CN116530413B - 一种欧洲冬青‘FeroxArgentea’离体快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁方法，包括以下步骤：外植体取材；消毒灭菌；启动培养；增殖培养；生根培养；炼苗移栽。本发明首次构建了高效的欧洲冬青离体快繁技术，该技术条件下，试管苗增殖率2.62、生根率100％、移栽成活率74.58％，这将为欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁和产业化推广提供技术支撑。与欧洲冬青的传统繁殖方法(播种、嫁接)相比，该技术属于试管内无菌培养，繁殖过程不受时间限制，能够实现周年生产。
Description
技术领域：
本发明涉及繁殖方法，具体涉及一种欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁方法。
背景技术：
欧洲冬青别称枸骨叶冬青(Ilex aquifolium)，又名英国冬青、圣诞树，是冬青科冬青属常绿小乔木或灌木，原产于欧洲南部、中部及西北部，为北极第三纪孑遗物种。欧洲冬青‘Ferox Argentea’是欧洲冬青观赏性极佳的一个品种，具有极高的园林观赏价值，其叶片革质光滑且四季常绿，边缘金黄，冬季鲜红的果实掩映在苍翠的枝叶间，极为优美，在园林中可孤植、作绿篱或盆栽。此外，欧洲国家多用其带尖绿叶和红果枝条制作花环来装饰圣诞节，所以欧洲冬青也被称作圣诞冬青，在盆花、切枝、以及园林绿化中拥有巨大的应用前景。如何实现快速大量繁殖是欧洲冬青资源开发利用面临的重要问题，目前该树种主要是采用传统的播种和嫁接繁殖。
欧洲冬青‘Ferox Argentea’的播种繁殖效率极低，前人通过形态解剖、电镜扫描及种皮透水性测定等方法研究发现欧洲冬青‘Ferox Argentea’种子具有休眠特性，且种子种皮分为外种皮、中种皮、内种皮3层，其中外种皮表面角质化且结构复杂，外种皮中的厚壁细胞及栅栏组织存在阻碍胚与外界进行水分与气体交换的可能，进而影响种子萌发。
嫁接也是木本植物繁殖的重要方法，前人研究主要是从不同嫁接方法、不同接穗部位、不同品种和不同砧木这三个方面进行欧洲冬青嫁接技术的探索：(1)欧洲冬青的嫁接通常于春季采用切接或腹接方法为好，成活率、成苗率都能达到90％左右，而采用秋季嵌芽接会降低其成活率，仅为79％左右，且秋季嵌芽接会出现芽片与砧木虽然愈合，但芽片上的芽不萌发的现象，嫁接苗的成苗率仅为51％左右。(2)嫁接时宜选取中部或基部的1年生枝条作为接穗最好，其成活率高达到90％左右，而用梢部枝条嫁接成活率最低，只有54％。(3)欧洲冬青系列品种嫁接时，不同品种的嫁接成活率存在较大差异，这可能与品种基因型、接穗粗壮程度以及接穗与砧木组合的亲和力有关。(4)嫁接时优选构骨为砧木，尽量选择粗壮的接穗与粗壮的砧木进行嫁接，能有效促进嫁接苗的生长。
综上可见，传统的播种和嫁接繁殖效率低、周期长，这不仅限制了欧洲冬青资源的开发利用，更是导致引种资源极少的根本原因。离体快繁是实现植物快速大量繁殖的重要技术手段，但目前欧洲冬青的离体快繁技术研究仍处于空白。
同时现有技术中存在着以下缺点：(1)传统繁殖操作受季节限制：欧洲冬青最佳播种时间为2-3月份，最佳嫁接时间为春季，无法实现周年生产。(2)播种和嫁接繁殖周期长：欧洲冬青种子从播种到萌发大约需2个月，再从幼苗到成年植株大约需2-3年；嫁接成苗速度较慢，大约需3个月。(3)播种和嫁接繁殖率低：欧洲冬青种子存在休眠特性，萌发速度慢，萌发率较低；嫁接需消耗大量的接穗和砧木，占用较大空间。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁方法，为实现欧洲冬青‘Ferox Argentea’的快速大量繁殖提供技术支撑。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁方法，包括以下步骤：
(1)外植体取材：早春3-4月，选取健壮，无病虫害的母株，切取幼嫩的一年生具腋芽茎段作为外植体。
(2)消毒灭菌：将茎段用流水冲洗30-60min，然后洗涤剂浸泡15-20min，再用流水冲洗20-30min。随后，将材料转至超净工作台用75％酒精灭菌25-35s，然后用3-5％次氯酸钠灭菌10min-15min，最后无菌水冲洗3～4次作为接种材料。
(3)启动培养：将消毒灭菌后的茎段切分为含有1-2个节的小茎段，将其接种于启动培养基WPM+BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.5g/L，pH＝5.8。培养温度25±1℃，光照强度32.4mol·m-2·s-1，光周期14h光照/10h黑暗。
