CN116267619A - 一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，包括：选取垂柳扦插苗的幼嫩茎段或带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条，作为垂柳茎段外植体；垂柳扦插苗的幼嫩茎段或带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条进行自来水冲洗30min；将冲洗后的垂柳茎段外植体转移至无菌瓶，并进行消毒数次；采用腋芽增殖诱导培养基进行垂柳茎段外植体增殖诱导，培育25～35天，得到带有增殖丛生不定芽的茎段；将带有增殖丛生不定芽的茎段放置在无菌的滤纸上，并将增殖丛生不定芽的茎段上的丛生芽切除，得到不定芽段；并将丛生芽分开成单株；选择生长健壮的不定芽段转接入生根培养基中，诱导生根；最终得到垂柳无菌苗。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其是一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法。
背景技术
柳属(Salix)植物属于被子植物门杨柳科(Salicaceae)，全世界约520多种，主产北半球温带地区，寒带次之。我国是柳属植物的重要分布区，各省区均产。柳属植物生长迅速、易于营养繁殖、根系对水分和土壤耐受范围广、抗逆性强、生物量大，其是极具观赏、经济与生态价值的树种。垂柳(SalixbabylonicaL.)为高大落叶乔木，生长迅速、枝条细长、分布广泛、生命力强，是极受欢迎的园林绿化树种，也是固堤护岸的重要树种。
植物组织培养是一项基于植物细胞全能性理论发展起来的无性繁殖新技术。植物组织培养具有遗传性一致、培养条件可控性强、可周年生产、繁殖效率高及管理方便等诸多优点。目前，现有现有技术中通过植物组织培养得到完整植株包括两种途径：一是利用带腋芽的茎段或叶片等离体器官直接分化培养获得不定芽，进而获得完整植株；二是通过由外植体脱分化形成愈伤组织，再由愈伤组织再分化形成不定芽并获得完整植株。由于腋芽处于萌动阶段，通过诱导腋芽萌发获得完整植株较其他外植体培养材料更容易，且所需时间更短。基于此，保留腋芽的茎段为不定芽诱导的最佳材料。
柳树繁育技术主要依赖于种子繁育和扦插繁育。其中，柳树种子细小、存活时间短，因此柳树种子繁育技术成活率低，且柳树多为杂合体，遗传性状不稳定，故种子繁育不易保留亲本的优良性状。现阶段柳树繁育主要依赖于扦插繁育，扦插时间多为春秋季节，春季在3-4月份，秋季在9月份左右，大多数柳树都具有较高的扦插成活率。然而，柳树扦插繁育不能实现种苗的工厂化、规模化和商品化，且受扦插时间和枝条数量受限制。柳树组织培养可以缩短繁殖周期，保留亲本的优良性状、快速繁殖出根系发达的无菌苗，且无菌苗的移栽不受季节的限制，有效解决了种子繁育与扦插繁育存在的问题。目前多种柳树通过外植体脱分化形成愈伤组织的组培体系已建立，但由愈伤组织再分化形成不定芽始终是柳树再生体系建立的重要难题。
因此，急需要提出一种工艺简单、培养周期短的采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，本发明采用的技术方案如下：
一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，其包括以下步骤：
垂柳茎段外植体选择：选取垂柳扦插苗的幼嫩茎段或带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条，作为垂柳茎段外植体；
垂柳茎段外植体消毒：垂柳扦插苗的幼嫩茎段或带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条进行自来水冲洗30min；将冲洗后垂柳茎段外植体转移至无菌瓶，并进行消毒数次；
腋芽增殖诱导：采用腋芽增殖诱导培养基进行垂柳茎段外植体增殖诱导，培育25～35天，得到带有增殖丛生不定芽的茎段；
不定芽生根培养：将带有增殖丛生不定芽的茎段放置在无菌的滤纸上，并将增殖丛生不定芽的茎段上的丛生芽切除，得到不定芽段；并将丛生芽分开成单株；选择生长健壮的不定芽段转接入生根培养基中，诱导生根；最终得到垂柳无菌苗。
优选地，所述垂柳茎段外植体选择中，垂柳扦插苗的幼嫩茎段采用春季或秋季健壮母树的1-2年生枝，插条长约15cm。
