CN102845308B - 一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法，该方法通过合理调配培养基中两种激素的比例和剂量，同时加入活性炭等辅料，使得铁皮石斛种子直接发育成幼苗，将幼苗转接到壮苗培养基之后，成活率达99.5%以上。本发明可将铁皮石斛组织培养的成苗时间缩短2个月，显著提高培养效率，降低经济成本，可作为铁皮石斛组培苗生产的重要方法。

Description

一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法
技术领域
本发明涉及铁皮石斛的组培技术领域，尤其涉及一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法。
背景技术
铁皮石斛，被誉为“中华九大仙草之首”，为兰科多年生草本植物。生于山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐高温、干燥，不耐寒。铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名，具有益胃生津，滋阴清热等药用价值。
铁皮石斛种子微小，自然萌发率和繁殖率低，生产上的种苗均来自组织培养。目前，铁皮石斛的组培育苗主要通过原球茎诱导、幼苗分化与壮苗培养3个阶段来实现，培养时间较长、成本较高。因此，如何缩短培养时间、提高培养效率、降低培养成本已成为促进铁皮石斛产业加速发展的当务之急。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法，包括以下步骤：
（1）制备成苗培养基：以B5为基础培养基，每升B5培养基中添加0.1mg的6-苄氨基嘌呤、0.3mg的α-萘乙酸、2.0g的活性炭、3.5g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6.0，得成苗培养基；均匀地将成苗培养基分装于培养容器中，边分装边搅拌，避免活性炭沉底，分装完毕后加盖；培养容器加盖后，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：121℃下灭菌20分钟，灭菌后取出培养容器，冷却后备用；
（2）铁皮石斛果实灭菌：将铁皮石斛果实放入水中清洗干净；在无菌条件下，将铁皮石斛果实在体积百分比浓度为75%的乙醇溶液中浸泡1分钟，取出用无菌水清洗若干遍，放入体积百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液灭菌10分钟，再用无菌水清洗若干遍，吸干水分后放入无菌培养皿中备用；
（3）接种：解开铁皮石斛果实的果皮，把种子均匀地洒在成苗培养基表面，盖紧盖子；
（4）培养：将完成接种的培养容器移入培养室，培养条件为：温度25℃，光照时间每天12小时，光照强度l500～2000lx，培养时间约为3个月，得到0.5-1.0 cm的幼苗； 
（5）转接：首先配置壮苗培养基：每升B5培养基中添加0.5mg 的6-苄氨基嘌呤、1.0mg的α-萘乙酸、3.0g的活性炭、3.0g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6.0，得状苗培养基；然后将幼苗转接至壮苗培养基，继续培养，直至苗高5-6cm时，移栽至大棚。
本发明的有益效果是：本发明通过合理掌控两种激素用量及相互间的配比，以及其他辅料的添加，促进铁皮石斛种子一步成苗，而不必经过原球茎阶段，缩短培养时间2个月左右，降低了经济成本。转接结果也表明，一步成苗培养成的组培苗长势旺盛，符合生产所需，可作为铁皮石斛生产种苗的重要来源。
具体实施方式
本发明铁皮石斛组织培养一步成苗的方法，包括以下步骤：
1.成苗培养基准备
（1）配制：以B5为基础培养基，每升B5培养基中添加0.1mg 的6-苄氨基嘌呤、0.3mg的α-萘乙酸、2.0g的活性炭，3.5g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6.0，得成苗培养基。
（2）分装：均匀地将培养基分装于培养容器中，边分装边搅拌，避免活性炭沉底，分装完毕，加盖。
（3）灭菌：培养容器加盖后，及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：121℃下灭菌20分钟，灭菌后及时取出培养容器，冷却后备用。
2.外植体灭菌
先清洗：将外植体铁皮石斛果实放入清水中，加少许洗洁精，清洗果实表面，后用流水冲洗干净。
灭菌：事先将镊子和烧杯灭菌，在无菌条件下，用镊子将果实在体积百分比浓度为75 %的乙醇溶液中浸泡1 分钟，取出用无菌水清洗2遍，放入体积百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液灭菌10 分钟，再用无菌水清洗6遍，吸干水分，放入无菌培养皿中备用。
3.接种
用无菌解剖刀解开铁皮石斛果实的果皮，把种子均匀地洒在培养基表面，立刻盖紧盖子。
4.培养
将完成接种的培养容器移入培养室，培养条件为：温度25℃，光照时间每天12小时，光照强度l500～2000lx，培养时间约为3个月，得到0.5-1.0 cm的幼苗；培养期间要勤检查，发现污染及时移除。
5.转接
配置壮苗培养基：每升B5培养基中添加0.5mg 的6-苄氨基嘌呤、1.0mg的α-萘乙酸、3.0g的活性炭、3.0g的琼脂和30g的蔗糖。加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6.0，得状苗培养基。
将高0.5-1.0 cm的幼苗转接至壮苗培养基，继续培养，直至苗高5-6 cm时，移栽至大棚。

Claims (1)

1.一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备成苗培养基：以B5为基础培养基，每升B5培养基中添加0.1mg的6-苄氨基嘌呤、0.3mg的α-萘乙酸、2.0g的活性炭、3.5g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6.0，得成苗培养基；均匀地将成苗培养基分装于培养容器中，边分装边搅拌，避免活性炭沉底，分装完毕后加盖；培养容器加盖后，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：121℃下灭菌20分钟，灭菌后取出培养容器，冷却后备用；
（2）铁皮石斛果实灭菌：将铁皮石斛果实放入水中清洗干净；在无菌条件下，将铁皮石斛果实在体积百分比浓度为75%的乙醇溶液中浸泡1分钟，取出用无菌水清洗若干遍，放入体积百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液灭菌10分钟，再用无菌水清洗若干遍，吸干水分后放入无菌培养皿中备用；
（3）接种：解开铁皮石斛果实的果皮，把种子均匀地洒在成苗培养基表面，盖紧盖子；
（4）培养：将完成接种的培养容器移入培养室，培养条件为：温度25℃，光照时间每天12小时，光照强度l500～2000lx，培养时间约为3个月，得到0.5-1.0 cm的幼苗； 
（5）转接：首先配置壮苗培养基：每升B5培养基中添加0.5mg 的6-苄氨基嘌呤、1.0mg的α-萘乙酸、3.0g的活性炭、3.0g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6.0，得壮苗培养基；然后将幼苗转接至壮苗培养基，继续培养，直至苗高5-6cm时，移栽至大棚。
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