：珍珠岩＝3:1。

10.一种如权利要求1-9任意一项所述蒿柳组培快繁的方法在柳属植物组培快繁上的应用。