CN107278895B - 柽柳的工业化组培快繁技术 - Google Patents

Abstract

本发明公开了柽柳的工业化组培快繁技术，通过外植体的选择，消毒体系的建立、增殖培养、壮苗培养结合生根培养，并进行炼苗优化，最终本发明实现了多种柽柳的统一化组培快繁育苗，针对组培育苗的几个重要关键节点进行优化把控，包括启动率、茎段丛生芽的数量、生根率、生根条数、生根根长、炼苗成活率，最终获得了一致性的较高的炼苗成活率，实现了“启动率高、丛生芽多、成活率高和繁殖系数高”的效果，为柽柳的工业化育苗提供了极大的便利和技术支持，本发明非常适于工业化育苗生产。

Description

柽柳的工业化组培快繁技术

技术领域

本发明属于林木组培技术领域，具体涉及一种柽柳的工业化组培快繁技术，尤其是涉及可用于多种柽柳的规模化育苗生产技术。

背景技术

经济的迅速发展给自然环境造成了严重的影响，全世界范围内的盐渍土壤超过8亿多公顷(Munns and Tester,2008)，约占世界总面积的6.5％。在我国盐碱土总面积约为3.6×10⁷hm²，占全国可利用土地面积的4.88％，是我国农业、城市绿化和生态建设的主要限制因子之一。

柽柳属(Tamari x L.)植物为石竹目(Caryophyllales)柽柳科(Tamaricaceae)灌木或小乔木，柽柳属植物在全世界分布广泛,主要生长在温带和亚热带的干旱、半干旱、草原及盐碱地带。黄河入海口，植被生态系统脆弱，土壤含盐高，而柽柳在土壤含盐量0.5％-1.0％的地段上能正常生长，被称为盐碱地造林绿化的先锋植物，从选树适地原则，柽柳是黄河三角洲盐碱地造林绿化和生态建设的首选树种。

柽柳属树种常用的繁殖方法有播种育苗、扦插育苗、组织培养育苗等。相较而言，植物组织培养不仅可以快速大量地进行个体繁殖，又能较好地保持植物本身的遗传特性，而且不受气候等环境因素影响，有利于实现柽柳工厂化育苗、加快其推广应用。

现有技术已经报道了多项柽柳的组培研究。如程磊(2001)首先建立了中国柽柳(Tamarix chinensis Lour)一步成苗的组培技术，在激素KT的诱导下得到了完整植株，但未进行移栽实验(程磊和周根余,2001)。乔梦吉等(2007)将短穗柽柳扦插盆栽苗当年抽出的新嫩枝条作为外植体材料获得无菌苗后进行柽柳组培扩繁实验，待生根组培苗长到4-5cm高时，炼苗2-3d，移栽入营养土中，覆膜培养15天后炼苗成活率为75％(乔梦吉等,2007)。韦小敏等(2006,2007)分别以柽柳(Tamarix chinensis Lour)丛生芽产生的组培苗和嫩茎产生的组培苗进行炼苗移栽，由丛生芽产生的组培苗移栽成活率较低，仅为50％，嫩茎产生的组培苗移栽成活率为80％(韦小敏等,2006；韦小敏等,2007)。韩琳娜等(2009,2010)以来自黄河三角洲的柽柳(Tamarix chinensis Lour)的嫩芽作为外植体进行组培扩繁，发现取材部位和时间对外植体的分化诱导率具有明显的影响，后来又进行了一步成苗最佳培养基的筛选，最佳培养基为MS+1.00mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA，炼苗成活率可达82.7％(韩琳娜等,2009；韩琳娜和周凤琴,2010)。杨立文等(2013)以短枝柽柳幼嫩茎段为外植体获得的组培苗炼苗后的移栽成活率为83％(杨立文等,2013)。刘振林等(2013)以白花柽柳的茎段为外植体材料，进行了由愈伤组织诱导到丛生芽的诱导和直接进行丛生芽的诱导两条途径的快繁实验，研究发现直接诱导产生丛生芽的效果最好，出芽率达98.68％，生根率为93％，炼苗后的移栽成活率为80％(刘振林等,2013)。专利文献CN104542294A公开了一种柽柳组培苗生根的方法，通过添加活性炭优化培养基，减少柽柳外植体褐化现象缩短培养周期。专利文献CN105052738A公开了一种柽柳组织培养快速繁殖的方法，利用中国柽柳外植体通过次氯酸消毒、新型的继代培养及和生根培养基培养，炼苗移栽成活率达96％以上。

