CN107094626A - 染井吉野樱的组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种染井吉野樱组培快繁方法，该以染井吉野樱半木质化单芽茎段及扦插繁殖萌发的小芽为外植体，经过外植体消毒、芽初代诱导培养、增殖壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立了吉野樱组培快速繁殖方法，建立了染井吉野樱组织培养快繁技术体系，为今后染井吉野樱组织培养繁殖苗木，加速樱花其他良种繁育满足市场需求提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及园林植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种日本樱花－染井吉野樱组培快繁方法。
背景技术
染井吉野樱(学名:Prunus×yedoensis)，又名东京樱花，是国内樱花市场上炙手可热的高档樱花品种，遗传分析是由大岛樱和小松乙女樱杂交产生，分别继承了两者花朵大和先花后叶的特点。花期3月中下旬，花朵有五枚花瓣，花色在花朵绽放时是淡红色，而在完全绽放时会逐渐转白，整株在叶子长出前就盛开略带淡红色的白花，丽而不媚，繁茂如云。经多年的选育提纯，成为日本樱花中的珍品，作为最受欢迎的樱花而推广到日本全国各地，被日本誉为樱花之花王。
染井吉野樱生长健壮，树形潇洒，高度可达10至12米，是非常优秀的樱花品种，可孤植，可群植，也可作为行道树栽植。在北至辽宁、南至广东、东至上海、西至新疆等不同地域引种栽植并且生长良好，大连、北京、成都、上海、江西等地都有生长七十多年乃至百年的大树。它耐旱性强，耐盐碱，对土壤条件要求不严，各种土壤条件经改良后都能正常生长且长势良好。因为是人工育种，它无法自然结果繁衍，只能以插枝移植。但由于繁殖系数小，远不能满足造景需要，严重影响了染井吉野樱的的开发利用。因此有必要建立完整的染井吉野樱离体快繁体系，加速染井吉野樱种苗繁育以满足市场需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种樱花组培快速繁殖方法，本发明以染井吉野樱半木质化单芽茎段及扦插繁殖萌发的小芽为外植体，经过外植体消毒、芽初代诱导培养、增殖壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立了吉野樱组培快速繁殖方法，建立了染井吉野樱组织培养快繁技术体系，为今后染井吉野樱组织培养繁殖苗木，加速樱花其他良种繁育满足市场需求提供技术支持。
本发明樱花组培快速繁殖方法中，所述外植体处理和消毒步骤包括：
A、选取健壮吉野樱植株半木质化单芽茎段作为外植体，先用洗衣粉水浸泡20-30min，再轻轻清洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用流动的自来水冲洗2-4h后置于超净工作台中；在鼓风状态下于超净工作台上先用质量分数70-75％乙醇消毒8-15s后用无菌水清洗3-6次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒8-15min后用无菌水洗4-6次，最后用无菌纱布或无菌滤纸吸干外植体表面水珠后转接到芽初代诱导培养基中培养；或
B、于冬末春初在壮龄树上选择一年生、生长健壮、生活力旺盛的发育枝条，剪有饱满芽的木质化或半木质化枝条作为插穗，插穗长度为10—15厘米，有2-3个芽；温室高架苗床上下铺电加热设施，上铺10cm厚的基质珍珠岩，扦插之前基质及插穗都用1000ppm浓度的多菌灵或福尔马林溶液消毒；插好之后采用电加热促进土壤升温从而加快插穗发芽，同时10天后对穗条用500ppm浓度的多菌灵溶液进行喷雾消毒减少有害微生物到最低状态；待20天新芽长到5-7cm左右时，切取几近未木质化的单芽茎段或顶芽作为外植体按A步骤进行常规消毒后置于超净工作台中；在鼓风状态下在超净工作台上先用70-75％酒精消毒3s后，用无菌水清洗3-6次，再用0.1％升汞溶液消毒8min后用无菌水洗4-6次，最后用无菌纱布或无菌滤纸吸干外植体表面水珠后转接到芽初代诱导培养基中培养。
本发明方法中，所述芽初代诱导培养步骤为：
将经过外植体处理和消毒处理后的染井吉野樱单芽茎段或顶芽切成1.5－2.5cm小段并接种到芽诱导培养基中，在MS+BA0.5－1.0mg/L+NAA0.02mg/L+TDZ2.0－3.0mg/L+蔗糖20－30克/L+琼脂5.5-6.5克/L中，先在22-25℃条件下全暗培养养5-7天，然后置于每天光照10-12小时，光照强度2000lx的培养室中培养，25天左右继代一次，直至诱导形成丛生芽。