(4)增殖培养：培养基为特制培养基+0.5mg/L BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.8g/L琼脂，pH 5.8。特制培养基大量元素配方为K2SO4 495.00mg·L-1、NH4NO31200.00mg·L-1、MgSO4·7H2O 529.10mg·L-1、KH2PO4 362.27mg·L-1与Ca(NO3)2·4H2O1279.92mg·L-1，其余成分与WPM培养基一致。初代培养50d后，切取外植体上茎长≥1cm的健壮腋芽进行增殖培养，培养温度25±1℃，光照强度32.4mol·m-2·s-1，光周期14h光照/10h黑暗。
(5)生根培养：培养基为特制培养基+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.8g/L琼脂，pH 5.8。特制培养基大量元素配方为NH4NO3 412.5mg·L-1、KNO3 935.75mg·L-1、CaCl2·2H2O 173.14mg·L-1、MgSO4·7H2O 92.5mg·L-1、KH2PO4 42.5mg·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致。继代培养50d后，切取无根试管苗接入生根培养基，培养温度25±1℃，光照强度32.4mol·m-2·s-1，光周期14h光照/10h黑暗。
(6)炼苗移栽：将生根的欧洲冬青‘Ferox Argentea’试管苗开盖炼苗3天后，移栽入混合基质，即泥炭:蛭石:珍珠岩＝1:1:1(v/v/v)，浇水定根。于驯化室内培养，培养温度25±1℃，光照强度32.4mol·m-2·s-1，光周期14h光照/10h黑暗。
有益效果:
(1)首次构建了高效的欧洲冬青离体快繁技术，该技术条件下，试管苗增殖率2.62、生根率100％、移栽成活率74.58％，这将为欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁和产业化推广提供技术支撑。
(2)与欧洲冬青的传统繁殖方法(播种、嫁接)相比，该技术属于试管内无菌培养，繁殖过程不受时间限制，能够实现周年生产。
附图说明：
图1为欧洲冬青‘Ferox Argentea’响应面优化增殖培养基试验；A：增殖培养前的试验材料(约1cm欧洲冬青‘Ferox Argentea’健壮试管苗)；B：试验生长表现最差组试管苗(第8组)；C：预测最优配方验证组试管苗；D：对照组试管苗(WPM培养基原配方)。
图2为欧洲冬青‘Ferox Argentea’响应面优化生根培养基试验；A：对照组试管苗(1/2MS培养基原配方)；B：试验生根表现最差组试管苗(第20组)；C：试验生根表现最佳组试管苗(第9组)；D：预测最优配方验证组试管苗。
具体实施方式：
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1
(1)试验材料
于2021年4月初，自南京林业大学树木园采集欧洲冬青‘Ferox Argentea’幼嫩一年生具腋芽茎段。将嫩枝切除叶片后置于广口瓶中，用纱布包好瓶口，于自来水冲洗1h，加入洗洁精溶液浸泡20min，再流水冲洗20min，吸干水分放置于超净工作台，先用75％酒精消毒25s左右，5％NaClO溶液处理6-7min，再用5％NaClO溶液处理6-7min，最后无菌水冲洗3次后，将嫩枝切分为含1-2个节的小茎段作为试验材料。
(2)试验方法
1)启动培养
将消毒灭菌后的茎段接种于WPM培养基，附加BA 0.5mg/L
+NAA 0.1mg/L+蔗糖30.0g/L+琼脂6.5g/L，pH＝5.8。培养温度25±1℃，光周期14h·d-1，光照强度32.4mol·m-2·s-1。启动培养50d后，观察试管苗的诱导和生长状况。
2)增殖培养
以启动培养获得的丛生芽为材料，切取外植体上茎长≥1cm的健壮腋芽，将切取好的单芽接种于各处理增殖培养基上，添加0.5mg/L BA+0.05mg/L NAA+蔗糖30.0g/L+琼脂6.5g/L，pH＝5.8。将WPM培养基中五种大量元素无机盐作为自变量设计，浓度范围为原WPM培养基对应各无机盐浓度0.5到3.0倍。利用Design-Expert响应面最佳优化试验设计，获得32个试验组合，以模式WPM培养基大量元素无机盐成分作为对照(表1)。每个处理设3次重复，每次重复接种20株试管苗。增殖培养50d后，统计增殖率、株高、芽质量等级。运用Design-Expert 12.0软件对试验结果进行分析。以增殖率、株高、芽质量等级为目标函数建立模型，根据模型计算预测目标值对应各因素的置信区间，通过试验进行验证，获得优化配方。获得优化配方后，对该最优处理进行验证试验，试验设3次重复，每次重复20株试管苗，50d后统计平均增殖率、株高、芽质量等级。