进一步地，所述垂柳扦插苗的幼嫩茎段的上切口距垂柳扦插苗的幼嫩茎段上的第一个腋芽1厘米，切口平滑；且所述垂柳扦插苗的幼嫩茎段的下切口斜切。
进一步地，采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，还包括：将垂柳扦插苗的幼嫩茎段放入霍格兰营养液水培或扦插于营养土与蛭石混合基质，并添加生根粉促进插条生根。
进一步地，所述带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条采用末端枝条；将末端枝条去除叶片，并静置于装有自来水的组培瓶中。
优选地，所述消毒过程包括：
采用75％乙醇消毒30s，无菌水清洗2-3遍，去除外植体上残余乙醇；
采用1％次氯酸钠溶液，垂柳扦插苗的幼嫩茎段的顶端幼嫩茎段消毒5min，或采用1％次氯酸钠溶液对带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条消毒8min；
采用无菌水清洗5-6遍，去除外植体上残余次氯酸钠。
进一步地，所述腋芽增殖诱导培养基由以下重量份的物质组成：
4.74g/L的MS；
30g/L的蔗糖；
6.5g/L的琼脂；
0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤；
0.15mg/L的吲哚丁酸。
进一步地，所述生根培养基由以下重量份的物质组成：
2.37g/L的1/2MS；
20g/L的蔗糖；
6.5g/L的琼脂；
0.2mg/L的萘乙酸。
进一步地，还包括：将装有不定芽生根的无菌组培瓶放置在人工气候箱中培养20～25天；所述人工气候箱的光照强度为10000Lux，光照日均时长为14小时，温度为25℃，湿度为70％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的垂柳腋芽增殖扩繁培养方法仅需50天左右即可获得大量无菌苗，具有方法简便、重复性高、培养周期短、再生苗健壮的优点。本发明可解决垂柳扦插繁育中扦插时间与扦插条数量的限制，大量繁育无菌苗。获得的无菌苗可继续用于后续继代培养快速扩繁，或炼苗与移栽，也可为后续垂柳愈伤组织诱导、愈伤组织再分化诱导生成不定芽及遗传转化技术提供无菌苗获得的理想实验体系。
(2)本发明采用腋芽增殖诱导，其设置有MS、蔗糖、琼脂、6BA和IBA，其好处在于，可简单、快速地获得大量垂柳不定芽。
(3)本发明巧妙地采用生根培养基进行诱导生根，其好处在于可快速使增殖诱导的垂柳不定芽完成生根，获得完整的垂柳无菌苗植株。
综上所述，本发明具有工艺简单、培养周期短、再生苗健壮等优点，在植物组织培养技术领域具有很高的实用价值和推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需使用的附图作简单介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对保护范围的限定，对于本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的垂柳腋芽增殖诱导快速扩繁获得垂柳无菌苗的过程。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更为清楚，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施方式包括但不限于下列实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本本实施例中，术语“和/或”，仅仅是一种描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。
本实施例的说明书和权利要求书中的术语“第一”和“第二”等是用于区别不同的对象，而不是用于描述对象的特定顺序。例如，第一目标对象和第二目标对象等是用于区别不同的目标对象，而不是用于描述目标对象的特定顺序。
在本申请实施例中，“示例性的”或者“例如”等词用于表示作例子、例证或说明。本申请实施例中被描述为“示例性的”或者“例如”的任何实施例或设计方案不应被解释为比其它实施例或设计方案更优选或更具优势。确切而言，使用“示例性的”或者“例如”等词旨在以具体方式呈现相关概念。
在本申请实施例的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是指两个或两个以上。例如，多个处理单元是指两个或两个以上的处理单元；多个系统是指两个或两个以上的系统。