本发明方法中，所述增殖壮苗培养步骤为：
将经过芽初代诱导培养获得的丛生芽分切成芽块至增殖壮苗培养基(1/2MS+BA0.5－0.8+NAA0.05-0.08)上进行继代培养，接种后置于每天光照10-12小时，光照强度为2000lx，培养温度22-25℃的条件下培养，多次反复切割进行继代培养，得到健壮丛生芽。
本发明方法中，所述生根培养步骤为：
将增殖壮苗培养获得的高度约为2.5-3.5cm的健壮芽分切接种到生根培养基(1/2MS+NAA0.01-0.02)上进行生根培养，接种后先在22-25℃左右条件下暗培养0-5天，然后置于光照10-12小时，光照强度2000lx，培养温度为22-25℃左右的培养室中培养30-35天即可出瓶。
本发明方法中，所述炼苗移栽步骤为：
将经生根培养后获得的高约3.5-5.5cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根试管苗去盖置于培养室光下炼苗3-5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，并用800-1000PPM多菌灵浸泡10min后栽入由泥炭土：珍珠岩＝7：3混合并用1000PPM多菌灵进行喷淋过的基质中；放于温室培养，栽后前5-10天精心管护，每天至少分5次给幼苗喷雾浇水，保持叶面湿度，移栽成活率达80％以上。待幼苗成活后再移栽大田。与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明通过无性快繁技术快速获得大量染井吉野樱优良品种苗。以染井吉野樱半木质化单芽茎段为外植体，经过外植体消毒、芽初代诱导培养、增殖壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽等步骤建立了染井吉野樱组织培养快繁技术体系，为今后染井吉野樱组织培养繁殖苗木，加速樱花其他良种繁育满足市场需求提供技术支持。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
(1)外植体处理和消毒：选取健壮吉野樱植株半木质化单芽茎段作为外植体，先用洗衣粉水浸泡20min，再轻轻清洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用流动的自来水冲洗2h后置于超净工作台中。在鼓风状态下于超净工作台上先用质量分数75％乙醇消毒12s后用无菌水清洗5次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒15min后用无菌水洗6次，最后用无菌纱布或无菌滤纸吸干外植体表面水珠后备用；该方法的污染率高，达到90％。
(2)芽初代诱导培养：将步骤(1)处理后的染井吉野樱半木质化单芽茎段切成1.5－2.5cm小段并接种到芽诱导培养基(MS+BA0.5+NAA0.02+TDZ2.0+蔗糖20克+琼脂5.8)中，先在22-25℃条件下全暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度2000lx的培养室中培养，25天左右继代一次，直至诱导形成丛生芽，丛生芽分化率为11.9；
(3)增殖壮苗培养基：将步骤(2)培养获得的丛生芽分切至增殖壮苗培养基(1/2MS+BA0.8+NAA0.08)上进行继代培养，接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，培养温度为22-25℃的条件下培养，25-30天切割一次，多次反复切割进行继代培养，得到高度约为2.5-3.5cm的健壮丛生芽；
(4)生根培养基：将步骤(3)获得的健壮芽分切接种到生根培养基(1/2MS+NAA0.02)上进行生根培养，接种后先在25℃左右条件下暗培养5天，然后置于光照12小时，光照强度2000lx，培养温度为22-25℃左右的培养室中培养，一般20天就可生根，30天即可出瓶，30天后试管苗高约3.5-5.5cm，有5-8个不定根，根系粗壮。