虽然柽柳的组织培养取得了一定的进展，但大多仍处在实验室阶段，并且现有研究均只是针对柽柳属的一种进行各项条件的优化并组培体系的建立，无法实现多种柽柳的统一的工厂化育苗，难以大规模推广应用。

发明内容

针对上述现有技术及存在的问题，本发明针对多种柽柳进行组培研究，以期发现规律，建立适宜用于多种柽柳的规模化育苗生产技术。

本发明的目的在于提供一种用于多种柽柳的组织培养快速繁殖的方法，简化工厂化育苗时不同种类柽柳的多条件多组培体系选择、降低生产和选择成本，并可以同步实现多种柽柳的统一的工厂化(流水线型)培养育苗。

为实现上述发明目的，具体的，本发明涉及以下技术方案：

一种用于多种柽柳的组织培养快速繁殖的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)外植体：扦插盆栽苗抽出的新嫩枝条为外植体；

(2)外植体的消毒：选用75％C₂H₅OH和0.1％HgCl₂，消毒时间分别为30s、9min；

(3)增殖培养：消毒培养后的无菌苗，MS培养基为基本培养基，添加6-BA和NAA进行培养，培养45天；

(4)壮苗培养：将柽柳增殖培养产生的丛生苗转入MS培养基进行壮苗培养，培养20天；

(5)生根培养：经壮苗长高后的组培苗，剪成小段，采用无激素MS培养基进行生根培养，培养20天；

(6)炼苗移栽：炼苗基质为营养土添加一定比例的沙子(营养土：沙子＝10：1)；炼苗时首先将组培瓶上封口膜松动但不打开，在温度为22±1℃，光强度800±100μmol·m^–2·s^–1的组培室进行炼苗2天，再将组培瓶的封口膜上轻轻打开少许缝隙后炼苗2天，接着将封口膜打开后盖在组培瓶上炼苗2天后进行移栽；移栽的前一天用多菌灵对移栽基质进行消毒，移栽时选择根长为1.5-2cm、生根条数为2-3条、生长健壮的组培苗进行移栽，移栽时将组培苗从培养基中取出，用清水将根部的培养基清洗干净，用多菌灵溶液浸泡根部15s，移栽到盛有灭过菌的基质中，移栽后覆膜培养，早晚喷水，一周后，覆盖膜打开少许，继续培养一周后，揭膜培养，保持土壤湿润，培养30天移栽到大田。

上述方法适用于多种柽柳的组织培养，尤其适用于甘蒙柽柳(Tamarix chinensisNakai)、红花多枝柽柳(Tamarix hohenackeri Bunge)、中国柽柳(Tamarix chinensisLour.)的组织培养。

本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明实现了多种柽柳的统一化组培快繁育苗，实现了“启动率高、丛生芽多、成活率高和繁殖系数高”的效果，为柽柳的工业化育苗提供了极大的便利和技术支持，可以实现多种柽柳的快速育苗培育。

(2)本发明在基于统一化组培条件的同时，针对组培育苗的几个重要节点进行把控，包括启动率、茎段丛生芽的数量、生根率、生根条数、生根根长、炼苗条件及成活率，最终获得了一致性的较高的炼苗成活率，具体为甘蒙柽柳、中国柽柳和红花多枝柽柳的启动率分别为100％、87.5％和87.5％，每个茎段丛生芽的数量分别为37.25个、47.25个和34.5个，移栽炼苗取得了最高的成活率，甘蒙柽柳为88.33％，中国柽柳为91.67％，红花多枝柽柳为93.33％，非常适于工业化育苗生产。

附图说明

图1甘蒙柽柳组培快繁体系结果，A甘蒙柽柳在MS培养基壮苗培养15后的甘蒙柽柳；B甘蒙柽柳试管苗移栽后生长情况；C甘蒙柽柳组培苗的生根情况(从左往右依次为IBA、KT和MS)