试验材料置于南京林业大学风景园林江苏省重点实验室组培室培养，培养温度25±1℃，光照周期14h/d，光照强度32.4mol·m-2·s-1(荧光灯)。
表1增殖培养基五种大量元素无机盐最优化试验水平表
注：表中数据为原WPM培养基对应各无机盐浓度倍数
3)生根培养
以增殖培养获得的丛生芽为材料，切取外植体上茎长≥1cm的健壮腋芽，将切取好的单芽接种于各处理生根培养基上，添加0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+蔗糖30.0g/L+琼脂6.5g/L，pH＝5.8。将1/2MS培养基中五种大量元素无机盐作为自变量设计，浓度范围为原1/2MS培养基对应各无机盐浓度0.5到3.0倍。利用Design-Expert响应面最佳优化试验设计，获得32个试验组合，以模式1/2MS培养基大量元素无机盐成分作为对照(表2)。每个处理设3次重复，每次重复接种20株试管苗。生根培养50d后，统计生根率、平均根长、平均根数、愈伤组织质量及根质量评价。运用Design-Expert 12.0软件对试验结果进行分析。以生根率、平均根长、平均根数、愈伤组织质量及根质量评价为目标函数建立模型，根据模型计算预测目标值对应各因素的置信区间，通过试验进行验证，获得优化配方。获得优化配方后，对该最优处理进行验证试验，试验设3次重复，每次重复20株试管苗，50d后统计生根率、平均根长、平均根数、愈伤组织质量、根质量。
试验材料置于南京林业大学风景园林江苏省重点实验室组培室培养，培养温度25±1℃，光照周期14h/d，光照强度32.4mol·m-2·s-1(荧光灯)。
表2生根培养基五种大量元素无机盐最优化试验水平表
注：表中数据为原1/2MS培养基对应各无机盐浓度倍数
4)炼苗移栽
将生根阶段中生长至一定高度的，根系健壮的组培苗挑出，将培养瓶瓶口打开，放在组培室架上炼苗3d，以使其适应实验室环境，然后用镊子将试管苗轻轻取出，放在无菌水中洗去琼脂，在冲洗过程中注意不能碰断根部，将洗好的组培苗移入人工气候培养箱，在此过程中注意植株底部间的根部不能缠绕在一起。
将处理好的组培苗进行不同基质移栽，设4个不同基质处理：①泥炭土+蛭石(1：1)；②珍珠岩+蛭石(1∶1)；③珍珠岩+泥炭土(1∶1)；④珍珠岩+泥炭土+蛭石(1：1：1)。每个处理3次重复，每次重复至少25株，移栽至长方形塑料穴盘(24cm×80cm)，每个穴盘中装满移栽基质，栽植14d后开始浇施三元复合肥，保持栽培基质湿润。移栽苗至于人工气候室管理，培养温度25±1℃，光照周期14h/d，光照强度32.4mol·m-2·s-1(荧光灯)，生长30d后统计成活率、株高和叶片数。
(3)结果与分析
1)启动培养
启动培养50d后，WPM培养基中外植体基部愈伤组织较大，诱导出的新梢较长，新叶开展，能够表现出品种颜色及特点，苗生长粗壮。污染率较低，诱导成功率达到100％，成活率达到92％左右。
2)专用增殖培养基的构建
按照表1进行33组试验，50d后统计试验数据可得增殖率、株高和芽质量等级试验数据如表3。
表3不同处理对试管苗增殖影响
注：增殖率＝总芽数/总株数，株高为直尺测量试管苗根颈部到顶部之间的距离，芽质量等级分为3级，分别为：3(茎粗壮、叶片伸展)、2(茎健壮、叶片细长)、1(茎细弱、叶片细小)，下同。
通过Design Expert 12.0拟合试验数据，得出增殖率、株高、芽质量与增殖培养基五种大量元素无机盐的二次多项式：
(1)Multiplication coefficient＝2.1792+0.0038A+0.0523533B+0.0564C+0.1153D+0.0826E+0.0621AB-0.1381AC-0.0081AD-0.1206AE-0.0621BC+0.0199BD-0.0684BE+0.0094CD+0.0302CE+0.1129DE-0.073341A2 -0.01124B2-0.2925C2+0.2334D2-0.4180E2