(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根试管苗去盖置于培养室光下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，并用800PPM多菌灵浸泡10min后栽入由泥炭土：珍珠岩＝7：3混合并用1000PPM多菌灵进行喷淋过的基质中。放于温室培养，栽后前5天精心管护，每天至少分5次给幼苗喷雾浇水，保持叶面湿度，移栽成活率达80％以上。待幼苗成活后再移栽大田。
实施例2：
(1)外植体处理和消毒：选择温室扦插所发出的新芽，切取小芽作为外植体先用洗衣粉水浸泡20min，再轻轻清洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用流动的自来水冲洗2h后置于超净工作台中。进行常规消毒后带至超净工作台中。在鼓风状态下先用70-75％酒精消毒3s后，用无菌水清洗3-6次，再用0.1％升汞溶液消毒8min后用无菌水洗4-6次，最后用无菌纱布或无菌滤纸吸干外植体表面水珠后转接到芽初代诱导培养基中培养，采用该方法，污染率可以控制在20－30％以内。
(2)芽初代诱导培养：将步骤(1)处理后的染井吉野樱半木质化单芽茎段切成1.5－2.5cm小段并接种到芽诱导培养基(MS+BA1.0+NAA0.02+TDZ2.0+蔗糖30克+琼脂6.5)中，先在22-25℃条件下全暗培养养5天，然后置于每天光照10小时，光照强度2000lx的培养室中培养，15天左右继代一次，直至诱导形成丛生芽，丛生芽分化率为15.6；
(3)增殖壮苗培养基：将步骤(2)培养获得的丛生芽分切至增殖壮苗培养基(1/2MS+BA0.5+NAA0.05)上进行继代培养，接种后置于每天光照10小时，光照强度为2000lx，培养温度为22-25℃的条件下培养，多次反复切割进行继代培养，得到高度约为2.5-3.5cm健壮丛生芽；
(4)生根培养基：将步骤(3)获得的健壮芽分切接种到生根培养基(1/2MS+NAA0.01)上进行生根培养，接种后直接置于25℃左右条件下光照12小时，光照强度2000lx，培养温度为22-25℃左右的培养室中培养，一般20天就可生根，35天即出瓶；30天后试管苗高约3.5-5.5cm，有5-8个不定根，根系粗壮。
(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根试管苗去盖置于培养室光下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，并用1000PPM多菌灵浸泡10min后栽入由泥炭土：珍珠岩＝7：3混合并用1000PPM多菌灵进行喷淋过的基质中。放于温室培养，栽后前10天精心管护，每天至少分5次给幼苗喷雾浇水，保持叶面湿度，移栽成活率达90％以上。待幼苗成活后再移栽大田。
针对本发明实施例1、实施例2芽初代诱导培养的培养基选择，发明人经大量的科学试验论证选出最适芽初代诱导培养基，具体试验结果参见表1。
表1不同基础培养基及不同激素组合对愈伤及不定芽诱导的影响(25天统计，每种培养基统计25瓶)
表中：
1号培养基采用王文房等人在《樱花花柄的组织培养》(2006)文献中描述的最佳配方MS+BA3.5+NAA0.05，结果在我们试验过程中与他们描述的一样很易形成愈伤，但愈伤不能分化出不定芽，且后期易玻璃化。
2号或3号培养基采用贺爱利等人在《樱花组织培养研究进展》(2010)提到的黄守印的较好配方1/2MS+BA1.0+IBA0.01或1/2MS+KT1.0+IBA0.01，在我们的实验过程中发现有一半的外植体可以产生愈伤，但愈伤分化出不定芽较少，为3.4和2.8；
4号培养基采用孟月娥等人在《一种红叶樱花组培快繁培养基及组培快繁方法》(2012)中提到的MS+BA1.0+3％蔗糖，试验结果是大部分可以产生愈伤，但不能分化出不定芽。
5号培养基采用蒋细旺等人在《一种樱花组织培养和快速繁殖方法》中采用的最佳配方WPM+KT1.5+IBA0.2+3％蔗糖，试验结果是不定芽分化率比较低，只有2.1。
6-9号培养基是我们根据实验室其他木本植物的成功实例所进行的递度配方，近一半外植体能产生愈伤，很少的愈伤也能产生不定芽，但不定芽分化率都不超过5。
10号培养基是我们在11-13号培养基的基础上，选择单用TDZ所做的对比实验，试验结果表明，单用TDZ时，出愈率不超过50％，而且不定芽分化率仅为2.8；
11-13号培养基是我们在10号培养基的基础上，额外添加0.5、1.0、2.0三个递度的BA，发现随着BA浓度的增加，愈伤诱导及不定芽分化率都不断提高，但当BA超过一定浓度时，愈伤组织诱导率增加，但愈伤不定芽分化率反而又下降，因此我们将MS+BA0.5-1.0+TDA2.0+NAA0.02作为我们的最佳培养基激素组合。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，在不脱离本发明精神实质的情况下，都属于本发明的保护范围。