图2甘蒙柽柳试管苗移栽后成活率，Sand表示沙子，Nutrient soil为营养土+1/10沙子。

图3红花多枝柽柳组培快繁体系结果，A红花多枝柽柳在MS培养基壮苗培养15后的生长情况；B红花多枝柽柳试管苗移栽后生长情况；C红花多枝柽柳组培苗的生根情况(从左往右依次为IBA、KT和MS)。

图4中国柽柳组培快繁体系结果图，A中国柽柳在MS培养基壮苗培养15后的生长情况；B中国柽柳试管苗移栽后生长情况；C中国柽柳组培苗的生根情况(从左往右依次为IBA、KT和MS)。

图5三种柽柳工业化育苗结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

甘蒙柽柳(Tamarix chinensis Nakai)隶属于石竹目(Caryophyllales)柽柳科(Tamarcaceae)柽柳属(Tamarix)，灌木或乔木，树干和老枝栗红色，枝直立，叶灰蓝绿色；绿色嫩枝上的叶长圆形或长圆状披针形，渐尖，基部亦向外鼓胀。甘蒙柽柳是我国北方沿海城市及内地盐渍化地区的城市绿化和盐碱地合理开发利用优良树种

红花多枝柽柳(Tamarix hohenackeri Bunge)为泌盐盐生植物，将土壤中的盐分吸收到体内后通过盐腺排出体外，从而避免盐害，该树种为落叶小乔木或灌木，耐修剪，具有很高的观赏价值，该树种寿命长，萌芽力强、生长量大，基部平茬后具有很强的萌芽力。红花多枝柽柳的花色为红色，花开艳丽，枝繁叶茂，植物体内富含单宁，具有抗虫能力，非常适合在盐碱地园林绿化中应用。

中国柽柳(Tamarix chinensis Lour.)原产于中国，其拉丁文的意思是在中国分布。为落叶小乔木或灌木，在我国广泛分布，原产于山东、辽宁、河北、河南、江苏(北部)等省，主要生长在河流冲积的平原、潮湿盐碱地、海滨、沙荒地和滩头，其枝、叶、花具有极高的观赏价值，耐盐碱、干旱和水湿，适应性极强，其花色为粉红、粉白或淡白，花期较长。

诚如背景技术中所述，柽柳的组培快繁技术大多仍处在实验室阶段，实现移栽的成活率并不高；并且现有研究均只是针对柽柳属的一种进行各项条件的优化并组培体系的建立，在实际工业化育苗过程中面临着诸多问题(如培养条件的不统一，在面临多种柽柳培育时组培条件极难协调、炼苗条件不具体难以掌握、成活率低等)，导致实际应用中无法实现多种柽柳的统一的规模化工厂育苗。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供了一种用于多种柽柳的组织培养快速繁殖的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)外植体：扦插盆栽苗抽出的新嫩枝条为外植体；

(2)外植体的消毒：选用75％C₂H₅OH和0.1％HgCl₂，消毒时间分别为30s、9min；

(3)增殖培养：消毒培养后的无菌苗，MS培养基为基本培养基，添加6-BA和NAA进行培养，培养40-50天；

(4)壮苗培养：将柽柳增殖培养产生的丛生苗转入MS培养基进行壮苗培养，培养15-25天；

(5)生根培养：经壮苗长高后的组培苗，剪成小段，采用无激素MS培养基进行生根培养，培养15-25天；

(6)炼苗移栽：炼苗基质为营养土添加一定比例的沙子(营养土：沙子＝10：1)；炼苗时首先将组培瓶上封口膜松动但不打开，在温度为22±1℃，光强度800±100μmol·m^–2·s^–1的组培室进行炼苗2天，再将组培瓶的封口膜上轻轻打开少许缝隙后炼苗2天，接着将封口膜打开后盖在组培瓶上炼苗2天后进行移栽；移栽的前一天用多菌灵对移栽基质进行消毒，移栽时选择根长为1.5-2cm、生根条数为2-3条、生长健壮的组培苗进行移栽，移栽时将组培苗从培养基中取出，用清水将根部的培养基清洗干净，用多菌灵溶液浸泡根部15s，移栽到盛有灭过菌的基质中，移栽后覆膜培养，早晚喷水，一周后，覆盖膜打开少许，继续培养一周后，揭膜培养，保持土壤湿润，培养30天移栽到大田。