如图1所示，本实施例提供了一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，其主要操作步骤包括：垂柳茎段外植体选择、垂柳外植体的消毒、腋芽增殖诱导及不定芽生根培养。图1(A)是腋芽诱导增殖初期；图1(B)是诱导增殖的丛生芽；图1(C)是生根培养获得的再生苗；图1(D)是不定芽根生长情况。
具体步骤如下：
第一步，垂柳茎段外植体选择：
本实施例可用垂柳扦插苗的幼嫩茎段或采集带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条，通过消毒后进行腋芽增殖诱导，也可直接用垂柳无菌苗进行腋芽增殖诱导。垂柳扦插苗及非木质化垂柳幼嫩枝条的采集品种及采集时间无特殊限制。扦插条最宜采自春季或秋季健壮母树的1-2年生枝，插条长约15cm，上切口距第一个腋芽1厘米，切口平滑，下切口斜切，直接用霍格兰营养液水培或扦插于营养土与蛭石混合基质(1:1)，培养前期可添加适量生根粉促进插条生根。水培培养材料扦插条需每2天更换一次霍格兰营养液。另外，非木质化垂柳幼嫩枝条最宜选择末端枝条，及时去除叶片后静置于装有自来水的组培瓶，防止枝条失水。
第二步，垂柳外植体的消毒：
直接用无菌垂柳组培苗诱导腋芽增殖时，无需进行消毒处理。对于垂柳扦插苗的幼嫩茎段或非木质化幼嫩枝条需首先进行消毒处理。剪取1个月大健壮垂柳扦插苗顶端幼嫩茎段或非木质化幼嫩枝条(长约6cm)作为外植体，用自来水冲洗30min；然后于超净工作台中用无菌的镊子将其转移到无菌瓶，第一次消毒用75％乙醇消毒30s，无菌水清洗2-3遍以去除外植体上残余乙醇；第二次消毒用1％次氯酸钠溶液(有效氯含量)，对于室内培养的垂柳扦插苗顶端幼嫩茎段可消毒5min，对于室外直接采集的非木质化幼嫩枝条更优选为消毒8min，后用无菌水清洗5-6遍以去除外植体上残余次氯酸钠，最后用无菌滤纸吸干表面水分后得到消毒处理的垂柳扦插苗顶端幼嫩茎段或非木质化幼嫩枝条外植体。
第三步，腋芽增殖诱导：
对于腋芽增殖诱导，若选用垂柳无菌苗，则需首先将无菌的镊子将无菌苗从组培瓶中取出，放置在无菌滤纸上，用无菌解剖刀切除根系并快速将无菌苗的所有叶片去除备用。用无菌解剖刀将无菌苗或已消毒的茎段切割成保留腋芽(腋芽数量≥1)，长约1.5-2cm的小段，用无菌的镊子接种至无菌的腋芽增殖诱导固体培养基。
在本实施例中，该培养基主要组成为Murashige&Skoog(简称MS)(4.74g/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(6.5g/L)+6BA(0.5mg/L)+IBA(0.15mg/L)，培养基的pH5.8。其中，用于pH调整的试剂选用本领域常用的盐酸和氢氧化钠即可。茎段接种时形态学上端向上，正插入培养基中，并将腋芽暴露在外。每个组培瓶可接种6-8个茎段，接种完成后于人工气候箱中培养，光照10000Lux(14小时/天)，温度25℃，湿度70％。茎段在腋芽增殖诱导培养基上培养约10天时，腋芽即可萌芽并开始增殖，此时增殖系数为2-4，且插入培养基中的茎段下端会形成膨大的愈伤组织。培养至第15天左右时，更换一次培养基，以保证培养基为腋芽增殖提供充分营养，此次更换培养基时，用无菌的镊子将含有增殖的不定芽的茎段取出插入新鲜的无菌腋芽增殖诱导培养基，茎段下端膨大的愈伤组织不必切除，每个组培瓶接种3-4个茎段为宜。当茎段在腋芽增殖诱导培养基上培养约30天时，增殖系数为8-11，此时不定芽可生长至约2-3cm。
第四步，不定芽生根培养：
待腋芽诱导增殖培养约30天左右后，用无菌镊子将带有增殖丛生不定芽的茎段从组培瓶中取出，放置在无菌的滤纸上，用无菌解剖刀将丛生芽从茎段上切除，用无菌镊子将丛生芽分开成单株，选择生长健壮的不定芽转接入生根培养基中，诱导生根。生根培养基主要组成为1/2MS(2.37g/L)+蔗糖(20g/L)+琼脂(6.5g/L)+NAA(0.2mg/L)，pH5.8。用于pH调整的试剂同样可选用本领域常用的盐酸和氢氧化钠。每个组培瓶中最宜接种2-3株。分离丛生芽与接种过程应尽量操作迅速，防止丛生芽失水。若不能及时完成接种，可将分离出来的不定芽暂时放于装有无菌水的无菌组培瓶中。完成接种后于人工气候箱中培养，光照10000Lux(14小时/天)，温度25℃，湿度70％。约7天左右，不定根即可开始萌发，约20天左右即可生成根系发达的无菌苗。获得的生根无菌苗可进行移栽炼苗培养，或去掉叶片后按上述腋芽增殖诱导操作接种至腋芽增殖诱导培养基，继续用于后续继代培养快速扩繁。