(2)Plant height＝2.6849+0.0277A-0.0381B+0.0664C+0.2240D+0.1618E+0.0123AB+0.0395AC-0.1054AD-0.0529AE+0.0411BC+0.0481BD-0.0629BE+0.0090CD-0.1590CE-0.0715DE+0.3002A2-0.1182B2-0.2745C2-0.1007D2-0.1868E2
(3)Bud quality＝2.5008+0.0198A-0.0088B+0.1268C+0.3241D+0.2598E-0.1901AB+0.0462AC-0.1783AD+0.0601AE+0.0361BC+0.1220BD+0.1099BE+0.1185CD-0.1758CE-0.0786DE+0.0412A2-0.0082B2-0.3408C2-0.1320D2-0.3621E2
本研究中对照组的增殖率、株高、芽质量实际平均值为1.780、2.440cm、1.780，根据对增殖阶段试管苗各生长指标需求，将预测模型算法中三项响应值增殖率、株高、芽质量的重要程度设定为增殖率＞株高＞芽质量，设定后通过Design-Expert 12.0中上述(1)(2)(3)二次多项式模型综合预测得到欧洲冬青‘Ferox Argentea’增殖阶段大量元素无机盐最优配方浓度倍数为：K2SO4＝0.500，MgSO4·7H2O＝1.430，KH2PO4＝2.131，NH4NO3＝3.000，Ca(NO3)2·4H2O＝2.302，其增殖率、株高、芽质量预测值分别为2.584、3.229cm、2.889。对该最优配方进行验证试验，平均增殖率、株高、芽质量为2.617、3.140cm、2.760，与预测值无显著差异，并显著优于对照组(1.786、2.447cm、1.780)(P＜0.05)(图1)。
3)专用生根培养基的构建
按照表2进行33组试验，50d后统计试验数据可得生根率、平均根长、平均根数、愈伤组织质量、根质量试验数据如表4。
表4不同处理对试管苗生根影响
注：生根率＝生根苗数/接种总苗数×100％，根长为直尺测量，愈伤组织质量等级分为3级，分别为：1愈伤组织极少；2基部膨大，有轻微愈伤组织；3基部严重愈伤化，根从愈伤组织发出，根质量等级分为3级，分别为：1根粗壮；2根健壮；3根细弱。
通过Design Expert 12.0拟合试验数据，得出生根率、平均根长、平均根数、根质量与增殖培养基五种大量元素无机盐的一次多项式，愈伤组织质量与增殖培养基五种大量元素无机盐的二次多项式：
(1)Rooting rate＝1.3852-0.2068A-0.1928B+0.0032C-0.0034D-0.1236E
(2)Avg root length＝0.7631-0.1394A-0.0591B-0.0380C-0.0160D+0.0086E
(3)Avg root number＝1.3852-0.2068A+0.0032B-0.0034C-0.1236D+0.0021E
(4)Callus quality＝-0.1064+0.8979A+1.1547B+0.1667C-0.2621D-0.3389E-0.04072AB+0.1863AC+0.0674AD-0.1854AE-0.1685BC-0.0432BD-0.2118BE-0.0002CD-0.0852CE-0.0352DE-0.2530A2-0.0627B2-0.0412C2+0.1160D2+0.3381E2
(5)Root quality＝2.4377-0.3546A-0.2240B+0.0942C-0.0745D+0.01221E
本研究中对照组的生根率、平均根长、平均根数、愈伤组织质量及根质量评价实际平均值为0.910、0.382cm、7.800、2.330、2.360，根据对生根阶段试管苗各生长指标需求，将预测模型算法中五项响应值的重要程度设定为生根率＞平均根长、平均根数、愈伤组织质量及根质量评价，设定后通过Design-Expert12.0中上述(1)(2)(3)(4)(5)二次多项式模型综合预测得到欧洲冬青‘Ferox Argentea’生根阶段大量元素无机盐最优配方浓度倍数为：NH4NO3＝0.500，KNO3＝0.985，CaCl2·2H2O＝0.787，MgSO4·7H2O＝0.500，KH2PO4＝0.500，其生根率、平均根长、平均根数、愈伤组织质量及根质量评价预测值分别为1.000、0.648cm、7.682、1.000、2.931。对该最优配方进行验证试验，生根率、平均根长、平均根数、愈伤组织质量及根质量评价为1.000、0.627cm、7.792、1.000、2.840，与预测值无显著差异，并显著优于对照组(0.910、0.382cm、7.800、2.330、2.360)(P＜0.05)(图2)。