本发明所述步骤(3)-(5)中，组培苗培养条件：培养温度白天25±1℃，夜晚18±1℃，光照强度为200±100μmol·m^–2·s^–1，光照12-14h，黑暗10-12h。

上述方法适用于多种柽柳的组织培养，尤其适用于甘蒙柽柳(Tamarix chinensisNakai)、红花多枝柽柳(Tamarix hohenackeri Bunge)、中国柽柳(Tamarix chinensisLour.)的组织培养。

上述方法步骤(1)中，外植体需选用扦插盆栽苗抽出的新嫩枝条，老枝条的外植体组培过程中生长较慢、并且褐化现象较为严重，对启动率较低、丛生芽数较少。

上述方法步骤(2)中，本发明选用75％C₂H₅OH 30s和0.1％HgCl₂ 9min，的消毒方式，在消毒的选择过程中除考虑外植体的污染率和存活率外，还着重考察了消毒方式对于后续生根率的影响。本发明减少消毒次数、相应延长消毒时间，保证了消毒效果，并减少了对后续生根率的影响。

具体的实施方式中，消毒过程中，以MS培养基为基本培养基，首先对剪取的柽柳嫩枝条进行清洗，加洗洁净，从下往上用棉花清洗，清洗干净后用流动的自来水冲洗，再把柽柳嫩枝条每段剪成3-4cm，用流动的水冲洗30min后拿到超净工作台。在超净工作台，先用无菌水冲洗三遍，然后用75％的酒精浸泡30s，再用0.1％升汞浸泡9min，接着用无菌水冲洗4-5次。把外植体放到含有4-5张滤纸的培养皿中，吸干外植体表面的水。剪去茎段上下各5mm的部分(防止酒精、氯化汞的毒害)，下端剪成斜面，插到MS培养基中。

上述方法步骤(3)中，本发明增殖培养最终选用6-BA和NAA。虽然现有报道的可用于柽柳组培的激素有多种(包括NAA、6-BA、KT、GA、IAA、IBA等)，但发明人前期通过预实验发现，6-BA和NAA的组合的通用性最优，两者组合可以满足多种柽柳外植体有效启动和产生丛生芽的需求(适用于不同柽柳时，仅需通过简单调节即可实现)；但针对不同柽柳，最优的启动率和诱导丛生芽的具体浓度有所不同，针对不同柽柳，6-BA和NAA的最优浓度通过交互实验可以获得。如针对甘蒙柽柳的最适增殖培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，启动率为100％，每个茎段丛生芽的数量分别为37.25个；针对中国柽柳的最适增殖培养基分别为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.7mg/L，启动率为87.5％，每个茎段丛生芽的数量分别为47.25个；针对红花多枝柽柳的最适增殖培养基为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.7mg/L，启动率为87.5％，每个茎段丛生芽的数量为34.5个。

优选的实施方式中，增殖培养45天。

上述方法步骤(4)中，本发明采用MS培养基进行壮苗培养，壮苗培养过程中，将整个丛生苗(一簇)放在MS上进行壮苗；若不进行壮苗，丛生芽容易分散，并且丛生芽特别脆弱，含水量较高，剪成小段进行生根培养时，极易黄化死掉。进行壮苗培养是本发明柽柳的组织培养快速繁殖体系的重要关键环节之一。此外，本发明中采用MS培养基进行壮苗培养，发现其与1/2MS相比，养分的数量更高，不仅抑制了过度丛生现象、使其长高，而且极为有效的增强了丛生芽的强度，保证了生根和炼苗移栽的成功率。发明人甚至发现，在MS培养基壮苗培养过程中，红花多枝柽柳出现部分木质化现象。

上述方法步骤(5)中，所述无激素培养基优选为MS培养基或1/2MS；更为优选的是MS培养基。本发明过程中，延续步骤(4)中使用相同的培养基，不仅不影响壮苗后丛生苗的生根率，而且生根条数和根长都有显著提升，发明人分析认为1/2MS使用一般情况下更有利于生根(生根率高，但差异不显著)，但对于生根的质量(生根条数和根长)则不如MS培养基。