Claims (6)
1.染井吉野樱组培快繁方法，其特征在于，所述方法以染井吉野樱半木质化单芽茎段或经扦插繁殖萌发的小芽为外植体，经过外植体处理和消毒、芽初代诱导培养、增殖壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽步骤建立染井吉野樱组织培养快繁体系。
2.根据权利要求1所述的染井吉野樱组培快繁方法，其特征在于，所述外植体处理和消毒步骤包括：
A、选取健壮吉野樱植株半木质化单芽茎段作为外植体，先用洗衣粉水浸泡20-30min，再轻轻清洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用流动的自来水冲洗2-4h后置于超净工作台中；在鼓风状态下于超净工作台上先用质量分数70-75％乙醇消毒8-15s后用无菌水清洗3-6次，再用质量分数0.1％升汞溶液消毒8-15min后用无菌水洗4-6次，最后用无菌纱布或无菌滤纸吸干外植体表面水珠后转接到芽初代诱导培养基中培养；或
B、于冬末春初在壮龄树上选择一年生、生长健壮、生活力旺盛的发育枝条，剪有饱满芽的木质化或半木质化枝条作为插穗，插穗长度为10—15厘米，有2-3个芽；温室高架苗床上下铺电加热设施，上铺10cm厚的基质珍珠岩，扦插之前基质及插穗都用1000ppm浓度的多菌灵或福尔马林溶液消毒；插好之后采用电加热促进土壤升温至22-25℃从而加快插穗发芽，同时10天后对穗条用500ppm浓度的多菌灵溶液进行喷雾消毒减少有害微生物到最低状态；待20天新芽长到5-7cm左右时，切取几近未木质化的单芽茎段或顶芽作为外植体按A步骤进行常规消毒后置于超净工作台中；在鼓风状态下在超净工作台上先用70-75％酒精消毒3s后，用无菌水清洗3-6次，再用0.1％升汞溶液消毒8min后用无菌水洗4-6次，最后用无菌纱布或无菌滤纸吸干外植体表面水珠后转接到芽初代诱导培养基中培养。
3.根据权利要求1所述的染井吉野樱组培快繁方法，其特征在于，所述芽初代诱导培养步骤为：
将经过外植体处理和消毒处理后的染井吉野樱单芽茎段或顶芽切成1.5－2.5cm小段并接种到芽诱导培养基中，在MS+BA0.5－1.0mg/L+NAA0.02mg/L+TDZ2.0－3.0mg/L+蔗糖20－30克/L+琼脂5.5-6.5克/L中，先在22-25℃条件下全暗培养5-7天，然后置于每天光照10-12小时，光照强度2000lx的培养室中培养，25天左右继代一次，直至诱导形成丛生芽。
4.根据权利要求1所述的染井吉野樱组培快繁方法，其特征在于，所述增殖壮苗培养步骤为：
将经过芽初代诱导培养获得的丛生芽分切成芽块至增殖壮苗培养基(1/2MS+BA0.5－0.8+NAA0.05-0.08)上进行继代培养，接种后置于每天光照10-12小时，光照强度为2000lx，培养温度22-25℃的条件下培养，多次反复切割进行继代培养，得到健壮丛生芽。
5.根据权利要求1所述的染井吉野樱组培快繁方法，其特征在于，所述生根培养步骤为：
将增殖壮苗培养获得的高度约为2.5-3.5cm的健壮芽分切接种到生根培养基(1/2MS+NAA0.01-0.02)上进行生根培养，接种后先在22-25℃左右条件下暗培养0-5天，然后置于光照10-12小时，光照强度2000lx，培养温度为22-25℃左右的培养室中培养30-35天即可出瓶。
6.根据权利要求1所述的染井吉野樱组培快繁方法，其特征在于，所述炼苗移栽步骤为
将经生根培养后获得的高约3.5-5.5cm、生长健壮、根系粗壮、叶色浓绿的生根试管苗去盖置于培养室光下炼苗3-5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，并用800-1000PPM多菌灵浸泡10min后栽入由泥炭土：珍珠岩＝7：3混合并用1000PPM多菌灵进行喷淋过的基质中；放于温室培养，栽后前5-10天精心管护，每天至少分5次给幼苗喷雾浇水，保持叶面湿度，移栽成活率达80％以上。待幼苗成活后再移栽大田。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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