4)炼苗移栽
表5不同处理对试管苗移栽影响
注：误差使用标准误，下同。
由表5可知珍珠岩+泥炭土+蛭石(1：1：1)为移栽最佳处理，珍珠岩+泥炭土+蛭石(1：1：1)上移栽苗30d成活率平均达到74.58％，显著高于其他各组。株高与泥炭土+蛭石(1：1)处理相差较小，显著高于珍珠岩+蛭石(1∶1)和珍珠岩+泥炭土(1∶1)处理，叶片数也显著高于其他各组。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.一种欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体取材：早春3-4月，选取健壮，无病虫害的母株，切取幼嫩的一年生具腋芽茎段作为外植体；
（2）消毒灭菌：将茎段用流水冲洗30-60min，然后洗涤剂浸泡15-20min，再用流水冲洗20-30min；随后，将材料转至超净工作台用75%酒精灭菌25-35s，然后用3-5%次氯酸钠灭菌10min-15min，最后无菌水冲洗3~4次作为接种材料；
（3）启动培养：将消毒灭菌后的茎段切分为含有1-2个节的小茎段，将其接种于启动培养基培养；启动培养的培养基为WPM+BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖 30.0 g/L+琼脂6.5 g/L，pH=5.8；
（4）增殖培养：初代培养50d后，切取外植体上茎长≥1cm的健壮腋芽进行增殖培养；增殖培养的培养基为：特制培养基+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA +30 g/L蔗糖+6.8 g/L琼脂，pH 5.8；特制培养基大量元素配方为K2SO4 495.00 mg·L-1、NH4NO3 1200.00 mg·L-1、MgSO4·7H2O 529.10 mg·L-1、KH2PO4 362.27 mg·L-1与Ca(NO3)2·4H2O 1279.92 mg· L-1，其余成分与WPM培养基一致；
（5）生根培养：增殖培养50d后，切取无根试管苗接入生根培养基；生根培养的培养基为：特制培养基+0.5 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.8 g/L琼脂，pH 5.8；特制培养基大量元素配方为NH4NO3 412.5 mg·L-1、KNO3 935.75 mg·L-1、CaCl2·2H2O 173.14mg·L-1、MgSO4·7H2O 92.5 mg·L-1、KH2PO4 42.5 mg·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致；
（6）炼苗移栽：将生根的欧洲冬青‘Ferox Argentea’试管苗开盖炼苗3天后，移栽入混合基质，混合基质的体积比为泥炭:蛭石:珍珠岩=1:1:1；浇水定根，培养。
2.根据权利要求1所述的一种欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁方法，其特征在于，步骤（3）启动培养的培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度32.4 mol·m-2·s-1，光周期14h光照/10h黑暗。
3.根据权利要求1所述的一种欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁方法，其特征在于，步骤（4）增殖培养的培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度32.4 mol·m-2·s-1，光周期14h光照/10h黑暗。
4.根据权利要求1所述的一种欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁方法，其特征在于，步骤（5）生根培养的培养条件为：培养温度25±1℃，光照强度32.4 mol·m-2·s-1，光周期14h光照/10h黑暗。
5.根据权利要求1所述的一种欧洲冬青‘Ferox Argentea’离体快繁方法，其特征在于，炼苗移栽的培养温度25±1℃，光照强度32.4 mol·m-2·s-1，光周期14h光照/10h黑暗。
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