优选的实施方式中，步骤(4)(5)中各培养20天。

上述方法步骤(6)中，炼苗条件是本发明控制多种柽柳高炼苗成活率的又一关键环节。本发明所述炼苗基质选用营养土添加1/10的沙子。相较其他基质而言，本发明选用营养土作为主要炼苗基质，不仅具有良好的保肥性、持水性和透气性以及适合根系生长的pH值，而且养分均衡、充足，更适宜生根苗的恢复生长。此外，本发明炼苗过程中，除考虑温度、湿度的调节外，还对光照射条件进行了分析，由于本发明所述方法步骤(1)-(5)的执行，组培苗具有极好的生理状况，可以接受较高光强度(光强度800±100μmol·m^–2·s^–1)的照射，并且促进组培苗的快速生长，相较于遮光炼苗条件，炼苗后苗木的根系、移栽大田前苗木围径都明显提高，相应的成活率提高。

营养土：又称有机育苗基质，有机质含量为45％，pH为中性，富含微量元素，具体本发明实施例中示例性的采用济南佰倍增生物科技有限公司销售的营养土。

实施例1柽柳外植体消毒体系

实验材料：三种柽柳中国柽柳(Tamarix chinensis Lour.)、甘蒙柽柳(Tamarixaustromongolica Nakai)、红花多枝柽柳(Tamarix gallica Bunge)插穗于2016年5月份采自东营。柽柳扦插盆栽苗抽出的新嫩枝条为外植体。

针对中国柽柳，选用75％C₂H₅OH(s)和0.1％HgCl₂(min)，采用双因素三水平正交L₉(3²)(如表1所示)，以MS培养基为基本培养基，首先对剪取的柽柳嫩枝条进行清洗，加洗洁净，从下往上用棉花清洗，清洗干净后用流动的自来水冲洗，再把柽柳嫩枝条每段剪成3-4cm，用流动的水冲洗30min后拿到超净工作台。在超净工作台，先用无菌水冲洗三遍，然后用75％的酒精浸泡一定时间，再用0.1％升汞浸泡一定时间，接着用无菌水冲洗4-5次。把外植体放到含有4-5张滤纸的培养皿中，吸干外植体表面的水。剪去茎段上下各5mm的部分(防止酒精、氯化汞的毒害)，下端剪成斜面，插到MS培养基中。用75％酒精与0.1％升汞采用不同处理组合对外植体灭菌。消毒处理结果如表2所示

表1中国柽柳外植体消毒体系实验组

表2中国柽柳酒精和升汞不同消毒时间对柽柳生长的影响

75％酒精(s)	0.1％升汞(min)	污染率(％)	生根率(％)	存活率(％)
					20	6	35.42d	87.50c	64.44a
20	9	25.00cde	79.86bc	71.11cd
					20	12	21.67abc	68.75ab	77.78de
30	6	33.33de	87.50c	66.11ab
					30	9	16.67abc	79.86bc	83.33e
30	12	16.67abc	70.80ab	81.11e
					40	6	22.92bcd	75.00abc	75.00cd
40	9	11.67ab	72.50ab	72.22cd
					40	12	10.00d	62.50a	62.78a

表中数据是3个重复的平均值。不同字母表示在P＝0.05水平上差异显著。

经试验，中国柽柳消毒体系选用75％C₂H₅OH(s)和0.1％HgCl₂(min)，消毒时间分别为30s、9min，消毒效果：存活率为83.33％，污染率为16.67％。甘蒙柽柳和红花多枝柽柳的外植体消毒体系也采用75％C₂H₅OH 30s和0.1％HgCl₂9min，的消毒方式，生根率在85％以上，污染率控制在20％以下，存活率均高于80％。

实施例2甘蒙柽柳组培快繁体系

2.1实验方法

(1)外植体：采用甘蒙柽柳扦插盆栽苗抽出的新嫩枝条为外植体。

(2)消毒体系：选用75％C₂H₅OH(s)和0.1％HgCl₂(min)，消毒时间分别为30s、9min。

(3)增殖培养：消毒培养后的无菌苗，MS培养基为基本培养基，选用激素为6-BA和NAA，设置5×3的交互实验(如表3)

(4)壮苗培养：将三种柽柳增殖培养产生的丛生苗转入MS培养基进行壮苗培养，培养20天。

(5)生根培养：经壮苗长高后的组培苗，剪成约3cm左右的小段，作为生根培养的材料。选用的基本培养基为MS培养基，添加KT与IBA的浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7和0.9mg/L，培养20天后统计其生根率、根长和生根条数。