在本实施中，MS培养基成分如表1所示：
表1MS培养基成分表
另外，本实施例的1/2MS培养基成分如表2所示：
表21/2MS培养基成分表
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而作出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
垂柳茎段外植体选择：选取垂柳扦插苗的幼嫩茎段或带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条，作为垂柳茎段外植体；
垂柳茎段外植体消毒：垂柳扦插苗的幼嫩茎段或带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条进行自来水冲洗30min；将冲洗后垂柳茎段外植体转移至无菌瓶，并进行消毒数次；
腋芽增殖诱导：采用腋芽增殖诱导培养基进行垂柳茎段外植体增殖诱导，培育25～35天，得到带有增殖丛生不定芽的茎段；
不定芽生根培养：将带有增殖丛生不定芽的茎段放置在无菌的滤纸上，并将增殖丛生不定芽的茎段上的丛生芽切除，得到不定芽段；并将丛生芽分开成单株；选择生长健壮的不定芽段转接入生根培养基中，诱导生根；最终得到垂柳无菌苗。
2.根据权利要求1所述的一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，其特征在于，所述垂柳茎段外植体选择中，垂柳扦插苗的幼嫩茎段采用春季或秋季健壮母树的1-2年生枝，插条长约15cm。
3.根据权利要求1或2所述的一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，其特征在于，所述垂柳扦插苗的幼嫩茎段的上切口距垂柳扦插苗的幼嫩茎段上的第一个腋芽1厘米，切口平滑；且所述垂柳扦插苗的幼嫩茎段的下切口斜切。
4.根据权利要求3所述的一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，其特征在于，还包括：将垂柳扦插苗的幼嫩茎段放入霍格兰营养液水培或扦插于营养土与蛭石混合基质，并添加生根粉促进插条生根。
5.根据权利要求1所述的一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，其特征在于，所述带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条采用末端枝条；将末端枝条去除叶片，并静置于装有自来水的组培瓶中。
6.根据权利要求1所述的一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，其特征在于，所述消毒过程包括：
采用75％乙醇消毒30s，无菌水清洗2-3遍，去除外植体上残余乙醇；
采用1％次氯酸钠溶液，垂柳扦插苗的幼嫩茎段的顶端幼嫩茎段消毒5min，或采用1％次氯酸钠溶液对带腋芽的非木质化垂柳幼嫩枝条消毒8min；
采用无菌水清洗5-6遍，去除外植体上残余次氯酸钠。
7.根据权利要求1所述的一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，所述腋芽增殖诱导培养基由以下重量份的物质组成：
4.74g/L的MS；
30g/L的蔗糖；
6.5g/L的琼脂；
0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤；
0.15mg/L的吲哚丁酸。
8.根据权利要求1所述的一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，所述生根培养基由以下重量份的物质组成：
2.37g/L的1/2MS；
20g/L的蔗糖；
6.5g/L的琼脂；
0.2mg/L的萘乙酸。
9.根据权利要求1或8所述的一种采用腋芽增殖快速扩繁获得垂柳无菌苗的方法，还包括：将装有不定芽生根的无菌组培瓶放置在人工气候箱中培养20～25天；所述人工气候箱的光照强度为10000Lux，光照日均时长为14小时，温度为25℃，湿度为70％。
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