组培苗培养条件：培养温度白天25±1℃，夜晚18±1℃，光照强度为200μmol·m^-2·s^-1，光照14h，黑暗10h。

(6)炼苗移栽：炼苗基质为沙子、营养土添加1/10的沙子。炼苗材料为生根培养后的组培苗。首先将组培瓶上的皮筋打开，在温度为22℃，光强度800±100μmol·m^–2·s^–1的组培室进行炼苗两天，再将组培瓶的封口膜上轻轻打开少许缝隙后炼苗两天，接着将封口膜打开盖在组培瓶上炼苗两天后进行移栽。移栽的前一天用浓度为0.05g/mL的多菌灵对移栽基质进行消毒，为第二天的移栽做准备。移栽时选择根长为1.5-2cm、生根条数为2-3条、生长健壮的组培苗进行移栽，轻轻将组培苗从培养基中取出，用清水将根部的培养基清洗干净，清洗过程中要仔细、认真、顺着根生长的方向清洗，尽量避免对根造成伤害。组培苗清洗干净后，用浓度为0.03g/mL的多菌灵溶液浸泡根部30s左右，移栽到盛有灭过菌的基质中，移栽后将花盆放到大白盆里，覆膜培养。每天早晚用喷壶各喷一次水，炼苗一周后，在覆盖膜上开几个洞，继续培养一周后，揭膜培养，保持土壤湿润，培养30天移栽大田并统计成活率。

表3柽柳增殖培养基的激素组合

2.2实验结果

不同浓度组合的NAA和6-BA对甘蒙柽柳增殖生长的影响结果如表4所示，不同浓度的KT或IBA甘蒙柽柳生根的影响结果如表5所示，甘蒙柽柳组培快繁体系结果图如图1所示，甘蒙柽柳试管苗移栽后成活率如图2所示。

表4不同浓度组合的NAA和6-BA对甘蒙柽柳增殖生长的影响

表中数据是3个重复的平均值±SD。不同字母表示在P＝0.05水平上差异显著。

表5不同浓度的KT或IBA甘蒙柽柳生根的影响

表中数据是3个重复的平均值±SD。不同字母表示在P＝0.05水平上差异显著。

综上结果，本发明所述方法用于甘蒙柽柳组培快繁时，甘蒙柽柳的最适增殖培养基MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，启动率为100％，每个茎段丛生芽的数量为37.25个，生根培养基为MS培养基，生根率可达88.33％，生根条数为4.00，根长为3.70。炼苗基质为营养土添加1/10的沙子，移栽炼苗取得了较高的成活率，甘蒙柽柳炼苗成活率为88.33％。运用此方法，繁殖速度快，大大降低了育苗成本，可以实现甘蒙柽柳的工厂化育苗，为盐碱地绿化和生态建设提供优质苗木。

实施例3红花多枝柽柳组培快繁体系

3.1实验方法

(1)消毒体系的确立：插盆栽苗抽出的新嫩枝条为外植体，选用75％C₂H₅OH(s)和0.1％HgCl₂(min)，消毒时间分别为30s、9min。

(2)增殖培养：消毒培养后的无菌苗，MS培养基为基本培养基，选用激素为6-BA和NAA，设置5×3的交互实验(如表3)

(3)壮苗培养：将三种柽柳增殖培养产生的丛生苗转入MS培养基进行壮苗培养，培养20天。

(4)生根培养：经壮苗长高后的组培苗，剪成约3cm左右的小段，作为生根培养的材料。选用的基本培养基为MS培养基，添加KT与IBA的浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7和0.9mg/L。培养20天后统计其生根率、根长和生根条数。

组培苗培养条件：培养温度白天25±1℃，夜晚18±1℃，光照强度为200μmol·m^–2·s^–1，光照14h，黑暗10h。

(5)炼苗移栽：炼苗基质为沙子和营养土添加1/10的沙子。炼苗材料为生根培养后的三种柽柳组培苗，移栽基质为营养土添加1/10的沙子或沙子。首先将组培瓶上的皮筋打开，在温度为22℃，光强度为800±100μmol·m^–2·s^–1的组培室进行炼苗两天，再将组培瓶的封口膜上轻轻打开少许缝隙后炼苗两天，接着将封口膜打开盖在组培瓶上炼苗两天后进行移栽。移栽的前一天用浓度为0.05g/mL的多菌灵对移栽基质进行消毒，为第二天的移栽做准备。移栽时选择根长为1.5-2cm、生根条数为2-3条、生长健壮的组培苗进行移栽，轻轻将组培苗从培养基中取出，用清水将根部的培养基清洗干净，清洗过程中要仔细、认真、顺着根生长的方向清洗，尽量避免对根造成伤害。组培苗清洗干净后，用浓度为0.03g/mL的多菌灵溶液浸泡根部30s左右，移栽到盛有灭过菌的基质中，移栽后将花盆放到大白盆里，覆膜培养。每天早晚用喷壶各喷一次水，炼苗一周后，在覆盖膜上开几个洞，继续培养一周后，揭膜培养，保持土壤湿润，培养30天后统计成活率。

3.2实验结果

不同浓度组合的NAA和6-BA对红花多枝柽柳增殖生长的影响结果如表6所示，不同浓度的KT或IBA红花多枝柽柳生根的影响结果如表7所示，红花多枝柽柳组培快繁体系结果图如图3所示。

表6不同浓度组合的NAA和6-BA对红花多枝柽柳增殖生长的影响

表中数据是3个重复的平均值±SD。不同字母表示在P＝0.05水平上差异显著。

表7不同浓度的KT或IBA对红花多枝柽柳生根的影响

表中数据是3个重复的平均值±SD。不同字母表示在P＝0.05水平上差异显著。

综上结果，本发明红花多枝柽柳的组培快繁体系为，红花多枝柽柳的采用增殖培养基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.7mg/L，启动率为87.5％，每个茎段丛生芽的数量为34.5个。在MS培养基中，生根率可达92.31％，生根条数为5.33条，根长为6.40cm。炼苗基质为营养土+1/10沙子，移栽炼苗取得了较高的成活率，红花多枝柽柳为93.33％，为工厂化育苗提供了技术支持。运用本发明所述方法，繁殖速度快，大大降低了育苗成本，推进红花多枝柽柳的生产造林。

实施例4中国柽柳组培快繁体系

4.1实验方法

(1)外植体：中国柽柳扦插盆栽苗抽出的新嫩枝条为外植体。

(2)消毒体系：选用75％C₂H₅OH(s)和0.1％HgCl₂(min)，消毒时间分别为30s、9min。

(3)增殖培养：消毒培养后的无菌苗，MS培养基为基本培养基，选用激素为6-BA和NAA，设置5×3的交互实验(如表3)

(4)壮苗培养：将三种柽柳增殖培养产生的丛生苗转入MS培养基进行壮苗培养，培养20天。

(5)生根培养：经壮苗长高后的组培苗，剪成约3cm左右的小段，作为生根培养的材料。选用的基本培养基为MS培养基，添加KT与IBA的浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7和0.9mg/L。培养20天后统计其生根率、根长和生根条数。

组培苗培养条件：培养温度白天25±1℃，夜晚18±1℃，光照强度为200μmol·m^–2·s^–1，光照14h，黑暗10h。

(6)炼苗与移栽：炼苗基质为沙子和营养土添加1/10的沙子。炼苗材料为生根培养后的柽柳组培苗，移栽基质为营养土添加1/10的沙子或沙子。首先将组培瓶上的皮筋打开，在温度为22℃，光强度800±100μmol·m^–2·s^–1的组培室进行炼苗两天，再将组培瓶的封口膜上轻轻打开少许缝隙后炼苗两天，接着将封口膜打开盖在组培瓶上炼苗两天后进行移栽。移栽的前一天用浓度为0.05g/mL的多菌灵对移栽基质进行消毒，为第二天的移栽做准备。移栽时选择根长为1.5-2cm、生根条数为2-3条、生长健壮的组培苗进行移栽，轻轻将组培苗从培养基中取出，用清水将根部的培养基清洗干净，清洗过程中要仔细、认真、顺着根生长的方向清洗，尽量避免对根造成伤害。组培苗清洗干净后，用浓度为0.03g/mL的多菌灵溶液浸泡根部30s左右，移栽到盛有灭过菌的基质中，移栽后将花盆放到大白盆里，覆膜培养。每天早晚用喷壶各喷一次水，炼苗一周后，在覆盖膜上开几个洞，继续培养一周后，揭膜培养，保持土壤湿润，培养30天后统计成活率。

4.2实验结果

不同浓度组合的NAA和6-BA对中国柽柳增殖生长的影响结果如表8所示，不同浓度的KT或IBA中国柽柳生根的影响结果如表9所示，中国柽柳组培快繁体系结果图如图4所示。

表8不同浓度组合的NAA和6-BA对中国柽柳增殖生长的影响

表中数据是3个重复的平均值±SD。不同字母表示在P＝0.05水平上差异显著。

表9不同浓度的KT或IBA对中国柽柳生根的影响

表中数据是3个重复的平均值±SD。不同字母表示在P＝0.05水平上差异显著。

综上结果，本发明所述组培快繁方法适用于中国柽柳，中国柽柳的增殖培养基MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.7mg/L，启动率为87.5％，每个茎段丛生芽的数量为47.25个；在MS培养基中，生根率可达97.62％，生根条数为3.33，根长为1.80。炼苗基质为营养土，移栽炼苗取得了较高的成活率，中国柽柳为91.67％。

Claims (7)

1.一种用于多种柽柳的统一化组织培养快速繁殖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)外植体：扦插盆栽苗抽出的新嫩枝条为外植体；

(2)外植体的消毒：选用75％C₂H₅OH和0.1％HgCl₂，消毒时间分别为30s、9min；

(3)增殖培养：消毒培养后的无菌苗，MS培养基为基本培养基，添加6-BA和NAA进行培养，培养40-50天；

(4)壮苗培养：将柽柳增殖培养产生的丛生苗转入MS培养基进行壮苗培养，培养15-25天；

(5)生根培养：经壮苗长高后的组培苗，剪成小段，采用无激素培养基进行生根培养，培养15-25天；

(6)炼苗移栽：炼苗基质为营养土添加少许沙子；炼苗时首先将组培瓶上封口膜松动但不打开，在温度为22±1℃，光强度800±100μmol·m^–2·s^–1的组培室进行炼苗两天，再将组培瓶的封口膜上轻轻打开少许缝隙后炼苗两天，接着将封口膜打开后盖在组培瓶上炼苗两天后进行移栽；移栽的前一天用多菌灵对移栽基质进行消毒，移栽时选择根长为1.5-2cm、生根条数为2-3条、生长健壮的组培苗进行移栽，移栽时将组培苗从培养基中取出，用清水将根部的培养基清洗干净，用多菌灵溶液浸泡根部15s，移栽到盛有灭过菌的基质中，移栽后覆膜培养，早晚喷水，一周后，覆盖膜打开少许，继续培养一周后，揭膜培养，保持土壤湿润，培养30天后移栽到大田；

步骤(3)-(5)中培养条件为：培养温度白天25±1℃，夜晚18±1℃，光照强度为200±100μmol·m^–2·s^–1，光照12-14h，黑暗10-12h；

所述柽柳为甘蒙柽柳(TamarixchinensisNakai)、红花多枝柽柳(TamarixhohenackeriBunge)、中国柽柳(TamarixchinensisLour.)；

步骤(3)中，甘蒙柽柳的最适增殖培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L，中国柽柳的最适增殖培养基为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.7mg/L，红花多枝柽柳的最适增殖培养基为MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.7mg/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，消毒过程中，以MS培养基为基本培养基，首先对剪取的柽柳嫩枝条进行清洗，清洗干净后用水冲洗，再把柽柳嫩枝条每段剪成3-4cm，用水冲洗30min后拿到超净环境内，先用无菌水冲洗三遍，然后用75％的酒精浸泡一定时间，再用0.1％升汞浸泡一定时间，接着用无菌水冲洗4-5次，吸干外植体表面的水，剪去茎段上下各5mm的部分，下端剪成斜面，插到MS培养基中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，增殖培养45天。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无激素培养基为MS培养基或1/2MS。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无激素培养基为MS培养基。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)、(5)中各培养20天。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中，炼苗基质选用营养土添加1/10的沙子。

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